专利名称：用于指导铂类药物个体化治疗的基因组合的制作方法
技术领域：
本发明属于基因技术领域，涉及一组用于指导钼类药物个体化治疗的基因组合。
背景技术：
钼类化疗药物(顺钼、卡钼、奥沙利钼等)是肿瘤化疗领域的最常用药物之一，其抗癌活性是通过在DNA双链上形成共价交联，并与DNA绑定形成钼-DNA加合物，从而引起一系列细胞内事件的发生，最终导致肿瘤细胞死亡。然而部分肿瘤细胞对钼类药物的敏感性差是导致化疗失败，病情进展的主要原因。因此，临床医生在使用钼类药物前，迫切需要一份对疗效、耐药性及预后具有前瞻性指导意义的信息。GSTPl属于多功能II相代谢酶家族，能催化谷胱甘肽与多种毒性复合物(包括钼类制剂)结合，形成低毒高水溶性物质排出细胞外，达到促进药物排泄而降低抗癌效果的作用。GSTPl外显子5的第313位碱基存在A/G单核苷酸多态，导致其编码的氨基酸发生 Ile-Val改变，显著降低GSTPl的活性，从而使化疗药的清除率降低和药物对肿瘤作用的时间延长。MRP2 :MRP2 (ABCC2)属于多药耐药相关蛋白(multidrug resistance associated proteins, MRPs)家族，MRPs定位于细胞膜，是一类能量依赖性转运蛋白，主要转运疏水性、 不带电荷分子或水溶性阴离子化合物。已经证实MRP2与钼类药物的耐药有关。MRP2表达增强时，顺钼-DNA复合物的形成减少，C2阻滞减少，细胞对钼类的耐药性增强；而当SNP导致MRP2发生氨基酸替换时，这一作用减弱，细胞对钼类敏感性增强。另有研究表明，MRP2可能通过促进GSH结合的钼离子排出细胞外，来增强肿瘤细胞对钼类的耐药性。MRP第10外显子(G1249A)的突变使MRP2的功能降低，从而增加肿瘤患者对钼类药物的敏感性。XRCCl XRCCl (X-ray repair cross-complementing gene 1)是碱基切除修复系统(BER)和单链断裂修复系统(ssBR)中的重要成分，参与顺钼或卡钼引起的DNA损伤修复过程，其进化保守区有SNP，导致其编码区密码子194和399的取代改变，从而影响XRCCl蛋白的正常功能，改变DNA的修复能力。多项研究表明，在XRCCl Argl94Trp基因表达中，携带至少1个194Trp 等位基因患者化疗有效率是携带野生基因型Arg/Arg患者的3倍；携带XRCCl 399Arg/Arg 基因型患者治疗的有效率是Arg/Gln或Gln/Gln基因型者的2. 7倍；在联合基因型中，既携带194 Arg/Trp又携带399 Arg/Arg基因型患者化疗有效率进一步提高。ERCCl :ERCC1 (excision repair cross-complementation group 1)是核苷酸切除修复途径的限速酶，在核酸损伤修复过程和凋亡过程中起着重要作用。ERCCl基因的表达产物与DNA修复酶缺乏互补基因F(XPF)形成紧密的异二聚体(ERCC1-XPF)，该二聚体具有识别损伤和5’端切除的双重作用，在核苷酸切除修复中起到限速或调节的重要作用。ERCCl 的表达量直接影响DNA修复的生理过程。所有肿瘤细胞中都有ERCCl表达，而且表达水平差异很大。核苷酸切除修复(nucleotide excision repair, NER)是钼类药物耐药的重要机制之一。临床研究已证实ERCCl参与钼类化疗耐药发生，其表达水平与多种癌症钼类化疗疗效和生存期呈负相关，既表达水平低的患者对钼类药物敏感，表达水平高的患者表现耐药。ERCCl基因中118位密码子CC野生型对钼类药物化疗反应性较好，有较好的预后。 ERCC1TT突变型会导致ERCCl蛋白表达水平增高，增强修复顺钼对DNA的损伤的能力，因此突变患者对钼类药物耐药。ERCC2 着色性干皮病基因D (XPD) /切除修复交叉互补基因2 (ERCC2)是参与受损 DNA核苷酸切除修复(NER)过程的一种重要的酶，其活性直接影响钼类药物的化疗效果。 ERCC2存在多个单核苷酸多态性(SNP)，312Asp/Asn和751Lys/Gln多态性比较常见。最常见的为第751位密码子由赖氨酸(Lys)变为谷氨酰胺(Gln)，此多态性影响奥沙利钼(L-OHP) 的治疗效果。研究显示，C/C基因型病人缓解率明显比C/A和A/A基因型病人高，C/C基因型病人对钼类药物敏感性更好。药物代谢和效应的个体化差异临床上，由于个体基因型差异，患者对药物敏感性的差异显著。因此，在对肿瘤患者进行治疗时，如果先对其相关基因位点进行检测，再根据其基因突变情况用药，以达到在正确的时间，给正确的患者，实施正确的个体优化治疗。通过检测病人肿瘤组织中的 GSTPl，MRP2, XRCCl-Exon6, XRCCl-Exon 10, ERCCl，ERCC2 基因位点的突变情况，对拟采用钼类药物治疗的病人进行药物敏感性指导，可以使疗效达到最大， 副作用降到最低。现有临床用药方法的缺陷大量研究表明，由于个体基因型差异，患者对药物敏感性的差异显著。如医生在用药时未做药物的靶标检测，则可能导致用药无(微)效、延误最佳治疗时机、毒副作用等现象发生。本发明的有益之处是(1)本发明的筛选方法是一种对人体无害的检测方法；(2) 本发明通过检测病人肿瘤组织中的 GSTPl，MRP2，XRCCl-Exon6，XRCCl-Exon 10，ERCCl，ERCC2 基因位点的突变情况，对拟采用钼类药物治疗的病人进行药物敏感指导，可以使疗效达到最大，副作用降到最低。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是针对目前肿瘤的治疗过程中，钼类药物的疗效在不同病人间的明显差异，提供一种方便、快捷的辅助临床医生制定个体化用药方案的基因组合及其应用方法。本发明的目的是提供一组用于指导钼类药物个体化治疗的基因组合，包括: GSTP1，MRP2, XRCCl-Exon6, XRCCl-Exon 10，ERCCl，ERCC2 基因。本发明的另一个目的是提供该基因组合在指导钼类药物个体化治疗中的应用。基于上述目的，本发明采用以下技术方案针对上述基因的特异性位点设计引物，各基因引物序列如表1所示。表 权利要求
1.一组用于指导钼类药物个体化治疗的基因组合，其特征在于该基因组合包含 GSTP1，MRP2, XRCCl-Exon6, XRCCl-Exon 10，ERCCl，ERCC2 基因。
2.根据权利要求1所述的基因组合，其特征在于针对GSTPl位点设计的正向引物序列为CTGCTGTGTGGCAGTCTCTC(SEQ ID No. 1)，反向引物序列为CCGTTACTTGGCTGGTTGAT(SEQ ID No. 2)；针对MRP2位点设计的正向引物序列为GGGCAAAGAAGTGTGTGGAT (SEQ ID No. 3)，反向引物序列为AGGGTCCCAACTCTCTCCAT (SEQ ID No. 4)；针对 XRCCl_Exon6 位点设计的正向引物序列为:ATACTGACCTTGCGGGACCT (SEQ ID No. 5)，反向引物序列为 CAGCCTCCAGACCTCTCAAC(SEQ ID NO. 6)；针对 XRCCl-ExonlO 位点设计的正向引物序列为 TCCACTATGCTGCATGCTTT (SEQ ID No. 7)，反向引物序列为ATTGCCCAGCACAGGATAAG(SEQ ID NO. 8)；针对ERCCl位点设计的正向引物序列为TGAGCCAATTCAGCCACT (SEQ ID No. 9)，反向引物序列为TAGTTCCTCAGTTTCCCG(SEQ ID NO. 10)；针对ERCC2位点设计的正向引物序列为GATGGCCCGCTCTGGATT (SEQ ID No. 11)，反向引物序列为CCTGCGATTAAAGGCTGTGG (SEQ ID NO. 12)。
3.如权利要求2所述的引物序列在检测其相应的基因突变中的应用。4.如权利要求3所述的应用，其特征在于检测方法如下4. 1提取病人待测肿瘤组织基因组DNA ；
4.2以待测肿瘤组织基因组DNA为模板，用权利要求2所述的扩增引物进行PCR扩增；4. 3PCR扩增产物凝胶电泳分析；4.4PCR扩增产物测序。
5.如权利要求4所述的应用，其特征在于所述步骤4.2中PCR反应体系每20 μ 1组成如下待测病人肿瘤组织基因组DNA 50 100ng，Taq酶0. 125 μ 1，上下游引物(10 μ Μ)各 1μ 1，dNTP (2. 5πιΜ)2μ 1，10XPCR 缓冲液(含 Mg2+) 2 μ 1，余下为无菌蒸馏水。
6.如权利要求4所述的应用，其特征在于所述步骤4.2中用于检测GSTPl的PCR扩增反应条件是95°C预变性2min，随后95°C变性30sec，55°C退火30sec，72°C延伸30sec，进行40个循环，最后72°C延伸7min，4°C保存。
7.如权利要求4所述的应用，其特征在于所述步骤4.2中用于检测MRP2的PCR扩增反应条件是95°C预变性2min，随后95°C变性30sec，64°C退火30sec，72°C延伸30sec，进行 40个循环，最后72°C延伸7min，4°C保存。
8.如权利要求4所述的应用，其特征在于所述步骤4.2中用于检测XRCCl-EXOn6的 PCR扩增反应条件是95°C预变性2min,随后95°C变性30sec，58°C退火30sec，72°C延伸 30sec，进行40个循环，最后72°C延伸7min，4°C保存。
9.如权利要求4所述的应用，其特征在于所述步骤4.2中用于检测XRCCl-ExonlO的 PCR扩增。反应条件是95°C预变性2min，随后95°C变性30sec，58°C退火30sec，72°C延伸 30sec，进行40个循环，最后72°C延伸7min，4°C保存。
10.如权利要求4所述的应用，其特征在于所述步骤4.2中用于检测ERCCl的PCR扩增反应条件是95°C预变性2min，随后95°C变性30sec，58°C退火30sec，72°C延伸lmin，进行 40个循环，最后72°C延伸30seC，4°C保存。
11.如权利要求4所述的应用，其特征在于所述步骤4.2中用于检测ERCC2的PCR扩增反应条件是95°C预变性2min，随后95°C变性30sec，6(TC退火30sec，72°C延伸lmin，进行40个循环，最后72°C延伸30seC，4°C保存。
12.如权利要求4所述的应用，其特征在于所述步骤4. 4中测序PCR扩增的反应条件为95°C预变性％iin，随后95°C变性30sec，50°C退火15sec，进行35个循环，最后60°C延伸％iin，4°C保存。
全文摘要
本发明属于基因技术领域，提供一组用于指导铂类药物个体化治疗的基因组合，包括GSTP1，MRP2，XRCC1-Exon6，XRCC1-Exon10，ERCC1，ERCC2。本发明通过检测病人肿瘤组织中的GSTP1，MRP2，XRCC1-Exon6，XRCC1-Exon10，ERCC1，ERCC2基因位点的突变情况，对拟采用铂类药物治疗的病人进行药物敏感指导，以使疗效达到最大，副作用降到最低。
文档编号C12N15/11GK102367438SQ20111026158
公开日2012年3月7日 申请日期2011年9月6日 优先权日2011年9月6日
发明者楼敬伟 申请人:上海宝藤生物医药科技有限公司