专利名称：一种发酵丁二酸分离过程水循环利用的方法
技术领域：
本发明属于生物化工领域，涉及一种发酵丁二酸分离过程水循环利用的方法，具体涉及一种回收利用工业蒸发水、蒸汽凝液发酵生产丁二酸同时提高丁二酸产量的方法。
背景技术：
丁二酸，又名琥珀酸，是一种二元有机酸，它是一种重要的C4平台化合物，可用于表面活性剂、清洁剂添加剂和起泡剂等领域，作为离子螯合剂，可用于电镀行业，在食品行业，可作为酸化剂、PH改良剂、风味物质和食品改良剂；也可用于包括医药、抗生素、氨基酸和维生素的生产。生产丁二酸的方法主要有两种化学合成法和微生物发酵法，化学生产方法一般采用丁烷经顺丁烯二酸酐通过电解生产，污染大、转化率低、成本高，严重抑制了琥珀酸的发展潜力。利用微生物发酵法生产丁二酸，由于原料来源广泛且价格低廉，污染小，环境友好，且在发酵过程中可吸收固定CO2,能有效缓解温室效应，开辟了温室气体二氧化碳利用的新途径，近年来成为研究的热点。大肠杆菌由于遗传背景清楚、易操作、易调控、培养及要求简单和生长迅速等优点，几年来被广泛用于研究以或得产丁二酸优秀菌株。利用微生物发酵生产丁二酸的发酵液需经过预过滤、超滤、纳滤、浓缩、结晶最终得到丁二酸二钠或丁二酸。发酵液在浓缩阶段分别得到大量的蒸发水和蒸汽凝液，蒸发水中含有少量乙酸和甲酸等少量有机酸，将其用于细胞的有氧培养，通过提高细胞内一些关键酶的酶活促进了细胞的代谢能力，进而提高了菌体的产酸性能。丁二酸发酵液分离过程中产生的蒸汽凝液不含有机酸或金属离子，将其用于菌体发酵时，不会增加发酵体系的渗透压，可用于细胞的厌氧发酵阶段。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是一种利用发酵丁二酸分离过程中的蒸发水、蒸汽凝液发酵生产丁二酸的方法，以解决回收利用工业蒸发水、蒸汽凝液的问题，并进一步提高丁二酸的发酵能力和产酸能力。为了实现本发明的目的，本发明所采用的技术方案如下
一种发酵丁二酸分离过程水循环利用的方法，包括种子有氧培养、厌氧发酵产酸和丁二酸分离步骤，其特征在于用丁二酸分离步骤中回收的蒸发水或者蒸汽凝液配制种子有氧培养的培养基、菌体厌氧发酵的培养基；用丁二酸分离步骤中回收的蒸气凝液配制厌氧发酵产酸培养基以实现水循环利用。其中，所述的丁二酸分离步骤中回收的蒸发水或蒸汽凝液是将厌氧发酵产酸步骤结束后得到的丁二酸发酵液经预过滤、酸性条件下超滤、酸性条件下纳滤、中性条件下再次纳滤后，减压蒸发浓缩过程中产生的。蒸发水中含有少量的乙酸、甲酸等有机酸，蒸汽凝液中没有有机酸，其中成分和蒸馏水相同。进一步地，本发明所述的种子有氧培养的方法应理解为现有技术中任何利用产丁二酸大肠杆菌的种子有氧培养方法；在本发明中，是将大肠杆菌AFPlll菌体在三角瓶中进行有氧培养，培养基为LB种子培养基。具体地，取单菌落转接到5 mL试管，摇床37°C，200 r/min过夜活化，然后按1%接种量接至装液量为50 mL的500 mL三角瓶中好氧培养，添加 30 mg/L的卡那霉素、氯霉素，37°C，200 r/min摇床培养8小时左右作为种子液。进一步地，本发明所述的厌氧发酵产酸的方法应理解为现有技术中任何利用产丁二酸大肠杆菌的厌氧发酵产酸方法；在本发明中，可以是摇瓶培养，例如将种子有氧培养得到的种子液于4°C，8000 r/min，离心10 min，得到菌泥，洗勻转接入装液量为30 mL的100 mL血清瓶中厌氧培养，使得菌体初始浓度为10(彻_)左右，初始葡萄糖浓度为20 g/L，再通入过滤除菌后的CO2气体2 min，保证血清瓶中为厌氧环境，37°C、200 r/min厌氧发酵。也可以是发酵罐培养，例如将菌体厌氧发酵得到的种子液按5%接种量转接到装有4 L发酵培养基的7 L发酵罐(BioFlo 110 fermenter； New Brunswick Scientific Co. , Edison, N.J.)中，添加过滤除菌的VB1和生物素至终浓度为20 mg/L和2 mg/L，氯霉素30 mg/L, 卡那霉素30 mg/L，发酵温度维持在37°C，用NaOH调节pH值为7.0。发酵初始以0.5 L/ min通气量通空气，搅拌转速300 r/min，当菌体浓度为5 (彻6(1(1)以上时开始通富氧空气， 当菌体浓度达到15 (彻_)时，开始通过限速补糖控制菌体的比生长速率约为0.07 1Γ1，直到菌体浓度达到30 (彻_)，开始通CO2，转为厌氧发酵。进一步地，本发明所述的丁二酸分离的方法应理解为现有技术中任何利用产丁二酸大肠杆菌发酵丁二酸得到的发酵液的丁二酸分离方法；在本发明中，包括以下步骤
(1)预过滤对丁二酸发酵液进行预过滤，采用微滤的方法以除去菌体和固体颗粒。(2)酸性超滤调节滤液的PH为4. 0 6. 0，进行超滤，以除去蛋白质等生物大分子，操作温度25 40°C，操作压力0. 2 4. 0 MPa,收集超滤透过液。(3)酸性纳滤调节超滤透过液的PH值至3. 0 4. 0，进行纳滤，以除去色素、多价无机离子及未消耗的底物，操作温度25 40°C，操作压力1. 0 2. 5MPa，收集纳滤透过液。(4)中性纳滤调节含有丁二酸的纳滤透过液的PH值至6. 0 7. 0，再次进行纳滤，以除去甲酸、乙酸等副产物及单价离子，操作温度25 40°C，操作压力0. 2 4. OMPa, 收集纳滤截留液，实现预浓缩。(5)蒸发浓缩将得到的纳滤截留液进行减压蒸发浓缩，操作温度65 75°C，操作压力-0. 08 0. IMPa，得到浓缩液，同时得到大量蒸发水和蒸汽凝液，得到的蒸发水体积约为丁二酸发酵液体积的5/6，浓缩液50 70°C保温，用碳酸钠将浓缩液调节至pH为6. 8， 再冷却结晶、干燥，得到丁二酸酸钠。本发明的有益效果在于
1、本发明将丁二酸发酵液在分离过程中产生的蒸发水和蒸汽凝液代替现有技术中配制培养基所有的蒸馏水、纯净水或者自来水等用于大肠杆菌的培养和发酵，实现了工业废水的回收利用，对环境友好，同时丁二酸分离过程的蒸发水中含有少量的乙酸、甲酸等有机酸，将其用于大肠杆菌有氧培养，蒸发水中的有机酸可作为糖异生碳源，提高了细胞内一些关键酶的酶活，有利于菌体的厌氧发酵产酸。而用蒸汽凝液配制培养基也不产生不利影响。2、本发明的步骤(3)中，利用丁二酸分离过程中的蒸发水配制发酵培养基，发酵结束时，丁二酸浓度可达阳g/L，收率达91.6%，和自来水配制的培养基发酵结果相比，丁二酸浓度提高8. 5%，生产强度提高8. 46%。
图1大肠杆菌AFP111在用自来水配制的JSM发酵培养基中培养过程中葡萄糖、丁二酸、乙酸、菌体密度随时间的变化曲线。图2大肠杆菌AFPlll在用丁二酸回收过程产生的蒸发水配制的JSM发酵培养基中培养过程中葡萄糖、丁二酸、乙酸、菌体密度随时间的变化曲线。
具体实施例方式本发明中所述的培养基
(1) LB种子液培养基蛋白胨10 g/L，酵母膏5 g/L，NaCl 10 g/L。(2) JSM 发酵培养基柠檬酸 3. 0 g/L, Na2HPO4 · 7H20 3. 00 g/L, KH2PO4 8. 00 g/ L, (NH4)2HPO4 8. 00g/L, NH4Cl 0.2 g/L, (MM)2SO4 0. 75 g/L，MgS04 · 7H20 1. 00 g/L, CaCl2 · 2H20 10. 0 mg/L, ZnSO4 · 7H20 0. 5g/L, CuCl2 · 2H20 0. 25mg/L, MnSO4 · H2O 2. 5 mg/L, CoCl2 · 6H20 1. 75 mg/L, H3BO3 0. 12 mg/L, Al2(SO4) · 3xH20 1. 77 mg/L, Na2MoO4 · 2H20 0. 5 mg/L，柠檬酸铁 16.1 mg/L, VB1 20 mg/L，生物素 2 mg/L。本发明所用的重组大肠杆菌fecAericAia coli AFPlll来源于公开文献 (Mutation of the ptsG gene results in increased production of succinate in fermentation of glucose by Escherichia coli, Applied and Environmental Microbiology, January 2001，p. 148-154，Vol. 67，No. 1 0099_2240/01/$04.00+0 DOI: 10. 1128/AEM. 67. 1. 148-154. 2001)。本发明所采用的有机酸的分析方法为
高效液相色谱法(HPLC) :HPLC系统高效相色谱仪，WatersHPLCC2010工作站；色谱柱 Prevail organic acid column 250mmX4. 6mm;紫外检测波长 215nm ；流速 1 mL/min，进量 20 μ L，流动相 25 mmol/L KH2PO4, ρΗ2· 5 ；柱温室温。下面的实施例对本发明作详细说明，但对本发明没有限制。实施例1
种子有氧培养将冻存管中的菌种转接到试管，摇床过夜活化，然后按1%接种量转接到装有50 mL种子培养基的容量为500 mL的三角瓶中，温度37°C、摇床转速200 r/min，培养时间8 h。厌氧发酵摇瓶培养产酸将培养好的种子液于4°C，8000 r/min，离心10 min，得到菌泥，用无菌水洗勻转接入装液量为30 mL的100 mL血清瓶中厌氧培养，使得初始菌体浓度为10(fl96J，再通入过滤除菌后的(X)2气体2 min，温度37°C、摇床转速200 r/min，厌氧发酵。其中，蒸发水和蒸汽凝液的制备和丁二酸的分离同步完成，具体的方法是 (1)预过滤对丁二酸发酵液进行预过滤，采用微滤的方法以除去菌体和固体颗粒。(2)酸性超滤调节滤液的pH为4. 0，进行超滤，以除去蛋白质等生物大分子，操作温度25°C，操作压力0.2 MPa，收集超滤透过液。(3)酸性纳滤调节超滤透过液的pH值至3. 0，进行纳滤，以除去色素、多价无机离子及未消耗的底物，操作温度25°C，操作压力1. OMPa，收集纳滤透过液。(4)中性纳滤调节含有丁二酸的纳滤透过液的PH值至6. 0，再次进行纳滤，以除去甲酸、乙酸等副产物及单价离子，操作温度25°C，操作压力0. 2MPa,收集纳滤截留液，实现预浓缩。(5)蒸发浓缩将得到的纳滤截留液进行减压蒸发浓缩，操作温度65°C，操作压力-0. 08MPa，得到浓缩液，同时得到大量蒸发水和蒸汽凝液，得到的蒸发水体积约为丁二酸发酵液体积的5/6，浓缩液50°C保温，用碳酸钠将浓缩液调节至pH为6. 8，再冷却结晶、干燥，得到丁二酸酸钠。蒸发水、蒸汽凝液中的物质检测采用高效液相色谱法(HPLC)检测，检测结果为蒸发水中的甲酸含量为1. 3 g/L，乙酸含量为2. 8g/L，蒸汽凝液中不含有任何有机酸。按实施例1的方法，种子培养基分别用自来水、蒸发水、蒸汽凝液配制进行有氧培养，发酵培养基用自来水配制，发酵结果入表1。表1分离过程水用于种子培养阶段对发酵结果产生的影响
权利要求
1.一种发酵丁二酸分离过程水循环利用的方法，包括种子有氧培养、厌氧发酵产酸和丁二酸分离步骤，其特征在于用丁二酸分离步骤中回收的蒸发水或者蒸汽凝液配制种子有氧培养步骤的培养基、或者厌氧发酵产酸步骤的培养基，以实现水循环利用；其中，所述的丁二酸分离步骤中回收的蒸发水或蒸汽凝液是将厌氧发酵产酸步骤结束后得到的丁二酸发酵液经预过滤、酸性条件下超滤、酸性条件下纳滤、中性条件下再次纳滤后，减压蒸发浓缩过程中产生的。
2.根据权利要求1所述的发酵丁二酸分离过程水循环利用的方法，其特征在于所述的回收的蒸发水或蒸汽凝液的具体制备方法是(1)预过滤对丁二酸发酵液进行预过滤，采用微滤的方法以除去菌体和固体颗粒；(2)酸性超滤调节滤液的pH为4.0 6. 0，进行超滤，以除去蛋白质等生物大分子，操作温度25 40°C，操作压力0. 2 4. 0 MPa,收集超滤透过液；(3)酸性纳滤调节超滤透过液的pH值至3.0 4. 0，进行纳滤，以除去色素、多价无机离子及未消耗的底物，操作温度25 40°C，操作压力1. 0 2. 5 MPa,收集纳滤透过液；(4)中性纳滤调节含有丁二酸的纳滤透过液的pH值至6.0 7. 0，再次进行纳滤，以除去甲酸、乙酸等副产物及单价离子，操作温度25 40°C，操作压力0. 2 4. 0 MPa,收集纳滤截留液，实现预浓缩；(5)蒸发浓缩将得到的纳滤截留液进行减压蒸发浓缩，操作温度65 75°C，操作压力-0. 08 0. 1 MPa，得到浓缩液，同时得到大量蒸发水和蒸汽凝液，得到的蒸发水体积约为丁二酸发酵液体积的5/6，浓缩液50 70°C保温，用碳酸钠将浓缩液调节至pH为6. 8，再冷却结晶、干燥，得到丁二酸酸钠。
全文摘要
本发明属于生物化工领域，涉及一种发酵丁二酸分离过程水循环利用的方法。本发明将分离过程水用于E.coliAFP111的有氧生长和厌氧发酵生产丁二酸，最终产物浓度为55g/L，收率达91.6%，和用自来水配制的培养基发酵结果相比，丁二酸浓度提高8.5%，生产强度提高8.46%。本发明突出的优点是回收利用了丁二酸分离过程中的蒸发水，实现了丁二酸工业化生产过程中的水循环利用，对环境友好，同时丁二酸分离过程中产生的蒸发水含有少量的乙酸和甲酸等有机酸，将其用于菌体的有氧生长阶段，蒸发水中含有的少量有机酸可作为糖异生碳源提高了细胞内一些关键酶的酶活，从而有利于菌体的厌氧发酵产酸。
文档编号C12R1/19GK102321682SQ20111026933
公开日2012年1月18日 申请日期2011年9月13日 优先权日2011年9月13日
发明者刘嵘明, 吴昊, 姜岷, 张敏, 梁丽亚, 王光明, 韦萍, 马江锋 申请人:南京工业大学