专利名称：一种fgfr4高表达的重组hek293细胞及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于重组细胞技术领域，涉及一种FGFR4高表达的重组HEK293细胞及其应用。
背景技术：
受体酪氨酸激酶(receptor tyrosine kinase, RTKs)是最大的一类酶联受体，它既是受体又是酶，能够同配体结合，并将靶蛋白的酪氨酸残基磷酸化。所有的RTKs都是由三个部分组成的含有配体结合位点的细胞外结构域、单次跨膜的疏水α螺旋区、含有酪氨酸蛋白激酶(RTK)活性的细胞内结构域。受体酪氨酸激酶在没有同信号分子结合时是以单体存在的，并且没有活性；一旦有信号分子与受体的细胞外结构域结合，两个单体受体分子在膜上形成二聚体，两个受体的细胞内结构域的尾部相互接触，激活它们的蛋白激酶的功能，结果使尾部的酪氨酸残基磷酸化。磷酸化导致受体细胞内结构域的尾部装配成一个信号复合物(signaling complex)。刚刚磷酸化的酪氨酸部位立即成为细胞内信号蛋白 (signaling protein)的结合位点，可能有10 20种不同的细胞内信号蛋白同受体尾部磷酸化部位结合后被激活。信号复合物通过几种不同的信号转导途径，扩大信息，激活细胞内一系列的生化反应；或者将不同的信息综合起来引起细胞的综合性应答(如细胞增殖)。蛋白酪氨酸激酶信号转导异常是多种类型肿瘤细胞区别于相应正常细胞的关键特征之一。已知导致肿瘤发生、发展的癌基因约50%的表达产物都具有蛋白酪氨酸激酶活性，它们的异常表达将导致细胞增殖调节发生紊乱，进而导致肿瘤发生。此外，酪氨酸激酶及受体的异常表达还与肿瘤的侵袭、转移、肿瘤新生血管的生成和肿瘤化疗的耐药性密切相关。蛋白酪氨酸激酶受体是一类具有酪氨酸激酶活性的蛋白质，生长因子(GF)作为配体与其结合后，刺激GFR单体二聚化(dimerization)，催化ATP上的磷酸基转移到酪氨酸残基上，使其细胞膜胞内酪氨酸激酶区(TKD，tyrosine kinase domain)特定位点酪氨酸发生磷酸化，激活下游信号转导通路，造成细胞发生相应生物功能变化，尤其在介导恶性肿瘤发生过程中具有重要作用。人类成纤维细胞生长因子受体(fibroblast growth factor receptor FGFRs) 家族和它们的20多个配基对细胞在生理状况下进行多方位的调控，包括细胞生长、分化、 移行、血管生成等。FGF/FGFR信号传递是血管新生、胚胎发育、骨骼形成、伤口愈合、纤维化及肿瘤形成的重要原因之一。目前已确定了四种由独立基因编码的人FGFRs，即FGFIU FGFR4。肿瘤的发生、发展和转移依赖于肿瘤血管形成，只有在新生血管形成以后，肿瘤才能生长，并向周围组织浸润，进入血液循环向其他部位转移，成纤维细胞生长因子受体 4(FGFR4)在胚胎组织、成人微小血管壁和乳腺癌、胰腺癌、肾癌等组织中有较高表达，而且特异性表达于成熟的肝细胞。近年来，众多学者开展FGFR4在肿瘤生长、发生过程中的研究工作，研究结果表明FGFR4在黑色素瘤、前列腺癌、头颈癌、乳腺癌、肝癌中表达量较高，同时，FGFR4介导了肿瘤细胞化疗耐药性(chemoresistance)，因此，FGFR4对细胞生长调控的作用引起了国内外学者的关注。
发明内容
本发明解决的问题在于提供一种FGFR4高表达的重组HEK293细胞，及利用该细胞进行抗肿瘤药物的筛选，可以作为采用小分子抑制剂阻断FGFR4表达来治疗肿瘤耐药性的细胞模型。本发明是通过以下技术方案来实现一种FGFR4高表达的重组HEK293细胞，该重组细胞是以HEK293细胞为宿主细胞， 转染宿主细胞的外源性表达载体的是包含FGFR4全长基因的表达载体。所述的FGFR4全长基因的核苷酸序列如SEQ. ID. NO. 1所示。所述的包含FGFR4全长基因的表达载体是pcDNA3. 1 (+)_FGFR4，该表达载体是通过BamHI酶切位点将FGFR4全长基因克隆入真核表达载体pcDNA3. 1⑴。所述的FGFR4高表达的HEK293-FGFR1重组细胞应用于抗肿瘤药物筛选。所述的应用是将FGFR4高表达的HEK293-FGFIU重组细胞构建成细胞膜色谱柱，以保留时间为指示，筛选以FGFR4为靶点的抗肿瘤药物。与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果1、本发明构建了成纤维细胞生长因子受体4(FGFR4)的真核表达载体 pcDNA3. 13. 1 (+) /FGFR4,经过克隆测序证实序列同NCBI数据库中的人FGFR4序列一致； 经过脂质体法转染HEK293细胞，G418抗性筛选获得能够稳定生长、存活的细胞株，经过 Western blot检测，筛选出稳定、高表达FGFR4的重组HEK293/FGFR4细胞株；本发明构建的包含FGFR4基因全长的重组HEK293/FGFR4细胞株能够稳定表达 FGFR4，具有完整的分子结构。2、作为宿主细胞的HEK293细胞为原代人胚肾细胞转染V型腺病毒(Ad5)DNA的永生化细胞，该细胞本身还有的各种受体表达量相对较低，而重组后的HEK293/FGFR4细胞表达的FGFR4的相对表达量较HEK293空载明显升高，相对于其他细胞表面分子占据优势表达量，处于特异配体结合优势地位，这样就大大提高了以FGFR4为药物筛选靶标的特异性及灵敏性。3、重组后的HEK293/FGFR4细胞表达的FGFR4利用免疫荧光检测其在细胞膜上的表达情况，显示细胞膜上有FGFR4表达，并体现出FGFR4的分子活性。4、由于重组细胞所表达的FGFR4的识别能力，而且FGFR4表达量足够，使得其与配体的结合能力成为其筛选的依据成功地建立了稳定高表达FGFR4的HEK293/FGFR4细胞膜色谱柱进行的药物筛选模式，能够与FGFR4相结合的化合物或活性成分其保留时间明显延长，这说明以保留时间为指示，该细胞膜色谱能够应用于抗肿瘤药物的筛选，尤其是对活性成分较多的抗肿瘤中药活性成分的筛选。
图Ι-a 图Ι-b是扩增FGFR4基因及线性化载体电泳检测图谱；
图2pcDNA3. 1 (+) /FGFR4重组载体转染大肠杆菌DH5后，提取质粒菌液PCR鉴定结果；图3是经G418抗性筛选的阳性细胞培养图；图4是Wfestern blot分析阳性细胞FGFR4表达量；图5是免疫荧光分析FGFR4在FGFR4/HEK293细胞表达定位；图6是HEK293/FGFR4细胞生长曲线；图7是吉非替尼在HEK293/FGFR4和HEK293细胞膜色谱的色谱图对比。
具体实施例方式本发明在构建FGFR4全长基因的真核表达载体pcDNA3. 1 (+)/FGFR4的基础上，转染HEK293细胞，获得稳定、高表达FGFR4的重组HEK293/FGFR4细胞株，下面是对本方面做得详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。本发明是以pcDNA3. 1 (+)为基础载体，具体选择HindIII和BioI酶切位点作为连接外源基因的多克隆位点。1)FGFR4 基因克隆选择包含FGFR4基因全长cDNA序列p0TB7/FGFR4质粒作为模板进行克隆，采用 Primer Premier5. 0软件设计相应的特异性引物，并在两端分别加入HindIIlAhoI酶切位点FGFR4-HindIII :5’ -AGTAAGCTTATGCGGCTGCTGCTGGCCCT-3‘FGFR4-XhoI :5’ -GATCTCGAGTCATGTCTGCACCCCAGACC-3’采用Takara公司LA Taq进行扩增，PCR反应体系为DNA聚合酶0. 2 μ L、 IOXLAbuffer 2. 5 μ L、dNTP 4 μ L、上游弓 | 物(10 μ mol/L) 2 μ L、下游引物(lOymol/ L)2y L、模板 DNA(p0TB7/FGFR4 质粒)1 μ L、BSA (5 μ mol/L)、ddH20 11. 3 μ L，共 25 μ L。首次95°C变性3min,再经过35个循环作用(94°C变性Imin，60°C复性Imin，72°C延伸3min)， 最后72°C延伸lOmin，得到大量目的片段，对产物采用商品化PCR纯化试剂盒将扩增产物纯化，FGFR4cDNA扩增结果检测如图所示，M为marker，结果表明扩增到了预期的基因。2)重组表达载体构建利用HindIIIAhoI双酶切真核表达载体pcDNA3. 1 (+)和FGFR4基因纯化产物， 酶切体系为HindIII 1 μ L、XhoI 1. 5μ LUOXM buffer 2 μ L、扩增的 FGFR4 片段和环状 pcDNA3. 1 (+) 10 μ L、ddH20 5. 5 μ L37°C 反应 3h，对 pcDNA3. 1 (+)载体酶切产物采用商品化 PCR产物纯化试剂盒将扩增产物纯化，pcDNA3. 1 (+)载体酶切产物电泳结果如图l_b所示， M 为 marker。将线性化载体同酶切后的FGFR4扩增片段4°C条件下，T4DNA Iigase作用下过夜连接，反应体系为，酶切后的线性pcDNA3. 1 (+) 2、酶切后的FGFR4片段6 μ L、T4DNA Iigase 1 μ L、iMbuffer 1 μ L,得到重组 pcDNA3. 1 (+) /FGFR4 表达载体。按照分子克隆实验指南制备大肠杆菌DH5 α感受态细胞，将重组pcDNA3. 1 (+) / FGFR4质粒加入200 μ L感受态细胞中，冰浴30min，42°C热激90s，加入无氨苄青霉素抗性 LB液体培养基，37°C振摇lh，3000rpm离心3min，将菌体沉淀吹打均勻，加入含有氨苄青霉素抗性(lOOmg/mL) LB固体培养基中，37°C过夜培养，挑取单克隆在含有氨苄青霉素抗性(100mg/mL) LB液体培养基中扩大培养，采用商品化试剂盒获得高纯度质粒，菌液PCR初步鉴定阳性克隆(结果如图2所示)，并送ABI PRISM 3730DNA自动测序仪测序，验证序列碱基，DNAstar Seqman进行序列拼接，得到的测序结果如SEQ. ID. NO. 1所示，测序结果与基因库(NCBI)中比对，序列一致性为100%，含有正确序列即为pcDNA3. l(+)/FGFR4重组表达载体。3)高表达FGFR4重组HEK293细胞构建①使用hvitrogen公司脂质体转染试剂LipofectAMINE 2000进行转染常规培养HEK293细胞，在6孔板中接种3 X IO5细胞/孔，加入2mL完全培养基，置CO2孵箱中37°C 培养过夜，待细胞长至50-80%时进行转染。在无菌离心管中配制如下溶液溶液A 将1-2 μ g待转染的超纯DNA稀释到100 μ L无血清培养基中。溶液B 将2-25 μ LLipofectAMINE稀释到100 μ L无血清培养基中。混合溶液A和B，轻轻混勻，室温放置15 45min。用2mL无血清培养基轻轻洗涤细胞，加入0. SmL无血清培养基/孔，将脂质体复合物滴加到孔中，轻轻摇晃混勻，置CO2孵箱中37°C孵育他。用完全培养基替换转染液，继续培养。HEK293细胞的筛选浓度为600yg/ mL。转染72小时后按1 10的比例将转染细胞在6孔板中传代，换为含G418的选择培养基。在6孔板内可见单个细胞，继续培养14天左右，可见单个细胞分裂增殖形成单个抗性集落，如图3所示。②有限稀释法抗性集落细胞消化下来后做连续的10倍稀释(10_2 10_1(1)，将每一稀释度的细胞滴加到96孔板中培养，15天左右细胞长满整个孔，胰酶消化，传代至大瓶培养，反复冻存、培养细胞两次。4)高表达FGFR4重组HEK293鉴定①Western Blot :4°C条件下，将转染 FGFR4、转染 pcDNA3. 1(+)的 HEK293 细胞和 HuH7细胞株，按1.5 X IO6个细胞加入200 μ L细胞裂解液(加入蛋白酶抑制剂PMSF)的比例裂解细胞，加入150 μ Lloading buffer，沸水浴lOmin，提取细胞总蛋白进行SDS-PAGE电泳，用PVDF膜完成全湿电转印，后用含5%脱脂奶粉的TBST室温封闭转移后的PVDF膜，经 TBST洗涤加经过5% BSA的TBST稀释的特异性一抗与靶蛋白4°C过夜孵育，TBST洗涤3次后，再加5% BSA的TBST稀释的辣根过氧化物酶偶联的二抗，用ECL化学发光检测蛋白表达，检测HEK293/FGFR4细胞FGFR4蛋白表达。经检测，如图4所示，F6、F9、F12、F24、F28 为筛选的转染了 pcDNA3. l(+)/FGFR4的细胞克隆，P13为转染空载的重组HEK293细胞，克隆F28、克隆F24、克隆F6的FGFR4表达量较克隆P13的表达量均有提高，而以克隆F28的 FGFR4表达量最高。②免疫荧光分析FGFR4表达定位取对数生长期的pcDNA3. 1(+)空载细胞和 pcDNA3. 1⑴/FGFR4细胞，0. 25 %胰蛋白酶消化，按1 X IO5个/孔左右接种于放有多聚赖氨酸预处理的无菌盖玻片的6孔板中，培养24h细胞贴壁后，弃去培养基，用PBS轻轻洗涤爬有细胞的盖玻片三次。4%以PBS (pH= 7.4)溶解多聚甲醛ImL固定细胞15min，后弃去。 PBS轻柔洗涤细胞2次，加入ImL含牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA)的PBST 孵育细胞30min。用含牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA)的PBST以1 50 稀释兔抗人FGFR4多克隆抗体，加到盖玻片上，室温孵育45min。PBS轻轻洗涤三次。每次 5min。用含BSA的PBST以1 100稀释FITC标记山羊抗兔IgG 二抗，滴加到爬片上，室温避光孵育lh。于暗处，PBS洗涤三次，每次5min。在载玻片上滴加90%甘油封片，注意不要产生气泡。用荧光显微镜观察并拍照，结果如图5所示，其中A为pcDNA3. 1 (+)/FGFR4 细胞克隆观免疫荧光结果，B为pcDNA3. 1(+)细胞免疫荧光结果，两者对比明显发现前者具有FGFR4免疫荧光的绿色荧光，而后者没有；这表明重组细胞中FGFR4得到了有效的表达。④取生长良好接近汇合的细胞，用0. 25%胰酶消化，用新培养基制成细胞悬液，计数。根据细胞计数结果稀释细胞悬液至浓度为1 X IO4个/mL，每25mL小瓶接种2mL细胞悬液，共接种30瓶细胞。24h后开始计数细胞，以后每隔24h计数一次，连续计数10d。每次取3瓶细胞，分别计数，计算平均值。每隔3d给未计数的细胞换液。根据细胞计数结果，以时间为横坐标，细胞数为纵坐标，绘制生长曲线，结果如图6所示，与没有转染FGFR4的对照细胞相比较，转染了 FGFR4的细胞在培养6d后生长速度明显加快，表现出FGFR4特有的刺激效果，进一步可以证明重组细胞的基于FGFR4信号通路也能够被相应的激活，从而体现在生长速度的加快；另一方面说明在经过较短的时间培养之后就可以获得一定数量的重组细胞。5)细胞膜色谱检测HEK293/FGFR4和HEK293对吉非替尼的保留时间由于作为宿主细胞的HEK293细胞为原代人胚肾细胞转染V型腺病毒(Ad5)DNA的永生化细胞，该细胞本身还有的各种受体表达量相对较低，而重组后的HEK293/FGFR4细胞表达的FGFR4的相对表达量较HEK293空载明显升高，相对于其他细胞表面分子占据优势表达量，处于特异配体结合优势地位，这样就大大提高了以FGFR4为药物筛选靶标的特异性及灵敏性。而且重组的细胞表现出FGFR4相应的活性。那么，高表达FGFR4的HEK293/FGFR4细胞可以作为采用小分子抑制剂阻断FGFR4 表达来治疗肿瘤耐药性的细胞模型，更进一步，可以应用于抗肿瘤药物的筛选将FGFR4高表达的HEK293-FGFIU重组细胞构建成细胞膜色谱柱，以保留时间为指示，筛选以FGFR4为靶点的抗肿瘤药物。高表达FGFR4的HEK293/FGFR4细胞膜色谱柱平衡后进行样品检测(用包含吉非替尼(1.16mg/ml)的甲醇上样)，以5mmol/L (pH 7.4)醋酸铵缓冲液为流动相，结果发现吉非替尼在该细胞膜上有很好的保留，同时以未转染的HEK293细胞作为阴性对照。吉非替尼在HEK293/FGFR4和HEK293细胞膜固定相的保留色谱图对比如图7所示所示，横坐标为时间(分钟)。以5mmol/L(pH 7. 4)醋酸铵缓冲液为流动相，吉非替尼在两者的的保留时间分别为12min和6min。这是由于HEK293/FGFR4细胞膜色谱柱上高表达的 FGFR4与吉非替尼发生了结合，延迟了吉非替尼被洗脱的时间，表现出了对能够与FGFR4相结合的抗肿瘤药物的特异性的结合的能力，并且以保留时间作为指示，可以作为筛选的标记。因此，HEK293/FGFR4细胞株在细胞膜色谱分析筛选活性化合物上，具有灵敏性高、 结合力强的优点，可以应用于针对FGFR4靶点的抗肿瘤药物的筛选，尤其是应用于活性成分较多的抗肿瘤中药活性成分的筛选上。
权利要求
1.一种FGFR4高表达的重组HEK293细胞，其特征在于，该重组细胞是以HEK293细胞为宿主细胞，转染宿主细胞的外源性表达载体的是包含FGFR4全长基因的表达载体。
2.如权利要求1所述的FGFR4高表达的重组HEK293细胞，其特征在于，所述的FGFR4 全长基因的核苷酸序列如SEQ. ID. NO. 1所示。
3.如权利要求1所述的FGFR4高表达的重组HEK293细胞，其特征在于，所述的包含 FGFR4全长基因的表达载体是pcDNA3. 1 (+) -FGFR4，该表达载体是通过BamHI酶切位点将 FGFR4全长基因克隆入真核表达载体pcDNA3. 1⑴。
4.权利要求3所述的FGFR4高表达的HEK293-FGFIU重组细胞应用于抗肿瘤药物筛选。
5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，将FGFR4高表达的HEK293-FGFIU重组细胞构建成细胞膜色谱柱，以保留时间为指示，筛选以FGFR4为靶点的抗肿瘤药物。
全文摘要
本发明公开了一种FGFR4高表达的重组HEK293细胞及其应用，该重组细胞是以HEK293细胞为宿主细胞，转染宿主细胞的外源性表达载体的是包含FGFR4全长基因的表达载体。FGFR4高表达的HEK293-FGFRl重组细胞应用于抗肿瘤药物筛选。
文档编号C12N5/10GK102337247SQ20111026967
公开日2012年2月1日 申请日期2011年9月13日 优先权日2011年9月13日
发明者侯晓芳, 张涛, 李淼, 杜晖, 王嗣岑, 贺浪冲 申请人:西安交通大学