生长素输出载体pin1家族基因在玉米、高粱育种中的应用的制作方法

专利名称：生长素输出载体pin1家族基因在玉米、高粱育种中的应用的制作方法
技术领域：
本发明属农作物的生物工程育种领域，具体说，涉及一种通过构建融合基因及转基因改变玉米和高粱性状的方案及应用，尤其涉及一种生长素输出载体pmi家族基因在玉米、高粱育种中的应用。
背景技术：
植物基因工程的发展依赖于具有不同功能基因的应用。生长素在植物幼嫩部分或分裂旺盛的组织中合成，通过其特有的运输方式到达作用部位，生长素在植物生长发育中起重要作用，通过调节生长素合成、转运、代谢及相关的信号转导基因的表达有可能对植物生长发育产生重要影响，这些与生长素作用有关的基因有一些可能是植物基因工程操作的理想靶标。生长素在植物组织内的差异分布影响多个发育过程，不同环境信号和内源信号能够通过生长素的局部合成和细胞间转运影响生长素在体内的浓度梯度。IAA是多数植物中生长素的主要形式。在不少系统中低浓度生长素促进细胞伸长与分裂，而高浓度生长素则抑制细胞的分裂与伸长。1989年^chs在观察到生长素对维管组织形成的诱导效应后提出了生长素信号流造管假说。该学说认为随着生长素水平的提高会逐渐使生长素的运输能力也得到提高并最终导致维管束分化。突变体monopteros和Iopl的生长素转运能力发生改变，形成不正常的维管束，叶脉发育异常。Koizumi等Q000)通过对7个改变了维管束模式的突变体vanl-van7进行研究，进一步明确了生长素在维管束分化中具有重要作用。生长素具有明显的促进不定根和侧根发生及生长作用，参与根毛发育、初生根生长、侧根原基形成和根的向重力性反应。生长素和细胞分裂素的相互作用调控胚根形成和侧根发生的决定。生长素信号促进了细胞分裂素抑制蛋白的表达，而细胞分裂素诱导了生长素信号抑制蛋白。生长素在细胞间活跃转运创建局部最大浓度，从而调控许多发育事件的起始和进程。 转运方向由生长素输出载体PIN蛋白控制。植物向性主要是生长运动，即由于细胞数目的增加或每个细胞体积的增大、或两种机制同时发生作用而造成的植株部分的伸长、弯曲等变形。依外界因素不同，向性运动主要包括向光性、向重力性、向触性、向化性和向水性，目前已证明生长素与植物向光性和向地性运动密切相关。Cholodny (1927年)和Went (19 年)各自发现在单侧蓝光的作用下燕麦胚芽鞘中的IAA向背光侧移动。基于这一实验，Went和Thimarm等(1937)提出光能够刺激生长素从植物胚芽鞘顶端向背光侧侧向运输，使背光侧的生长素浓度高于向光侧， 继而使得背光侧的生长快于向光侧，引起向光性弯曲。后来，Leopold等(197 用1 标记 IAA试验证明，光能够刺激IAA从玉米胚芽鞘的向光侧向背光侧运输。向重力性是植物在重力影响下保持一定方向生长的特性。Rashottc等Q000)发现根的向重性弯曲也要求生长素沿根尖的向基运输，在抑制剂浓度不显著影响根生长的情况下阻断生长素的向基运输降低了根的向下弯曲的能力。分子检测表明，受重力刺激后植物生长素响应基因在根尖两侧差异表达，与弯曲外侧相比，弯曲内侧的该类基因的表达高。生长素可能是通过多重的生物学效应来调节植物向重力性弯曲，如相关基因表达差异、细胞的极化、细胞壁的酸化、细胞骨架结构改变等。在植物根尖生长点中，生长素的极性运输和局部合成促成了在静止中心(即干细胞组织中心)部位形成所谓“生长素积累高峰”，对于静止中心的建立和维持起至关重要的作用。在生长素信号通路中控制根尖干细胞活跃状态的关键分子元件是PLT蛋白(干细胞转录因子)。生长素作用的反馈调节对于植物体的生长素运输和差异分布有重要意义。而生长素差异分布是相应的发育过程启动所必需的。如侧根器官发生显示了生长素最大浓度与发育编程调整和器官起始在时空上具有对应关系，遗传或药物干扰生长素的差异分布和响应过程阻碍了生长素梯度存在时出现的发育事件。另外，生长素差异分布似乎足以启动发育过程。生长素微量应用到茎尖分生组织的精巧试验表明局部增加生长素浓度足以启动和完成叶或花的发育(Reinhardt et al.，2003)。生长素在给定细胞积累能修饰它的发育程序，即生长素积累的时间和位置决定了发育程序改编的时间和位置。在中柱鞘细胞中随机刺激引起细胞生长素合成的增加，提高了局部生长素浓度，引起这些感受态细胞起始侧根形成(Dubrovsky et al. ,2008) 组织内的生长素浓度梯度包括生长素在细胞内和细胞间的不均勻分布。细胞的生长素浓度可在合成、钝化、活化、分解和细胞间的极性转运多个层面上调节。并且这些不同层面的调节在不同物种、不同发育时期均起重要作用。植物中存在两种不同的生长素运输途径韧皮部运输和皮层中载体介导的极性运输。在韧皮部运输系统中，生长素的运输与其它营养物质的运输没有根本区别；而极性运输则是生长素所特有的一类从细胞到细胞的主动运输，依赖于膜定位的载体和能量消耗，运输速度也比维管系统运输速度较慢，一般为5-20mm/h。极性运输使生长素在植株体内形成以器官顶端为中心的浓度梯度，并维持不同组织中的生长素浓度差，实现植物发育的调控。 且生长素信号和生长素极性转运之间存在着正反馈调节。介导生长素极性运输的蛋白有 AUXl/LAX家族、PIN-formed家族、ABCB家族蛋白等。生长素进入细胞可通过被动扩散和质膜上极性分布的生长素输入载体(auxin influx carrier)介导这2种方式完成。由输入载体(AUX1/LAX家族)介导的生长素流入细胞可以使生长素逆浓度梯度运输，也可以防止生长素被动扩散入邻近细胞中，从而保证了不同细胞和组织中生长素浓度与分布适宜。生长素输出载体(auxin efflux carrier) 是一种复合物，由调节亚基-NPA结合蛋白和催化亚基-PIN(Pin-f0rmed)蛋白两成分组成。 生长素在植物组织中的极性运输很大程度上归功于高度调控、极性定位的输出载体PIN蛋白。拟南芥中PIN蛋白家族有8个成员，PIN1、PIN2、PIN3、PIN4和PIN7的功能已有较多的研究，而有关PIN5、PIN6和PIN8的作用报道较少(Kramer，2004)。PIN蛋白家族是膜内在蛋白，有2个疏水区，每个疏水区有5个跨膜螺旋。2个疏水区之间是亲水环，在亲水环的第二个可变区和羧基端疏水区之间有一个保守的内在构型IM0内在构型IM在网格蛋白依赖的内吞作用中、跨膜蛋白与接头蛋白相互作用中起重要作用。亲水环中有两组模体(motif) 对PINs翻译后修饰有重要作用，每组模体都有一个保守的糖基化位点和两个保守的磷酸化位点。亲水环的这种结构对调节PINs蛋白的功能及其正确定位有重要作用。生长素在植物组织中的极性运输很大程度上归功于高度调控、极性定位的输出载体PIN蛋白。虽然PINl、PIN2、PIN3、PIN4和PIN7都具有生长素输出载体的功能，但它们在植物多种生理过程中也有不同的作用。Pinl突变体中，生长素在花序轴的向基式运输减弱，并使维管发育缺陷，形成著名的“PIN-like”表型(Galweiler et al 1998 ；Luschnig et all998)。Pim蛋白含有622个氨基酸，推测具有12个跨膜区域，与原核生物和真核生物的运输载体相类似。在活性细胞中PIN蛋白的极性定位是决定生长素流方向的主要因素。免疫定位技术显示，PINl主要位于薄壁细胞，也在根中柱外周细胞和叶原基中围绕初生叶脉分布，在从茎尖的向基部的运输和在根尖的向顶式运输中起关键作用。Muday等Q003)认为，小泡循环机制控制了生长素运输的极性，GNOM ARF-GEF介导了内体再循环、生长素运输和生长素依赖性生长。PIN蛋白的磷酸化状态对其定位有重要作用。PINOID(PID)编码一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，催化PIN蛋白的磷酸化(Huang et al，2010 ；Sukumar et al, 2009)。PID组成型过表达产生根向重力性和主根根尖中根分生组织器官缺失的缺陷，这些表型缺陷与PIN2、PIN4定位错误引起的根冠生长素最大含量下降有关。磷酸肌醇依赖蛋白激酶 l(phosphoinositide dependent proteinkinase 1，PDK1)磷酸化激活 PID，PDK1 的磷酸化作用对PINs正确定位非常重要(Zegzouti et al，2006)。蛋白质磷酸酶2A (protein phosphatase 2k, PP2A)也可调节PINs的极性定位，PP2A与PINs共同定位在质膜上，通过作用于PINs的磷酸化位点与PID的拮抗调控PINs的定位(Michniewicz et al，2006)。多种药物抗性糖蛋白(multidrug Resistance P. glycoproteins，MDR/PGPs)也在生长素的运输中起作用。从吲哚-3-乙酸竞争性抑制剂NPA高亲和力结合复合体中纯化得到了 PGP1、PGP2、PGP4、PGP10和PGP19，这些蛋白可能在生长素的流出复合体中起作用，并在PINs的活性调节中发挥功能(Noh et al,2001 ；Murphy et al，2002)。玉米中的 br2(branchytic2)和高梁中的dw3 (dwarf3)是AtPGPl的同源基因，突变后降低下胚轴和花序中的生长素极性运输，植株发生部分矮化(Multani et al，2003)。在atpgpl和atpgpl9 双突变中，矮化更加明显(Geisler et al，2003)。AtPGP4与AtPGPl在氨基酸水平上相似性为60%，在初生根和侧根发育中表达，在根的发育中起作用(Santelia et al,2005 ； Terasaka et al，2005)。其功能缺失降低了生长素向基运输，改变了向胞内的流入，促进根毛形成，降低了 NPA生长抑制作用。PIN和PGP蛋白共定位并彼此互作，但二者之间确切的功能关系尚不清楚，目前的证据表明PGP在稳定生长素的流出复合体和直接介导生长素流出两个方面起作用。拟南芥中PIN蛋白家族有8个成员。Wang等(2009)和Miyashita等(2010)分别对水稻中可能的PIN基因的序列进行了全基因组的筛查和拼接，得到了 12个可能的生长素流出载体，按照亲缘关系，属于AtPim家族的有4个(OsPmia、OsPINlb, OsPINlc, OsPINld)，属于 AtPIN5 家族的有 3 个(0sPIN5a、0sPIN5b、0sPIN5c)，属于 AtPIN2 和 AtPIN8 家族的各1个(0sPIN2和0sPIN8)，没有得到与AtPIN3、AtPIM、AtPIN6、AtPIN7同源的基因。另外三个PIN基因属于单独进化支，分别为0sPIN9、0sPIN10a、0sPmi0b。RT_PCR、GUS 染色和原位杂交分析均表明，OsPim与AtPim家族的关系更近，其在维管组织和根原基表达(Xu et al，2005)，在不定根和分蘖发生中起着重要的作用。OsPINla和OsPimb在所检测的器官中组成型表达，而OsPINlc在叶和幼嫩花序中低丰度表达。0sPIN2在茎、叶和幼嫩花序中表达量低于根和茎基部的。OsPI^b在幼嫩花序中表达量高于0sPIN5a。0sPIN9 在根和茎基部表达量较高。OsPmiOa在除根外所有组织中都高丰度表达而OsPmiOb仅在叶中表达量较高。玉米中存在13个可能的生长素流出载体。Carraro等Q006)克隆得出ZmPINla, ZmPINlb基因的DNA和cDNA序列并研究了玉米PINl家族基因在B73和barren inflorescence2(bif2)突变体的雌雄穗发育过程中的表达情况。依据序列相似性，ZmPINla 是水稻OsPmic的同源基因，OsPINla在玉米中的同源基因是ZmPINlb和ZmPINlc，OsPINlb 和OsPINld与玉米的ZmPINld相对应。半定量RT-PCR检测表明，在B73中ZmPINlb和ZmPINla在根、叶片和雄穗中的表达丰度没有明显差别，但在幼嫩雌穗(V8期)中检测不到ZmPINla的表达，而在雌穗发育过程中ZmPINla表达量升高(V12期)。在bif2突变体的根和种子萌发的小苗中，这两个基因表达丰度与野生型相比没有明显差别，但在叶片和雌雄穗中表达丰度高于B73的。原位杂交分析表明，ZmPim主要在玉米茎尖生长点的维管组织中表达，信号主要出现在分裂旺盛区，在侧原基中主要出现在幼叶的顶端。在分化的雄穗中，在形成侧生分生组织的维管束处表达。在雄穗的分支中，最初检测到的信号位于分支的中部，之后在小穗分生区呈对称型分布。在发育的雌穗中，在苞片原基的顶端、维管组织和花序分生组织的中央细胞中都检测到ZmPim的信号，但在外层细胞中没有表达。随着雌穗的发育，信号扩散到整个小穗的顶端，之后在小穗和形成的两个小花序轴中表达。2010年i^restan等研究了玉米Pim家族基因在B73和defective endosperm_B18 (de*_B18)籽粒发育过程中的表达模式。de*_B18 突变体是早期分离得到的一个胚乳缺陷型突变体，该突变体胚乳中游离和结合态的IAA水平低于野生型植株的。检测ZmPim家族基因的表达，发现在双受精之后它们都随着籽粒的发育进程而表达量升高，但各个成员的表达模式有所不同。ZmPINlc在发育早期(3d)的表达丰度是受精前的7倍，而ZmPINla则在发育的较后时期表达量增加。尽管有这些工作， 有关玉米生长素流入/出载体的分析目前还都局限于单个突变体或单个家族的研究，缺乏特定基因型中多个家族基因的表达分析和与根系发育的关系。bif2是M^teen课题组在 2001年鉴定出的花序分支突变体，该突变体表现为雄穗分支和小穗数目减少、雌穗数和籽粒数减少、腋生分生组织原基起始异常。2007年，他们通过转座子标签法克隆到bif2基因，发现其编码基因为拟南芥PINOID的同源基因。2009年，通过体外试验证明了 BARREN INFL0RESCENCE2 (BIF2)是通过磷酸化ZmPINla来调节ZmPINla的亚细胞定位起作用的。这与拟南芥中PINOID对PIN蛋白的作用一样，说明这一调节机制在单双子叶植物中是保守的 (Skirpan et al，2005)。我们的工作表明ZmPINla与水稻OsPmic的相似性最高。免疫定位技术显示，PINl蛋白主要位于薄壁细胞，也在根中柱外周细胞和叶原基中围绕初生叶脉分布，在生长素的茎尖向基部运输和根尖向顶运输中起到关键作用。影响Pim蛋白分布和极性定位导致植株生长发育异常。鉴于生长素在植物器官发生中的作用，而植物的抗逆境特性大部分与根系形态和生理特性直接相关，通过生长素浓度和极性分布的改良有望实现1)提高作物对肥料的利用率，节省生产成本并减少环境污染；2)提高根系对水分的利用率，增加干旱地区作物产量；3)提高作物抵抗盐渍化的能力，增加盐渍耕地中作物产量；幻创造高产、优质抗倒伏品种。本发明提供一种利用生长素输出载体Pmi家族基因改良玉米、高粱性状的应用方案及实例。

发明内容
针对目前的研究现状，本发明的目的是提供一个通过转Pim家族成员基因产生生长素浓度梯度发生变化从而引起根系构型和株高等性状发生改变的工程玉米和高粱。本发明所述的Pim家族成员基因包括从不同高等植物中克隆的与玉米中 ZmPINla, ZmPINlb, ZmPINlc和ZmPINld编码的多肽序列相近或相同的蛋白基因，也包括人工合成或由不同多聚脱氧核苷酸序列片段重组而成的核苷酸序列，即功能相近和相同的编码蛋白的基因。本发明中，用于构建融合基因的Pim的编码序列可为cDNA序列，也可以为基因组序列，也可是根据部分编码序列人工合成的脱氧多核苷酸链，以及它们派生的RNAi结构。其中，构建融合基因所用的启动子可为根特异性启动子，也可为叶、果穗、雄穗特异性启动子，以及非特异性启动子。本发明所说的融合基因由启动子序列和目标基因编码序列、植物基因的3'尾巴区构成。融合基因能在植物细胞中有效表达。在本发明中，将从玉米中克隆的ZmPmia、ZmPINlb和ZmPINlc的全长序列分别重组到中间质粒中与不同的启动子连接构建融合基因，然后将融合基因插入到植物表达载体中，采用转基因技术将重组基因导入植物细胞，获得转基因植株。其中，所述的ZmPmia、ZmPINlb和ZmPINlc的全长序列来自普通栽培玉米和玉蜀黍属的玉米近缘种或亚种，也可是人工合成的序列一致和相近DNA片段。在本发明中，通过转基因表达的检测和对转基因植株的性状进行分析，从中筛选出目标性状明显改变的转基因植株及其后代，创造在植物育种中有应用前景的新材料。本发明克隆出Pim家族成员基因可单一或联合重组到植物表达载体中，再将后者转入玉米、高粱骨干自交系，获得农艺性状发生改变的玉米。本发明产生的转ZmPINla玉米和ZmPINlb/c玉米可单独利用，也可将它们彼此杂交后获得兼有转基因ZmPINla和ZmPINlb/c玉米进行利用。Pim基因家族基因的鉴别和克隆通过全基因组的筛查和拼接，在拟南芥中鉴定出ι个Pim基因，即AtPim ；结合利用AtPim基因序列进行相似性比较，在水稻中鉴定出4个Pim基因，即ospmia、 OsPINlb、OsPINlc、OsPINld，其中 REHl(Arabidopsis ethylene insensitive root 1)即为OsPmia在不定根和分蘖发生中起着重要的作用，OsPINla和OsPmib在所检测的器官中呈组成型表达，而OsPINlc在叶和幼嫩花序中低丰度表达。以水稻的Pim基因的⑶S序列为探针筛查玉米非冗余序列数据库，得到ZmPmia、ZmPINlb的全长cDNA，序列比对发现它们分别与水稻的0sPmib、0sPmiC有较高相似性。编码产物长度分别为601和618个氨基酸，分子量为65. 19kDa和67. 33kDa，等电点为8. 90和9. 91。用AtPINl的CDS序列筛查玉米EST序列数据库，发现DV539656. 1序列与AtPim相似性较高，序列比对发现DV539656. 1 缺少完整5’端。以DV539656. 1为种子序列筛查玉米EST序列数据库得到重叠群，用拼接软件kqsMan拼接后得到两个contig，其中一个为ZrnPimb，另一个与ZmPINlb有较高相似性，含有完整的0RF，编码583氨基酸的肽链，与水稻的OsPINlc有较高的相似性，命名为 ZmPINlc。后者编码蛋白的分子量为63. 2kDa，等电点7. 76。用水稻OsPINld的CDS序列筛查玉米高通量测序数据库发现，玉米4号染色体CH201-433F16中有与OsPINld相似性较高的片段，将此序列用内含子外显子预测软件GENSCAN预测，得到与OsPINld相似性较高的 ZmPmid，后者编码580个氨基酸的肽链，分子量为61. 05kDa，等电点9. 18。
氨基酸序列比对发现，玉米中的4个Pim-Iike蛋白与拟南芥和水稻中的对应蛋白有相似的氨基酸序列，具有保守的跨膜氨基酸转运和跨膜生长素转运结构域。ZmPINlb 编码产物为618个氨基酸，且它与ZmPINla和ZmPINlc的差别主要在于在第548位氨基酸之后的一段序列，比ZmPINla多出18个氨基酸，比ZmPINlc多出37个氨基酸。ZmPINlb和 ZmPINlc对应于玉米基因组上同一段序列，推测它们来自同一 mRNA前体可变剪接的产物。 玉米 ZmPINlb 和 ZmPINlc 与 OsPINla 相似性高，玉米 ZmPINld 与 OsPINlb 和 OsPINld 亲缘关系相近，而玉米ZmPINla是OsPmic的同源基因。蛋白的二、三级结构分析发现玉米生长素流出载体与拟南芥、水稻的生长素流出载体有相似的跨膜蛋白结构和外显子排列方式。ZmPINlb和ZmPINla在玉米根、叶片和雄穗中的表达丰度没有明显差别，但在幼嫩雌穗 (V8期)中检测不到ZmPINla的表达，而在雌穗发育过程中ZmPINla表达量升高(V12期)。 ZmPINl主要在玉米茎尖生长点的维管组织中表达，信号主要出现在分裂旺盛区，在侧原基中主要出现在幼叶的顶端。在分化的雄穗中，在形成侧生分生组织的维管束处表达。在发育的雌穗中，在苞片原基的顶端、维管组织和花序分生组织的中央细胞中都检测到ZmPim 的信号，但在外层细胞中没有表达。随着雌穗的发育，信号扩散到整个小穗的顶端，之后在小穗和形成的两个小花序轴中表达。检测ZmPim家族基因的表达，发现在双受精之后它们都随着籽粒的发育进程而表达量升高，但各个成员的表达模式有所不同。ZmPINlc发育早期 (3d)的表达丰度是受精前的7倍，而ZmPINla则在发育的较后时期表达量增加。除上述基因外，已鉴别出的生长素流出载体PINl-Iike基因在NCBI中还有 ChPINl, ACH91863.1 ；CsPINl, BAC41319.1 ；GhPINl, AAN71616.1 ；H1PIN1, ABS17596.1 ； LaPINl，CAJ84441.1 ；McPINl，AAQ14257.1 ；MtPINl，AAM55300.1 ；PsPINl，AA038045.1 ； PtPINl, XP_002317874. 1 ；SbPINl, XP_002436761. 1 ；S1PIN1, ADR30406. 1 ；TsPINla, AAS19858. 1 ；ZvPINl, AH47607. 1。将这些基因转入玉米和高粱获得根系性状等发生变化的转基因材料并用于育种已属于本专利内容。PINl基因植物表达载体的构建以玉米ZmPim基因为例简述Pim基因植物表达载体的构建过程。根据生物信息学预测得到的核苷酸序列设计PCR引物，经PCR扩增得到了玉米基因组中4个PINl-Iike 生长素流出载体基因。采用常规的分子克隆技术克隆出玉米ZmPmia、ZmPINlb和ZmPINlc 的cDNA全序列。ZmPINla位于玉米B73染色体9上，cDNA长1806bp (DQ836239. 1)，编码 601个氨基酸的肽链(ABH09242)。ZmPINlb和ZmPINlc位于玉米B73染色体4上的同一位置，cDNA分别长1788bp (DQ836240)和1968bp (EU570251)，分别编码595个氨基酸的肽链 (ABH09243)和597个氨基酸的肽链(ACB55418)。首先将Pim基因以正义形式、或反义形式、或RNAi结构形式与选用的启动子和转录终止区片段相连，构建出融合基因，然后重组到植物表达载体中。可根据受体植物和所需基因的表达强度及可调控程度，融合基因中可加入分别适合于单、双子叶植物或其它植物的增强子或抑制子或对特点信号发生反应的序列(顺式作用元件)。融合基因的;T端可选用不同基因的3'尾巴区，也可插入增强子序列。在融合基因中，也可在编码区插入不同内含子。含有目标基因的植物表达载体可在大肠杆菌和农杆菌中增殖或/和保存。用含有融合基因的植物表达载体转化玉米和高粱根据受体材料的特点选用不同的转基因方法获得转基因植物。
常用的转化方法有3类1)直接转化法，即提取重组质粒DNA，采用基因枪轰击法、 聚乙二醇诱导法、电融合法、硅碳纤维法等将质粒DNA或融合基因导入细胞。2)农杆菌介导的遗传化方法。幻种系转化法，包括花粉管通道法、子房注射法等。此外，还有将不同类方法组合使用的转化程序，如将基因枪轰击法和农杆菌感染相结合使用以提高转化效率。以下以玉米自交系为材料、采用农杆菌介导法转化玉米无菌苗茎尖为例阐述该过程。玉米(Zea mays L.)优良自交系的种子，用70 %乙醇浸泡3分钟，再用1%。氯化高汞浸泡8-10分钟，然后用无菌水洗涤3-5遍。灭菌期间不断摇晃种子，以保证表面灭菌彻底。灭菌后种子放在无菌罐头瓶内萌发，瓶内放入少量无菌水(30-40毫升/250毫升罐头瓶)，封口后放在黑暗条件下2-3天。待种子萌动长出胚根及胚芽后，将其放在玉米萌发培养基上于黑暗条件下萌发。待胚芽伸长至3-5厘米时，用解剖刀剥去胚芽鞘及 1-2片幼叶，暴露出芽尖，再用解剖刀从中部纵向切伤芽尖。切伤芽尖的无菌苗用于农杆菌感染。将带有目的质粒的根癌农杆菌LBA4404在附加抗生素的YEP培养基中下震荡培养，震荡速率为170rpm，使细菌处于对数生长期。然后在3000rpm下离心5分钟，弃上清夜。再将菌体用添加ΙΟΟμπιοΙ/l乙酰丁香酮(acet0Syring0ne，AQ的悬浮培养基重悬。 然后将菌液倒在直径15厘米的培养皿中，倾斜培养皿，使已被切伤的无菌苗顶端浸泡在菌液中，抽真空(0. 05MPa)感染10 15分钟。浸染后的芽尖用无菌滤纸吸干，将根部插入玉米萌发培养基上黑暗中培养3天。 培养温度为22 M°C。将共培养后的无菌苗移栽到上层蛭石下层土壤的花盆中，并用松散湿润的蛭石覆盖植株顶部。然后让植株在自然光照下生长，日温22 28V，夜温15 21 °C。移栽到蛭石中的转化植株长到3叶期，均勻喷洒合适浓度的除草剂水溶液进行筛选。喷洒以植株叶片掉液滴为宜。喷洒后对照植株10天以后见效，15天后死亡率在95% 左右，转化植株在喷洒除草剂水溶液后，一些个体变化同对照植株相似，另一些个体则持续生长，变化不明显。待存活植株长到5-6叶时移栽到田间，套袋自交或姊妹交结籽。转化植株的筛选和初步检查转化植株产生的种子播在塑料盘中，出苗(Tl植株)后3 4叶期用对非转化植株致死的除草剂水溶液喷洒，观察统计抗性和敏感性个体比例；采用PCR技术检测存活植株是否携带外源基因，并统计外源基因在子代植株中的分离比例。移栽存活植株到大田， 套袋自交产生T2代种子。T2植株除套袋自交结籽外，采用PCR技术检测外源基因并进行 Southern blotting验证，采用RT-PCR技术检查转基因表达强度。对于入选的转基因株系再次观察统计小苗对除草剂的抗性和敏感性个体比例，选出转基因纯合系进行植株性状的分析。转基因植株的性状检测及利用利用蛭石培养观察转基因植株根系构型和株型变化。将未转基因对照株系和不同转基因株系的种子播于大小一致、蛭石含量一致的无盖大箱中。3叶期定苗，隔天浇灌 1/2MS营养液。待植株长至6叶期时，洗去蛭石，轻轻分离玉米根系，再用自来水洗净后照相，利用根系扫描仪扫描分析，然后烘干并测定根系和地上部的生物量，计算根冠比。植株耐低磷特性检测采用水培和沙培法。
在水培法检测中，首先选取大小均勻的未转基因对照株系和不同转基因株系的种子，经70%酒精、0. 1 %升汞依次灭菌3分钟和8分钟，用无菌水洗涤3次后放入人工气候箱于下避光萌发。种子长出约1. 5cm幼根后转入足磷营养液(Ca(NO3)2 ·4Η20 2mM,NH4NO3 1. 25mM, KCl 0. ImM, K2SO4 0. 65mM, KH2PO4 ImM, MgSO4 0. 65mM, H3BO3IO. 0 μ Μ, (NH4)6Mo7O24 0. 5 μ M，MnSO4 1· 0 μ Μ，CuSO4 · 5Η20 0. 1 μ Μ, ZnSO4 · 7Η20 1· 0 μ Μ，Fe-EDTA 0. ImM, ρΗ = 6. 0士0. 1)中在25°C、70%相对湿度的温室中培养至4叶期，然后将小苗转入大小一致、营养液含量相等的蓝色盒子里生长。营养液分别为足磷营养液和低磷营养液(KH2PO4浓度变为5. 0 μ M营养液)，每3天更换一次成分不变的营养液。当植株出现明显的形态差异时，轻轻取出植株，测量株高和照相，收获时切下根系，用PowerlooklOOO根系扫描仪及软件对根系构成组分进行测量和计算。植株茎叶和根系分别烘干、称重，计算根冠比，比较不同供磷条件下根系形态和生物量的差异，确定植株的耐低磷特性。沙培实验中，未转基因对照株系和不同转基因株系的种子播在沙盆中，在适宜光温条件下生长。植株5 6叶期时分为2组，一组隔天浇灌足磷营养液，另一组隔天浇灌低磷营养液，观察植株长势和生长发育的差异，果穗成熟后收获地上部和地下部生物量并进行比较分析，对果穗进行考种分析，选出受低磷胁迫影响较小单株产量较高的株系并进行相关性状的进一步分析，选出耐低磷转基因株系。转基因植株耐旱性检测有多种方法供选。为了减少工作量和获得与大田试验相近的结果，本发明推荐在植株苗期和拔节期进行自然干旱鉴定的方法。玉米苗期干旱胁迫处理试验在人工气候室中生长，光照14h/d，光强110001X，相对湿度50-60%，温度32 °C (光(暗)。未转基因对照株系和不同转基因株系的种子播在土盘中，土层厚10厘米，3 4叶期时一次浇足水分，然后中止浇水，直到植株严重萎蔫，再恢复浇水，观察植株萎蔫所需时间和复水后的恢复时间及成活率。玉米拔节期干旱胁迫试验在自然条件下进行，但胁迫处理期间避免植株淋雨。种于花盆的玉米植株在正常浇水条件下长至10叶期，然后控制每天浇水量(约400ml)，使土壤中相对含水量保持在15-17%左右，持续处理16天，然后恢复正常浇水。在控水浇灌期间，植株在白天8 18时间叶片萎蔫，夜晚叶片恢复伸展。恢复正常浇水一周后植株开始抽雄。再将花盆分开放置，以使植株自交结实。收获成熟籽粒，进行产量和生物量测定。将植株控制浇水第1天(叶片在上午8时左右开始萎蔫)记为干旱胁迫处理第0天，分别在处理的第0、2、4、8、16天和恢复正常浇水后第7天取样，测定各项生理指标。并对雌雄穗发育状况，花粉活力，籽粒重等进行观测。转基因植株农艺性状的观察和利用价值的评估在以上工作的基础上，将入选的不同转基因株系和未转基因对照株系的种子在玉米适宜生长季节中播于大小一致、土壤含量相等的大花盆(D = 40cm)里，露天生长。3叶期定苗，每个株系设8次重复，隔2周施肥一次，浇足水分。植株抽雄后，在避风区内按行距 0. Sm、株距0. 75m间隔排列，力求实现单株自然授粉，以了解单株生产力。抽雄后统计雄穗分支数及长度、花药和吐丝颜色、吐丝时间。灌浆初期统计植株高度、叶片数、穗位高、雌穗个数。收获期统计单株果穗数、计算生育期。果穗干燥后测定穗长、穗行数、行粒数、穗轴粗、 百粒重。综合多方面的测试结果，选出优异的转基因植株套袋自交纯合，并进行配合力测定，入选的自交系或具有发达的根系且耐低磷耐旱特性明显优于未转基因自交系或具有特异性状，如植株下部节间变短、株高变矮、叶片变窄，选择配合力与供体自交系相同或有提高的转基因自交系用于玉米单交种选育。
具体实施例方式实施例1 转I^rsp: ZmPINla基因创造玉米耐旱耐低磷自交系及应用融合基因及植物表达载体的构建为了实现转基因ZmPINla在玉米根部特异性表达，需要将其与根特异表达的启动子连接，构建融合基因。大麦磷转运体1基因在根中特异性表达且受低磷胁迫诱导(Schiinmann 等，2004)，采用 PCR 方法将其启动子部分(GenBank accession number AFM3197中ATG密码子5，上游的84;3bp，非全长)从大麦基因组中扩增出，命名为I^rsp。 经测序验正后将该启动子重组到中间载体中。然后利用Hind III和)(bal I酶切位点将该启动子定向重组到带有草甘膦抗性基因EPSP为植物选择标记的植物表达载体中，得到质 SpCAMBIA-Prsp: :MCS-Tnos-P35S: :EPSP (pRPE)。该载体含有由 P35S 启动的 EPSP 基因，含有启动的目的基因插盒。构建好的植物表达载体pRPE用于ZmPINla基因植物表达载体的构建，即将ZmPINla分别以正义和反义形式插入到多克隆位点MCS，得到所需质粒。后者经酶切鉴定或测序鉴定后，采用液氮速冻法导入农杆菌LBA4404或其它菌株中，后者用于农杆菌介导的玉米遗传转化。玉米转化受体系统的建立以我国农业生产上所用的骨干自交系为材料，如DH4866、齐319等。取干净的自交种子灭菌后培养，取茎尖离体诱导产生丛生芽块，以丛生芽块为受体进行遗传转化。所用培养基有种子萌发培养基:KN031 9 00mg/l, NH4N03 1650mg/l, CaCl2 · 2 H2O 440mg/ 1，MgSO4 · 7H20 370mg/l, KH2PO4 · H2O 170mg/l, FeSO4 · 7H20 27. 8mg/l, ZnSO4 · 7H20 10mg/l, MnSO4 · 4H20 22. 3mg/l, H3BO3 10mg/l, KI 0. 83mg/l, Na2MoO4 · 2H20 0. 5mg/l, CuSO4 · 5H200. 025mg/l，CoCl2 · 6H20 0. 025mg/l，盐酸硫胺素 10. Omg/1，盐酸吡哆醇 1. Omg/ 1，烟酸1. Omg/1，甘氨酸2. Omg/1，肌醇100. Omg/1，生物素0. 05mg/l，酪蛋白水解物500mg/ 1，蔗糖3(^/1，琼脂粉78/1，？!15.8 6.0。用于种子萌发。液体培养基则去掉琼脂粉。A培养基种子萌发培养基附加6-BA4. 5 9. 0 μ mol/1和2，4-D1. 0 3. 0 μ mol/ 1，用于诱导离体培养芽尖产生丛生芽组织块和丛生芽组织块继代培养。B培养基种子萌发培养基附加6-BA4. 5 μ mol/1和IBA (吲哚丁酸)1. 8 μ mol/1, 用于丛生芽组织块分化小苗。成苗培养基种子萌发培养基附加6-BA2. 25 μ mol/1和IBA3. 6 μ mol/1，用于丛生小芽发育成小苗。生根培养基种子萌发培养基附加IBA2. 8 3. 6 μ mol/Ι，用于无根小苗生根。基本培养基及植物生长调节物质热压灭菌；抗生素和除草剂等活性成分过滤灭菌，在培养基灭菌后加入。操作过程为种子灭菌和萌发玉米种子用70%乙醇浸泡10分钟，再用0. 氯化汞浸泡10 15分钟，然后用无菌水洗涤3 5遍。灭菌后种子放在无菌三角瓶内萌发，瓶内放入少量 (30 40毫升/250毫升三角瓶)无菌水，封口后放在黑暗条件03 30°C )下1 2天。 萌动(露白)后种子放在基本培养基上于黑暗条件下继续萌发。茎尖培养和丛生芽组织块诱导、继代、分化萌发种子的胚芽伸长止3 5厘米时，剥离胚芽鞘及幼叶，切取长约5毫米左右的上胚轴及茎尖，接种到A培养基上于黑暗下
27°C)培养，并及时切去伸长的胚轴和剥去幼叶。培养6 10天后，茎尖开始不规则膨大生长，在膨大的分生组织上出现数个瘤状或指状突起。20天后，在瘤状或指状突起的表面开始形成不定芽及胚状体。一般每4周继代培养一次。在继代培养中，若丛生芽组织块丛生小芽偏多，2，4-D浓度取3. 0 μ mol/1 ；若丛生芽组织块愈伤组织化较重，虽有大量的分生细胞团，但表面很少出现不定芽，可将2，4-D浓度降为Ι.ΟμπιοΙ/l，继续培养则重新产生大量瘤状或指状突起。A培养基上的丛生芽组织块，少数有不定根的产生。与幼叶存在一样，不定根也影响组织块的膨大生长及胚状体和丛生小芽的产生，需要及早去掉。丛生芽组织块在转移到B培养基上2 3天后，色泽逐渐变黄，质地较柔韧，5 6天后表面出现微小突起。扫描电镜下观察可见各期胚状体及不定芽。胚状体及不定芽迅速发育，在组织块表面形成丛生小芽。将带有双元载体(Mini-Ti质粒为 pCAMBIA-Prsp :ZmPINla-Tnos-P35S: :EPSP, pCAMBIA-Prsp::ZmPINlb-Tnos-P35S::EPSP 或 pCAMBIA-Prsp::ZmPINlc-Tnos_P35S::EP SP)的根瘤农杆菌(如AGLO和LBA4404)在附加抗生素的LB培养基(每升培养基含胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g, pH7.0，热压灭菌)中下震荡培养，震荡速率为 IlOrpm(转/分)，使细菌处于对数生长期。然后在3000rpm下离心10分钟，弃上清液。菌体用1/2浓度的液体种子萌发培养基(即种子萌发培养基成分减半，去掉琼脂粉)洗涤，再离心收集。再将菌体用添加乙酰丁香酮(aCetOSyringOne，AS)100ymOl/l的1/2浓度的液体丛生芽诱导培养基悬浮，稀释5-20倍用于转化。取继代培养13-20天的丛生芽组织块为转基因受体。用农杆菌介导法进行转化， 转化材料在暗中进行恢复培养。农杆菌感染的丛生小芽或丛生芽组织块在加有头孢霉素 (Cefotaxime) 250mg/l或羧苄青霉素(Carb) 500mg/l的培养基上于黑暗中培养7 12天， 抑制细菌生长。恢复培养后或抑菌培养后的丛生小芽或丛生芽组织块在加有选择剂草甘膦 (浓度因自交系不同而异)的培养基上连续筛选3 4代，获得转基因细胞及小芽。在筛选培养中绝大数丛生芽组织块逐渐死亡。将存活的组织块转移到无选择剂的去掉2，4-D的A 培养基上恢复培养后产生小芽。将小芽放在成苗培养基上生长，光强2000-30001χ，光照14_15小时/天。小苗长到3-4片叶时转入生根培养基中生根。培养15天左右，约40%的小苗产生新根。对于未生根苗，切伤其基部，转移到新的生根培养基上培养，10天后大多数植株产生根系。生根苗洗去培养基后，移栽到以蛭石为栽培介质的花盆中生长。植株在自然光照下生长，日温22 280C，夜温15 21°C，隔天浇灌1/2浓度的种子萌发培养基的无机盐成分。生长2周左右， 移植苗产生发达根系，然后定植于田间。转基因植株的抗性检测和选择利用取移栽成活植株的叶片进行分子生物学检测确定转基因植株。而后将转基因植株(TO)套袋自交结实。将来自不同TO植株的Tl种子播在温室或具有防护设施的田间，出苗后取叶片进行PCR检测。检测方法为采用CTAB法微量提取叶片DNA，依据EPSP序列设计特异引物。PCR反应体系为10XPCR反应缓冲液2. 5 μ 1，Mg2+(25mM) 1. 5 μ 1，引物 1(12. 5 μ Μ) 1 μ 1，引物 11(12. 5 μ Μ) 1 μ 1，dNTP(10mM each) 0. 5 μ 1，Taq DNA 聚合酶(5U/ μ 1)0. 125 μ 1，DNA模板1 μ 1，无菌双蒸水17. 375 μ 1，共计25 μ 1。PCR反应程序为预变性 95°C 7分钟；变性95°C 1分钟，退火56°C 1分钟，延伸72°C 1分钟，循环35次；过度延伸7 分钟。琼脂糖电泳分离扩增产物，挑选PCR阳性个体。在此基础上，从每一独立转化体的后代中选择3株植株进行RT-PCR或Real-time RT-PCR检测，确定目标基因的表达强度。即采用Trizol试剂提取玉米叶片总RNA，使用随机六引物进行反转录，反应体系及步骤为RNA 500ng ；Random hexaprimer 0. 5 μ L ；Oligo dT primer 0· 5 μ L,5氺reverse transcriptase Buffer 2μ L, Reverse transcriptase Mix 0. 5 μ L ；Sterile ddH20 _卜足至 10 μ L，37°C反转录30min，85°C Seconds。将反转录所得cDNA稀释10倍为模板进行PCR扩增。在25 μ 1 反应体系中含有 IOmM Tris-Cl, 50mM KCl, 1. 5mM MgCl2, 200 μ M dNTP each，0· 8 μ M 引物， 0. 625U Taq DNA polymerase，1 μ 1模板，无菌去离子水补足25 μ 1。反应程序为95°C预变性 5min ；95°C 变性 lmin，58°C 退火 lmin，72°C 延伸 30s，循环 40 次；72°C 延伸 7min。扩增产物电泳分析。若采用Real-time RT-PCR分析，反应体系为SYBR I^emix Ex Taq ΤΜ(2Χ)5μ L ；PCR Forward Primer (10 μ Μ)0. 2 μ L ；PCR Reverse Primer (10 μ Μ)0. 2 μ L ； cDNA 模板 Χμ L ;Sterile ddH20 Υμ L0 PCR 反应条件为95°C预变性 2min ;95°C变性 30s， 60°C退火30s，72°C延伸30s，循环40次；72°C延伸5min。退火温度根据不同的引物有所不同，根据计算值进行确定。使用MJ Real-Time PCR仪进行Real-Time PCR，采用Opticon MonitorTM Software对实验结果进行分析。每点个设三个生物学重复。Tl代筛选出的转基因植株继续套袋自交，对其子代继续进行分子生物学鉴定和根系性状检测。通过2 3代自交纯合和选择，获得转基因纯合玉米自交系。在植株三叶期喷洒1. 25%浓度草甘膦溶液进行除草剂抗性筛选，7 9d后统计抗、感植株比例。由于高浓度草甘膦引起玉米叶片发黄死亡，可根据发黄死亡程度分为I、 II、III、IV级，其中I级抗性最强。将抗性为I级或II级的Tl和T2代植株移栽到大田套袋自交，收获子代种子，同时进行PCR检测。经除草剂筛选和PCR检测。根据除草剂抗性和 PCR检测结果，从T3代挑选出转基因纯合系(Tl和/或T2代呈现孟德尔分离比例，T3植株除草剂抗性无分离)用于植株性状观察和生理学测定。稳定的转基因株系RT-PCR筛选将T3代PCR阳性株系的种子萌发4d，取幼叶(包括芽鞘)和幼根进行Real-time RT-PCR检测。在未转基因对照植株中，根中ZmPINla表达量约是幼叶的1.2倍。在转正义 ZmPINla的株系中，根中ZmPINla的表达量有不同程度的提高，部分株系根中的ZmPINla表达量是对照植株(WT)的2倍左右。在转反义基因株系中，ZmPINla的表达量在多数株系的根中有不同程度的下降。另外ZmPINla在幼叶中的表达也受到转基因的影响，也有显著提高。通过转基因植株Real-time RT-PCR检测，筛选出目标基因表达强度与对照植株有显著差异的转基因纯合株系，在后续工作中用于形态学分析和生物量分析。蛭石培养条件下V6期植株的生物量及形态分析将对照植株(WT)和不同转基因株系的种子播于装满蛭石的无盖大盒内，自然光下生长，隔天浇灌营养液。转正义ZmPINla基因植株的地上部明显较矮，且主要由下部节间较短造成。植株长至6叶期时，用水洗去蛭石，将植株轻轻取出观测。转正义ZmPINla基因植株的根系比WT和转反义基因植株的发达，表现为种子根长、侧根数目增多，根体积增大。 生物量分析得出，6个转正义ZmPINla基因株系具有一致的趋势，根系干重显著高于对照的，而茎叶干重比对照略轻；而4个转反义ZmPINla基因的株系，茎叶比对照有不同程度增加，根干重与对照相近或较低。测定供磷水平对转ZmPINla基因植株生物量及形态特征的影响T3代转基因植株和对照植株在不同磷水平的营养液中生长到V6期，分别测量它们的根长、根数目、茎叶和根系生物量。在足磷营养液中转正义ZmPINla株系玉米具有较发达的根系。虽然转正义ZmPINla植株的冠根数、种子根数与对照植株相比无明显差异，但侧根数目是对照植株的121 173%。转反义ZmPINla植株的侧根数目是对照植株的82 106%，在4个株系中只有1个株系的侧根数目显著少于对照植株的。根长度测定表明，转正义ZmPINla株系的侧根长、总根长均显著高于对照及反义株系，转正义ZmPINla株系的初生根长和种子根长也高于对照植株的。就总体而言，转反义ZmPINla株系的与对照相比差异较小，只有少数统计值与对照呈现差异显著。用总根长除以总根数得到平均根长，发现转正义ZmPINla基因的植株由于总根数大量增加而降低了平均根长，尤其是侧根，但初生根和种子根的平均长度增加，这样形成了具有较长种子根及初生根和较短而密集的侧根的根系构型。当植株在低磷营养液中生长时，ZmPINla基因过表达效果更加明显，这可能与选用的启动子特性(根特异表达的低磷胁迫诱导的启动子)有关。低磷培养条件下各株系均表现出低磷条件下的适应性变化，对照株系表现为初生根长度增加，总根长下降，侧根数目略有下降，但没有达到统计学差异显著。这与其它实验的结果稍有差异，可能是处理的时间长短不同造成的。除对照植株外，其它株系均表现出侧根数和总根数增加，初生根和冠根的长度增加，侧根和总根长显著下降。比较不同株系根系形态和统计值，得出转正义ZmPINla基因植株的侧根数和总根数与对照相比显著增加，是对照植株的141 261%，但总根长为对照植株的98 132%，且根系各参数分析表明根长的增加主要是由初生根长度的增加引起的。测定ZmPINla过表达对玉米产量性状的影响根据转基因植株的表型及根系形态分析，转入ZmPINla基因对玉米植株生长发育有较大影响，因此，有必要开展转入ZmPINla基因对玉米产量性状和抗逆性的影响。将对照株系(WT)和不同转基因株系的种子播于大小一致、土壤含量一致的大花盆里，出苗后精心管理，等量施肥和浇水。在苗期，除生长较慢外，转正义ZmPINla基因植株的地上部形态特征和对照植株相比无明显差别。成株期转正义ZmPINla基因植株的株高明显较低，约为对照植株的73 91%，第一穗位高比对照降低了 20 35cm，且几乎所有植株产生2-3个果穗，但下位果穗发育不良。转反义ZmPINla株系玉米的生长状况与对照相比差异不明显。不同株系的植株生育期基本相同。单株产量统计结果表明，转正义ZmPINla 株系的穗行数和穗轴粗与对照及反义株系相比无显著差别，但多数果穗长度长于对照植株的，百粒重是对照植株的130 190%。由于雌雄发育协调程度在很大程度上决定了单株产量，散粉-吐丝间隔期大于3天的植株均结籽很差，与对照相比，多数转正义基因的植株雌雄发育较协调。从总体而言，根特异性过表达ZmPINla提高了玉米单株产量。可能发达的根系提高了玉米对水分、养分的吸收，从而提高了单株产量，且穗位高和株高的降低有利于抗倒伏、密植及光合效率的提高，在玉米密植育种中有一定的应用价值。在对玉米抗旱性测定中，将生长至V5期的转ZmPINla基因玉米和对照小苗进行干旱致死试验。在停止浇水后2d时，各株系均出现了缺水导致的叶片萎蔫，但正义株系叶片萎蔫程度较轻、出现胁迫症状较晚。继续干旱3d(即干旱处理5d)后，各株系的植株都出现了严重的干旱胁迫症状，如叶片萎蔫、下部叶片开始死亡、茎基部因严重失水而植株倒伏。 比较此时各株系植株的形态变化和活力，发现正义株系比对照和反义株系植株的叶片萎蔫较轻，且倒伏植株比例较少。恢复浇水2d后，转基因正义植株能够较快恢复正常生长，而在对照和反义株系中仅有少量植株存活。即转正义ZmPINla基因植株与对照植株相比具有明显提高的耐旱性。实施例2 转I^rsp ZmPINlb基因创造玉米耐旱耐低磷自交系及应用融合基因及植物表达载体的构建为了实现转基因ZmPINlb基因在玉米根部特异性表达，需将ZmPINlb基因与根特异表达的启动子I^rsp (大麦磷转运体1基因启动子)连接，构建融合基因。将测序验正的 ZmPINlb 基因重组到 pCAMBIA-Prsp: :MCS-Tnos-P35S: :bar (pRPB)中，用于农杆菌介导的玉米遗传转化。该载体含有由P35S启动的抗除草剂草丁膦性的bar基因和启动的目的基因，ZmPINlb可以正义或反义形式插入到多克隆位点MCS中，得到所需质粒。后者经酶切鉴定或测序鉴定后，采用液氮速冻法导入农杆菌LBA4404或其它菌株中用于玉米遗传转化。玉米无菌苗获得玉米优良自交系的种子，用70%乙醇浸泡8分钟，再用0. 氯化汞浸泡8-12分钟，然后用无菌水洗涤3-5遍。灭菌期间不断晃动种子，以保证表面灭菌彻底。灭菌后种子放在无菌三角瓶内萌发，瓶内放入少量无菌水于黑暗条件)下1-2天。待种子萌动(露白)后，将其放在改良MS培养基上于黑暗条件下萌发。待胚芽伸长止3-4厘米时， 剥离胚芽鞘及2-3片幼叶，露出茎尖顶端生长锥。农杆菌培养及活化将带有双元载体(Mini-Ti质粒 pCAMBIA-Prsp :ZmPINlb-Tnos-P35S: :bar)的根瘤农杆菌(AGL1或LBA4404)在附加抗生素的LB培养基中下震荡培养，震荡速率为 llOr/min，使细菌处于对数生长期。然后在3000r/min下离心10分钟，弃上清液。菌体用 1/2MS液体培养基洗涤，离心收集。再将菌体用添加ΙΟΟμπιοΙ/l乙酰丁香酮的1/2MS液体培养基悬浮，稀释5-20倍用于转化。玉米无菌苗转化(1)将菌液倒在4. 5厘米直径的培养皿中，倾斜培养皿，使露出茎尖生长锥的无菌苗浸泡在菌液中，在0. 5 X IO5Pa大气压下处理8-12分钟。(2)浸染后的芽尖用无菌滤纸吸干，萌发种子放在改良MS培养基上于黑暗中培养 2-3天，培养温度为2214°C。然后将无菌苗放在散射光下培养2天。(3)将照光培养后的无菌苗移栽到铺有上层蛭石下层壤土的花盆中，并用蛭石覆盖植株顶部。然后让植株在自然光照下生长，日温2218°C，夜温15-21°C，隔天浇灌1/2改良MS培养基无机盐。
转化植株筛选与定植转化植株长出3片叶后，喷洒除草剂Finale· (Hoechst Schering AgrEvo GmbH，含有除草剂glufosinate ammonium)水溶液，浓度为9. 6ml 10. 8ml Finale /L，以植株掉液滴为宜。未转化对照植株在喷洒后4天后停止生长，9天后开始死亡。转化植株在喷洒后，一些个体变化同对照植株相似，另一些个体持续生长，变化不明显。待存活植株长到5叶时， 将其定植到田间，套袋自交结籽。转基因植株子代分析Tl代植株长到3叶期用10. 8ml Finale /L水溶液处理，观察统计抗性和敏感性个体比例；采用PCR技术检测外源基因，并统计外源基因在子代植株中的分离比例。存活植株移栽到大田，套袋自交。T2代植株除套袋自交结籽外，采用PCR技术检测外源基因进行 Southern blotting验证，并采用RT-PCR技术检查转基因表达强度。对于入选的转基因株系观察根系构型，测定3-7叶期小苗生长速率及根冠比，测定单株产量和生物量，并以未转基因植株为对照。选出优良的转基因株系后在大田栽培条件下进行玉米产量性状的观测和比较。转基因玉米植株的根系形态观察、营养吸收特性和耐旱耐低磷特性及生产力测定的详细步骤见发明内容。在转ZmPINlb基因的株系中，转正义基因株系的目标基因表达量均有不同程度的提高，但在反义株系中表达量下降幅度小，最低表达量约为对照植株的60%。ZmPINlb在幼叶中的表达量高于根中。转ZmPINlb基因植株与WT植株在地上部形态和生长速率等方面无明显差别，过表达ZmPINlb基因植株的根系比WT和转反义基因植株的发达。转ZmPINlb 基因植株生物量分析的结果表明，在6个转正义基因株系中有4个株系的茎叶干重略高于对照株的，只有1个株系的茎叶干重低于对照的；而根系干重表现出有较大差异，多数转正义基因植株的根干重显著高于对照植株的。在4个转反义ZmPINlb基因的株系中，2个株系的茎叶及根干重与对照植株相近，2个株系的茎叶干重显著低于对照植株的，即转反义 ZmPINlb基因的植株表现出生长与野生型相近或较慢。供磷水平对转ZmPINlb基因植株生物量及形态特征的影响T3代转ZmPINlb基因植株和对照植株(WT)在不同供磷水平的营养液中培养至V6 期，分别测量转基因和对照植株的根长度、根数目，测定茎叶和根系的生物量。当植株在低磷营养液中生长时，对照植株的根数目下降，为足磷条件下的88%，这与低磷胁迫能减少玉米侧根数目的观察结果相一致。比较各株系对低磷胁迫的反应，发现转正义或反义基因的植株都表现出对低磷胁迫的敏感性降低，侧根数、总根数和足磷培养液中生长的植株相差不大或相对较高。这一现象在植株生物量的变化中也存在。即向玉米骨干自交系引入玉米 Prnib基因时，影响了玉米在低磷胁迫条件下根系的适应性变化。将对照株系和来自不同独立转化体的转基因纯合株系的种子播于大小一致、蛭石含量一致的无盖大箱中。3叶期定苗，隔天浇灌去掉磷酸盐的1/2MS营养液或1/2MS营养液。待植株长至6叶期时，洗去蛭石，轻轻分离玉米根系，再用自来水洗净后照相，烘干并测定根系和地上部的生物量，计算根冠比，根系发达的株系并检测它们的耐低磷特性。耐旱性测定见发明内容和实例1。入选的株系具有发达的根系且耐低磷耐旱特性明显优于未转基因自交系，可用于配制玉米杂交种。实施例3 转I^rsp: ZmPINla或I^rsp: ZmPINlc基因创造高粱抗倒伏耐低磷材料
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融合基因及植物表达载体的构建将测序验正的ZmPINla 和 ZmPINlc 分别重组到 pCAMBIA_Prsp :MCS-Tnos_P35S: :bar(pRPB)中。该载体含有由P35S启动的除草剂草丁膦抗性基因bar和I^rsp启动的目的基因插盒。在构建好的植物表达载体中ZmPINla或ZmPINlc可分别以正义形式插入到多克隆位点MCS，得到所需质粒。后者经酶切鉴定或测序鉴定后，采用液氮速冻法导入农杆菌 LBA4404或其它菌株中，用于农杆菌介导的高粱遗传转化。高粱无菌苗获得高粱优良基因型种子用70%乙醇浸泡2分钟，再用0. 氯化汞浸泡8-12分钟， 然后用无菌水洗涤3-5遍。灭菌期间不断晃动种子，以保证表面灭菌彻底。灭菌后种子放在无菌三角瓶内萌发，瓶内放入少量无菌水于黑暗条件)下1-2天。待种子萌动 (露白)后，将其放在改良MS培养基上于黑暗条件下萌发。待胚芽伸长止3-4厘米时，剥离胚芽鞘及2-3片幼叶，露出茎尖顶端生长锥。农杆菌培养及活化将带有双元载体(Mini-Ti质粒 pCAMBIA-Prsp :ZmPINla-Tnos-P35S: :bar 或 pC AMBIA-Prsp :ZmPINlc-Tnos-P35S: :bar)的根瘤农杆菌(EHA105 或 LBA4404)在附加抗生素的LB培养基中下震荡培养，震荡速率为llOr/min，使细菌处于对数生长期。然后在 3000r/min下离心10分钟，弃上清液。菌体用1/2MS液体培养基洗涤，离心收集。再将菌体用添加ΙΟΟμπιοΙ/l乙酰丁香酮的1/2MS液体培养基悬浮，稀释5_20倍用于转化。高粱无菌苗转化(1)将菌液倒在4. 5厘米直径的培养皿中，倾斜培养皿，使露出茎尖生长锥的无菌苗浸泡在菌液中，在0. 5 X IO5Pa大气压下处理8-12分钟。(2)浸染后的芽尖用无菌滤纸吸干，萌发种子放在改良MS培养基上于黑暗中培养 2-3天，培养温度为2214°C。然后将无菌苗放在散射光下培养2天。(3)将照光培养后的无菌苗移栽到铺有上层蛭石下层壤土的花盆中，并用蛭石覆盖植株顶部。然后让植株在自然光照下生长，日温2218°C，夜温15-21°C，隔天浇灌1/2改良MS培养基无机盐。转化植株筛选与定植转化植株长出3片叶后，喷洒除草剂Finale (Hoechst Schering AgrEvo GmbH，含有除草剂glufosinate ammonium)水溶液，浓度为9. 6ml_10. 8ml Finale /L，以植株掉液滴为宜。未转化对照植株在喷洒后4天后停止生长，9天后开始死亡。转化植株在喷洒后，一些个体变化同对照植株相似，另一些个体持续生长，变化不明显。待存活植株长到5叶时，将其定植到田间，套袋自交结籽。转基因植株子代分析Tl代植株长到3叶期用10. 8ml Finale /L水溶液处理，观察统计抗性和敏感性个体比例；采用PCR技术检测外源基因，并统计外源基因在子代植株中的分离比例。存活植株移栽到大田，套袋自交。T2代植株除套袋自交结籽外，采用PCR技术检测外源基因并进行 Southern blotting验证，采用RT-PCR技术检查转基因表达强度。对于入选的转基因株系观察根系构型，测定3-7叶期小苗生长速率及根冠比，测定单株产量和生物量，并以未转基因植株为对照。选出优良的转基因株系后在大田栽培条件下进行产量性状的观测和比较。转基因高粱植株的根系形态观察、营养吸收特性和耐旱耐低磷特性及生产力测定的详细步骤类同于玉米。
权利要求
1.生长素输出载体Pmi家族基因在玉米、高粱育种中的应用，其特征是克隆出Pim 家族基因，通过与不同启动子融合构建融合基因，采用转基因技术将融合基因导入玉米、 高粱，产生生长素浓度梯度发生变化而导致植株性状发生改变的工程植株及其后代，用于玉米、高粱的遗传改良；其中所述Pmi家族基因克隆于不同的高等植物，并且同一物种的 PINl家族基因可为1个或数个；所述Pim家族基因是完整或部分CDNA基因形式、完整或部分基因组基因形式、或它们的RNAi结构。
2.如权利要求ι所述生长素输出载体Pim家族基因在玉米、高粱育种中的应用，其特征是克隆出Pmi家族基因通过与不同启动子连接形成融合基因，不同Pmi基因可单独或联合重组到植物表达载体中，利用启动子控制转基因的表达强度和特异性。
3.如权利要求2所述生长素输出载体Pim家族基因在玉米、高粱育种中的应用，其特征是所述融合基因用于玉米、高粱转基因，不同Pmi基因可单独或联合转入受体植物，产生生长素浓度梯度发生该变的转基因植株。
4.如权利要求ι所述生长素输出载体Pim家族基因在玉米、高粱育种中的应用，其特征是所述Pmi家族成员基因包括从不同高等植物中克隆的与玉米中ZmPmia、ZmPINlb, ZmPINlc和ZmPINld编码的多肽序列相近或相同的蛋白基因，也包括人工合成或由不同多聚脱氧核苷酸序列片段重组而成的核苷酸序列，即功能相近和相同的编码蛋白的基因。
5.如权利要求ι所述生长素输出载体Pim家族基因在玉米、高粱育种中的应用，其特征是所述转基因植株及其后代通过筛选和测定，选出遗传稳定且目标性状显明改变的株系用于玉米、高粱的遗传改良。
6.如权利要求1或5所述生长素输出载体Pim家族基因在玉米、高粱育种中的应用， 其特征是全长或部分序列的Pim家族基因重组到中间质粒中与所需的启动子融合构建融合基因，再将融合基因重组到植物表达载体中，其中选用的启动子有根特异性的、茎特异性的、果穗特异性的或诱导型的。
7.如权利要求ι所述生长素输出载体Pim家族基因在玉米、高粱育种中的应用，其特征是通过检测转基因表达和对转基因株系进行性状鉴定，筛选出目标性状明显改变的转基因植株，创造出在育种中具有应用前景的新种质。
8.如权利要求ι所述生长素输出载体Pim家族基因在玉米、高粱育种中的应用，其特征是从普通栽培玉米和玉米近缘种或亚种中克隆出ZmPmia、ZmPINlb和ZmPINlc基因，将它们分别与根特异表达的启动子I^rsp融合，重组到不同的植物表达载体中，转入玉米优良自交系，获得根系发达、株高降低、耐低磷特性和耐旱性大幅度提高的转基因株系并用于玉米育种。
9.如权利要求ι所述生长素输出载体Pim家族基因在玉米、高粱育种中的应用，其特征是从普通栽培玉米和玉米近缘种或亚种中克隆出ZmPINla和ZmPINlb基因，将它们分别与根特异表达的启动子I^rsp融合，重组到不同的植物表达载体中，转入高粱优良品种中， 获得根系发达、株高降低、耐低磷特性显著提高的转基因株系并用于高粱育种。
全文摘要
本发明公开一种生长素输出载体PIN1家族基因在玉米、高粱育种中的应用，是从不同高等植物中克隆出PIN1家族基因的不同成员，通过分别与不同启动子连接构建融合基因，采用转基因技术将重组基因导入玉米、高粱细胞，获得转基因植株及其后代，筛选生长素浓度梯度发生变化导致植株性状发生改变的工程植株，创造出在玉米、高粱育种中具有应用前景的新种质。
文档编号C12N15/84GK102296084SQ20111026064
公开日2011年12月28日 申请日期2011年9月5日 优先权日2011年9月5日
发明者张举仁, 张新蕊, 李朝霞 申请人:山东大学