专利名称：一种1型鸭病毒性肝炎rt-lamp检测试剂盒及其检测方法
技术领域：
本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种1型鸭病毒性肝炎RT-LAMP检测试剂盒及其检测方法。
背景技术：
鸭病毒性肝炎(Duck Viral !fepatitiS，DHV)是一种传播迅速、高度致死性雏鸭的病毒病由三种不同内型的病毒引起，分别是1型、2型和3型鸭肝炎病毒，其中，1型鸭肝炎流行最广，我国主要的流行株也是1型鸭肝炎。该病毒主要侵害1周龄内的雏鸭，主要病理变化是肝脏肿大，出血等，发病率高，病死率高，耐过鸭多成僵鸭，生长迟缓，造成极大的经济损失，是目前危害禽类养殖业的主要传染病之一。目前，已有多种检测1型鸭肝炎抗原的方法，如病毒中和试验、免疫电镜和 Dot-ELISA，也有许多免疫血方法，如ELISA、单克隆抗体-PAP法等，但上述方法所需检测时间长、特异性和灵敏性低且必须配备专用设备，操作复杂，常有非特异性出现，不利于快速、 准确诊断，因而未得到广泛推广和应用。近年来，由Notomi T等开发的一种简单、迅速、特异的核酸扩增方法环介导等温扩增技术(Loop-mediated isothermal amplification, LAMP)，被广泛的应用于多种病毒性疾病和细菌性疾病的诊断中(Notomi, T.，Okayama, H.，Masubuchi, H.，et al. Nucleic Acids Res. 2000 (28), e63； K. Nagamine, Τ. Hase, Τ. Notomi. Molecular and Cellular Probes . 2002(16) :223-229).该技术使用4条不同引物识别6个不同区域的靶基因，应用链置换扩增反应在恒温条件下完成扩增；具有很高的扩增效率，在15到60min内可将DNA扩大IO9-IOw倍；不需要特殊试剂和精密设备。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种快速、特异性和灵敏性高的1型鸭病毒性肝炎检测试剂盒和检测方法。为此，本发明公开了一种1型鸭病毒性肝炎RT-LAMP检测试剂盒，其含有荧光染料、10 X反应缓冲液、DNA聚合酶、dNTP、AMV逆转录酶、Mg2+、TritonX-100和引物，其特征在于所述引物为2对引物F3和B3 ；FIP和BIP ；LF和LB，其中所述F3的核酸序列如SEQ ID NO. 1所示，所述B3的核酸序列如SEQ ID N0. 2所示，所述FIP的核酸序列如SEQ ID N0. 3所示，所述BIP的核酸序列如SEQ ID N0. 4所示。在一些实施例中，所述1型鸭病毒性肝炎RT-LAMP检测试剂盒还含有甜菜碱 (Betaine solution, 5M)和 RNase 酶抑制剂。所述荧光染料为能与双链/ 似结合产生荧光的染料，可为溴化乙锭、STOR Green I 荧光染料或Hoechst 33258，最优选为STOR Green I荧光染料。另一方面，本发明还公开了一种1型鸭病毒性肝炎的检测方法，包括下列步骤 a) 取禽类的体液或组织液，抽提RNA，并以此为模板；b)利用2对引物F3和B3、FIP和BIP进行LAMP反应，其中所述F3的核酸序列如SEQ ID NO. 1所示，所述B3的核酸序列如SEQ ID NO. 2所示，所述FIP的核酸序列如 SEQ ID NO. 3所示，所述BIP的核酸序列如SEQ ID NO. 4所示，反应条件为63°C 40-60 分钟，80°C灭活；
c)检测RT-LAMP反应产物。在一些实施例中，所述禽类为鸭。在一实施例中，步骤b中所述反应条件为63V 45分钟，80°C灭活；
在一些实施例中，步骤c中所述检测RT-LAMP反应产物的方法为琼脂糖凝胶电泳法、荧光显色法或分光光度计法。所述荧光显色法为STOR Green I荧光显色法。与现有技术相比，本发明具有如下的优点
1) 4条引物对序列的8个特异区域进行识别，扩增反应只有在4条引物完全识别靶序列的情况下才能进行，在很大程度上减少了扩增反应的背景，保证了 RT-LAMP扩增的高度特异性。2)对硬件设备基本无要求，在普通的生物学实验室就可完成检测工作，减少了污染的机会并方便了实验过程中的质控工作。3)检测时间可以缩短到40分钟，最低可以检测到15pg RNA，提高了灵敏度。4)可视化鉴定，向反应产物中加入荧光染料，如果有扩增，荧光染料就会和DNA结合，通过肉眼即可观察反应液呈现明亮的橙黄色，如反应液没有橙黄色，则说明呈阴性反应。本发明所述检测试剂盒及其检测方法具有快速、敏感、特异、成本低和操作简单的特点，能较好的弥补当前鸭病毒性肝炎检测方法上的不足，可以满足当前该病的检测需求， 易于大范围推广应用，可减少该病在鸭等动物中的流行，具有广阔的市场前景和较大的经济效益。
图1本发明设计的RT-LAMP引物对不同病毒、细菌RT-LAMP扩增结果； 图2反应产物荧光染料显色示意图3 RT-LAMP反应产物进行BamH I酶切结果； 图4不同作用时间对RT-LAMP检测1型鸭肝炎病毒的影响； 图5 RT-LAMP敏感性实验结果； 图6 RT-PCR敏感性实验结果。
具体实施例方式以下结合具体实施例，进一步阐述本发明。这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。实施例1 1型鸭病毒性肝炎RT-LAMP检测
按下列组成配制鸭病毒性肝炎RT-LAMP检测反应液(1)反应液a含有iox反应缓冲液、feidna聚合酶、dntp (2. 5mm each)、betaine solution (5m)、amv、rnase inhibitor、。. l%tritonx_100，mg2+、2 对引物其序列为
f3 3' gctatgacatcaaccaatgt 5' (seq id no. 1)
b3 :3’ tctatctccataggggctag 5’ (seq id no. 2)
fip 3' tagttttgagatatcgcgcacctc—tgtcgttagttatggggatga 5’ (seq id no. 3)
bip :3’ tcgcactatttcaagcttttctttg—gttatgtcactttctttgtcactag5’ (seq id no. 4)
(2)反应液b :10000x sybr green i
反应液a每管23pl体系组成为
权利要求
1.一种1型鸭病毒性肝炎RT-LAMP检测试剂盒，其含有荧光染料、10 X反应缓冲液、 DNA聚合酶、dNTP、AMV逆转录酶、Mg2+、TritonX-IOO和引物，其特征在于所述引物为2对引物F3和B3、FIP和BIP，其中所述F3的核酸序列如SEQ ID NO. 1所示，所述B3的核酸序列如SEQ ID NO. 2所示，所述FIP的核酸序列如SEQ ID NO. 3所示，所述BIP的核酸序列如SEQ ID NO. 4所示。
2.根据权利要求1所述的1型鸭病毒性肝炎RT-LAMP检测试剂盒，其特征在于其还含有甜菜碱和RNase酶抑制剂。
3.根据权利要求2所述的鸭1型鸭病毒性肝炎RT-LAMP检测试剂盒，其特征在于所述荧光染料为能与双链ft紛结合产生荧光的染料。
4.根据权利要求3所述的1型鸭病毒性肝炎RT-LAMP检测试剂盒，其特征在于所述荧光染料为溴化乙锭、STOR Green I荧光染料或Hoechst 33258中之一。
5.根据权利要求3所述的1型鸭病毒性肝炎RT-LAMP检测试剂盒，其特征在于所述荧光染料为STOR Green I荧光染料。
6.一种1型鸭病毒性肝炎RT-LAMP的检测方法，包括下列步骤取禽类的体液或组织液抽提RNA，并以此为模板；利用2对引物F3和B3 ；FIP和BIP进行LAMP反应，其中所述F3的核酸序列如SEQ ID NO. 1所示，所述B3的核酸序列如SEQ ID N0. 2所示，所述FIP的核酸序列如SEQ ID N0. 3所示，所述BIP的核酸序列如SEQ ID N0. 4所示，反应条件63°C 40-60分钟，80°C 5-10分钟灭活；检测RT-LAMP反应产物。
7.根据权利要求6所述的检测方法，其特征在于所述禽类为鸭。
8.根据权利要求6所述的检测方法，其特征在于步骤b中所述反应条件为63°C40-60 分钟，80 0C 5-10分钟灭活。
9.根据权利要求6所述的检测方法，其特征在于步骤c中所述检测RT-LAMP反应产物的方法为m琼脂糖凝胶电泳法、荧光显色法或分光光度计法。
10.根据权利要求9所述的检测方法，其特征在于所述荧光显色法为STORGreen I荧光显色法。
全文摘要
本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种1型鸭病毒性肝炎RT-LAMP检测试剂盒及其检测方法。本发明公开了1型鸭病毒性肝炎RT-LAMP检测试剂盒，其特征在于其包含2对引物，它们的核酸序列如SEQIDNO.1-4所示。本发明所述检测试剂盒及其检测方法具有快速、敏感、特异、成本低和操作简单的特点，能较好的弥补当前鸭病毒性肝炎检测方法上的不足，可以满足当前该病的检测需求，易于大范围推广应用，可减少该病在鸭等动物中的流行，具有广阔的市场前景和较大的经济效益。
文档编号C12Q1/70GK102453771SQ201110256049
公开日2012年5月16日 申请日期2011年9月1日 优先权日2011年9月1日
发明者丁铲, 于圣青, 仇旭升, 宋翠萍, 胡青海, 谭磊, 韩先干 申请人:中国农业科学院上海兽医研究所