专利名称：一种丙型肝炎病毒核心抗原及其抗体以及分泌该抗体的杂交瘤细胞株的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种针对我国丙型肝炎病毒感染流行株的核心抗原，以及对该抗原具有特异性的抗体，以及能够分泌产生该抗体的杂交瘤细胞株。
背景技术：
丙型肝炎是由丙型肝炎病毒(h印atitis C virus, HCV)感染引起的传染病，已经成为继乙肝、艾滋病后又一种引起全球性关注的病毒性传染病。目前，全世界丙型肝炎病毒携带者约有1. 7亿人，且以300 400万人/年的速度递增；我国受感染者在6，000万人以上，平均感染率为3.2%，属中高流行区域，HCV基因型以Ib和加为主，其中Ib型占到70% 以上。HCV感染易慢性转化，80-85% HCV感染者发展为慢性丙型肝炎，其中20%发展为肝纤维化，最终有4-5%肝纤维化患者发生肝细胞性肝癌，是导致肝硬化、肝细胞性肝癌的重要因素。一些数据显示，未来20年内与HCV感染相关的死亡率将继续增加。及早对HCV 感染者进行诊断并给予正确治疗是减缓疾病进展、降低死亡率的关键。由于HCV高度变异且机体免疫与HCV感染的复杂机理使丙型肝炎疫苗的研制困难重重，短期内难有突破性进展。虽然干扰素对慢性丙型肝炎有一定疗效，但疗程长、价格昂贵、毒副作用大且易反弹。目前国内主要应用血清学的抗HCV/EIA检测抗体，由于窗口期的存在，经抗体筛选后，临床上仍有部分输血后丙肝发生。HCV病毒学的检测操作复杂、容易污染，价格昂贵，很难用于大规模筛查。建立高灵敏度、特异性和稳定性的HCV抗原早期检测方法，缩短检测窗口期，可有效防止传播，而获得高特异性的单克隆抗体又是其中的关键。丙型肝炎病毒基因组两端的非编码区及编码核心蛋白的区域是HCV基因组中最保守的区域。其N端前120个氨基酸构成了主要的亲水结构域，具有很强的免疫原性。该区氨基酸序列保守，含有多个线性表位， 不同病毒分离株的氨基酸约90%同源。高度保守的HCV核心蛋白是HCV早期诊断必不可少的抗原之一。制备针对我国HCV流行株的特异性鼠单克隆抗体，对丙型肝炎病毒核心抗原检测方法的建立具有重要意义和应用价值。采用鼠-鼠杂交瘤技术制备的单克隆抗体至今仍是诊断试剂的重要来源之一，技术较为成熟，因其特异性强，能够减少可能的交叉反应，从而可以提供较准确的检验结果， 均一性和生物活性单一性的优点也利于进行标准化和规范化的质量管理。
发明内容
针对上述现有技术，本发明提供了一种针对我国丙型肝炎病毒感染流行株的核心抗原，以及对该抗原具有特异性的抗体，以及能够分泌产生该抗体的杂交瘤细胞株(两株)，本发明提供的单克隆抗体，能够高特异性地结合HCV核心抗原，具有较高的亲和力，可用于我国人群HCV早期诊断核心抗原检测试剂盒的研制。本发明是通过以下技术方案实现的
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一种丙型肝炎病毒核心抗原，其氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所示，是由核苷酸序列为SEQID NO. 2所示的DNA编码的多肽。一株分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株，该杂交瘤细胞株为SC16-H6，命名为鼠-鼠杂交瘤细胞，已于2011年07月14日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No. 5074。另一株分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株，该杂交瘤细胞株为SC23-G5，命名为鼠-鼠杂交瘤细胞，已于2011年07月14日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No. 5075。所述杂交瘤细胞株是由免疫的Balb/c小鼠脾细胞和鼠骨髓瘤细胞SP2/0经融合、 筛选、克隆、传代和反复冻存、复苏后获得的小鼠杂交瘤细胞系，能稳定分泌单克隆抗体。一种抗丙型肝炎病毒核心抗原的单克隆抗体，是由保藏编号为CGMCC No. 5074的杂交瘤细胞株或保藏编号为CGMCC No. 5075的杂交瘤细胞株分泌产生的，其对SEQ ID NO. 1 所示的多肽具有特异性。一种制备所述单克隆抗体的方法，包括用SEQ ID NO. 1所示的多肽免疫Balb/c 小鼠，取小鼠脾脏细胞与骨髓瘤细胞融合，筛选出能够分泌对SEQ ID NO. 1所示的多肽具有特异性的单克隆抗体的杂交瘤细胞，从杂交瘤细胞上清液中或从注射杂交瘤细胞的动物腹水中，获得所述单克隆抗体。本发明提供的丙型肝炎病毒核心抗原，是通过从我国HCV病人血清中提取RNA并克隆出的HCV核心区片段，为HCVlb/加亚型的核心区前3-120个氨基酸的蛋白，涵盖了多个线性表位，主要针对我国HCV感染流行株，可用于免疫小鼠制备单克隆抗体和免疫家兔制备多克隆抗体，其具有抗原性强、纯度高、稳定性好等优点。本发明提供的两株杂交瘤细胞株，能够稳定、高效分泌抗HCV鼠单克隆抗体，具有较高的亲和力，对建立HCV核心抗原检测方法具有重要的应用价值。本发明提供的单克隆抗体，可以用于检测丙型肝炎病毒核心抗原，也可以用于制备检测试剂盒，所述检测试剂盒含有与标记物结合的单克隆抗体，所述标记物为荧光标记物、放射性标记物或酶标记物。具体用途如下直接用途建立可以同时检测丙型肝炎病毒突变株和野生株在内的丙型肝炎病毒核心抗原的临床检测实验技术，包括ELISA，胶体金免疫渗析，多种丙型肝炎病毒抗原的固相与液相分析，以及多种免疫病理检测技术等。间接用途采用本发明提供的杂交瘤细胞株分泌抗体所开发的实验技术与试剂， 可广泛地用于丙型肝炎的基础、临床与流行病学研究。本发明的有益效果主要体现在提供了一种针对我国人群HCV的单克隆抗体，以及产生该单克隆抗体的杂交瘤细胞株，在本发明基础上可建立灵敏、可靠的检测方法，为评估其对于诊断、预后及临床治疗效果检测提供了理论基础，具有重大应用前景。
杂交瘤细胞株SC16-H6，命名为鼠-鼠杂交瘤细胞，已于2011年07月14日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No. 5074。杂交瘤细胞株SC23-G5，命名为鼠-鼠杂交瘤细胞，已于2011年07月14日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No. 5075。图1为抗原酶切电泳示意图。
图2为蛋白抗原性western鉴定示意图。图3A为纯化蛋白电泳示意图。图3B为纯化蛋白western鉴定示意图。图4为抗原指数分析示意图。图5为染色体分析示意图。图6为单克隆抗体亚型电泳示意图。图7为单克隆抗体特异性鉴定示意图。
具体实施例方式下面结合附图对发明作进一步的说明。实施例一免疫原的制备1.设计并合成HCV核心区基因片段引物序列(由上海博尚生物技术有限公司合成)JnSEQ ID NO. 3、4 所示。2.提取HCV感染患者(用于HCV RNA提取的20例HCV血清样本来自山东大学齐鲁医院收集的HCV-RNA阳性但HCV抗体阴性患者，其中男性16例，女性4例，平均年龄45 岁，经基因分型检测结果为13例Ib亚型，7例2a亚型)血清RNA，进行逆转录PCR，反应体
系如下
引物(特异性引物) 2μ1 cDNA1.5μ1
Mix12.5μ1
DEPC9μ1按下述条件进行PCR反应941308，551308，721308，35个循环后，721IOmin03.琼脂糖凝胶电泳后胶回收目的PCR产物与pMDIS-T载体连接，转化到DH5 α工程菌中。挑取单菌落摇菌抽提质粒，经酶切鉴定，对确认获得目的片段的工程菌进行测序鉴定。4.将重组质粒及PET_30a分别用NdeI和HindIII双酶切，琼脂糖凝胶电泳后胶回收目的片段，经T4连接酶连接，转化到BL21-DE3感受态，挑取单菌落摇菌后以PCR法筛选阳性克隆，扩增产物以琼脂糖凝胶电泳进行鉴定(如图1所示，1、2、3、4、5代表5株菌、M 代表marker)，送测序。5.阳性克隆的高效诱导表达(1)小量诱导表达筛选高效表达克隆并鉴定HCV抗原的抗原性将测序结果正确(测序结果为SEQ ID N02所示，即为正确)的菌37°C活化12h 后，按1 100的浓度接种培养基，37°C摇菌3h，加入异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导4h。 各取诱导后的菌液浓缩加上样液做PAGE电泳，考马斯亮蓝染色肉眼观察目的条带，初步筛选出高效表达的克隆。用SDS-PAGE、His标签抗体和HCV多克隆抗体作Western blot,鉴定工程蛋白抗原性(图2)，由图2可 以看出，该菌诱导后所表达的蛋白含有His标签，可应用镍柱进一步纯化，并且对HCV具有较好的亲和力。(2)优化诱导条件以不同温度、不同诱导时间和不同IPTG浓度作梯度诱导表达，温度分别为20°C、 25°C、30°C、37°C，诱导时间为 lh、2h、4h、6h、8h、24h，IPTG 浓度分别为 0. 1、0. 3、0. 5、1. 0、 3. 0mmol/Lo收集不同条件下诱导的菌液检测蛋白表达量，并超声后明确蛋白存在形式。最佳诱导条件37°C、IPTG浓度为1. Ommol/L诱导4h。蛋白存在主要形式为包涵体。(3)重组蛋白的大量表达及纯化以上述条件诱导大量菌液，4°C SOOOrpm离心收集菌体，PBS洗后20倍浓缩，_40°C 过夜，冰浴中进行超声破碎，12000rpm离心收集蛋白包涵体，按10 1加入裂解液， 370C 3h，用饱和的尿素溶解并进一步经镍柱纯化，洗脱产物经透析除尿素。BCA法测定蛋白浓度。(4)HCV核心蛋白抗原性的鉴定纯化蛋白SDS-PAGE及Western Blot见图3，抗原指数分析见图4。SDS-PAGE方法鉴定镍柱纯化后的抗原纯度，蛋白质上样量为10 μ 1，由图3A可以看出，仅存一条带，纯度较高。用HCV多克隆抗体作Western blot,图3B显示纯化后的蛋白具有较好的抗原性。利用DNAstar-protean软件进行抗原指数分析，如图4所示，该蛋白的抗原表位集中于1_25、 35-42,46-73 和 96-118 氨基酸。实施例二杂交瘤制备单克隆抗体1.动物免疫选取6周龄的Balb/c雌鼠，皮下多点注射免疫原，使用弗氏完全佐剂，按1 1混合，初次免疫10天后，使用不完全弗氏佐剂皮下注射，每周一次，连续三次。末次免疫后，断尾取血，经间接ELISA方法初步鉴定小鼠抗体效价。10天后，加强免疫一次。2.细胞融合融合前，复苏鼠骨髓瘤细胞SP2/0，并用8-氮鸟嘌呤进行筛选培养，保证融合时细胞处于最佳生长状态。融合当天，取鼠腹腔巨噬细胞制备饲养细胞，加入10ml HAT培养液分种于96孔板。免疫小鼠加强免疫三天后，取其脾细胞与鼠骨髓瘤细胞按5-10 1混合，离心后， 尽量吸尽上清，轻击管底，使沉淀细胞松散均勻，逐滴加入40%的PEG40000. 7ml，边加边轻轻搅拌。随后逐滴缓慢加入无血清1640培养基。第一分钟加入0. 7ml，随后补液至10ml， SOOrpm离心5分钟，弃上清。缓慢加入HAT培养基，轻轻吹吸沉淀细胞，后补液至IOml分种于96孔板，370C 5% CO2培养箱中培养。融合3天后，HT培养基替换1/2的HAT培养基，融合5-7天后，完全替换HAT培养基。经观察，细胞融合率可达80%以上。密切观察细胞生长情况，当细胞长至1/2或以上视野时，吸出上清，以间接ELISA方法检测抗体。3.杂交瘤筛选棋盘法确定最佳的免疫抗原包被浓度及酶标抗体工作浓度，采用间接ELISA方法进行杂交瘤细胞筛选。阳性对照为免疫小鼠多抗血清，阴性对照为免疫前小鼠血清，以测定值与对照值的比>2.1为阳性。4.杂交瘤细胞亚克隆化
对阳性克隆采用有限稀释法进行细胞克隆化。克隆化当天，取小鼠腹腔巨噬细胞分种于96孔板。阳性克隆孔进行细胞计数调整细胞密度，按细胞数目为2、1、0. 5个的稀释度种于96孔板，按每个稀释度32孔，每孔IOOul。在37°C，5% C02培养箱中培养7天左右， ELISA进行抗体效价检测。选择抗体效价高的单克隆孔，重复克隆化3次，经ELISA检测确定最终96孔板中克隆化孔100%阳性。建立稳定分泌抗体的细胞株，并进行保藏，分别为 SC23-G5 (CGMCC No. 5075)和 SC16-H6(CGMCC No. 5074)。
5.单克隆抗体制备将单克隆阳性孔细胞先转入24孔，随后转入培养瓶中进行扩大培养。将0. 5ml液体石蜡注入Balb/c小鼠腹腔。7天后每只小鼠腹腔接种0.2ml (约5X IO5)个细胞。5天后每天观察小鼠腹部，当用手触摸时皮肤有紧张感时，即用16-18号针头采集腹水，隔天抽取一次，每只可采5-10ml腹水。离心弃细胞和其它沉淀物，收集上清，测定效价，抗体含量测定分别为6. 5mg/ml、6. Omgml。分装置于_70°C存放。6.单克隆抗体特性的鉴定(1)杂交瘤细胞的染色体分析采用秋水仙素法分析两株杂交瘤细胞的染色体。 镜检时选择染色体分散好，无重叠，无失散的细胞进行观察分析(图5)。具体过程为，在加秋水仙素前48-36小时将杂交瘤细胞传代，在培养瓶中加入终浓度为0. lug/ml的秋水仙素，继续培养6小时，以对数生长期SP2/0细胞为阴性对照。用吸管轻轻吹打细胞，移入离心管中，lOOOr/min离心10分钟，弃上清；加入已预热到37°C的 0. O75mol/LKC1溶液5ml，37°C水浴15分钟；向悬液中加入新配制的固定液(甲醇与冰醋酸3 1混合)1ml，混勻静置2分钟，1000r/min离心10分钟，弃上清；加入固定液5ml，轻吹细胞悬液并混勻，室温静置20分钟，离心弃上清；重复操作一次；然后加5ml固定液，混勻，4°C过夜；取出离心管，lOOOr/min 5分钟，轻轻吸去上清液，加入0. 5ml固定液，吹打混勻后，向预冷的载玻片悬空滴加细胞悬液1-2滴，吹散后在酒精灯火焰上固定。用新配制的 10% Giemsa染液染色20分钟，然后用自来水洗去染液，自然干燥；镜下观察。(2)单克隆抗体亚类鉴定及效价测定采用ELISA法对两株杂交瘤细胞分泌的抗体进行亚类鉴定。具体过程为，PBS稀释亚型抗体，每孔加入100ul，4°C过夜后，PBST洗涤液洗3次；每孔加200ul封闭液，室温作用1小时，洗涤液洗3次；加IOOul杂交瘤细胞培养上清，室温作用1小时，PBST洗3次；每孔加IOOul Ig亚类酶标二抗，室温1小时，PBST洗 5次；加底物显色，判读结果。两株单克隆抗体在SDS-PAGE上呈二条区带(见图6)。以正常SP2/0细胞和相应腹水为阴性对照，将系列稀释的细胞培养上清和诱生腹水加入HCV核心抗原包被的酶标板，100 μ 1/孔，37°C孵育1小时；洗板后，加入1 1000 稀释的HRP标记羊抗鼠IgG，100y 1/孔，37°C孵育1小时；加入显色液显色后终止反应，酶标仪测定0D450nm值，测定值与阴性对照值的比>2. 1判为阳性，以阳性孔的最大稀释度作为单克隆抗体效价。结果显示SC23-G5和SC16-H6细胞培养上清内单克隆抗体效价均约为 1 100，腹水内单抗的效价分别为1 6400和1 12800。(3)单抗特异性的鉴定用Western Blot法对获得的单克隆抗体进行鉴定，将HCV 核心抗原、NS3蛋白抗原及菌体蛋白进行SDS-PAGE电泳，电转移至硝酸纤维膜上，封闭2小时后，加入含单克隆抗体的细胞培养上清，洗膜后加入HRP标记的羊抗鼠IgG，振荡反应1小时，洗膜后加底物显色。初步结果显示，两株单克隆抗体均仅对HCV核心抗原起反应，对其它蛋白抗原及表达核心抗 原的菌体蛋白均不起反应，证明具有较好的特异性(图7)。
权利要求
1.一种丙型肝炎病毒核心抗原，其特征在于其氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所示，是由核苷酸序列为SEQ ID NO. 2所示的DNA编码的多肽。
2.一株分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株，其特征在于该杂交瘤细胞株命名为 SC16-H6，已于2011年07月14日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心， 保藏编号为CGMCC No. 5074。
3.—株分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株，其特征在于该杂交瘤细胞株命名为 SC23-G5，已于2011年07月14日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心， 保藏编号为CGMCC No. 5075。
4.一种抗丙型肝炎病毒核心抗原的单克隆抗体，其特征在于所述单克隆抗体是由保藏编号为CGMCC No. 5074的杂交瘤细胞株分泌产生的，其对SEQ ID NO. 1所示的多肽具有特异性。
5.权利要求4所述的单克隆抗体在检测丙型肝炎病毒核心抗原中的应用。
6.权利要求4所述的单克隆抗体在制备检测试剂盒中的应用，其特征在于所述检测试剂盒含有与标记物结合的单克隆抗体，所述标记物为荧光标记物、放射性标记物或酶标记物。
7.一种抗丙型肝炎病毒核心抗原的单克隆抗体，其特征在于所述单克隆抗体是由保藏编号为CGMCC No. 5075的杂交瘤细胞株分泌产生的，其对SEQ ID NO. 1所示的多肽具有特异性。
8.权利要求7所述的单克隆抗体在检测丙型肝炎病毒核心抗原中的应用。
9.权利要求7所述的单克隆抗体在制备检测试剂盒中的应用，其特征在于所述检测试剂盒含有与标记物结合的单克隆抗体，所述标记物为荧光标记物、放射性标记物或酶标记物。
全文摘要
本发明公开了一种丙型肝炎病毒核心抗原，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，是由核苷酸序列为SEQ ID NO.2所示的DNA编码的多肽。一株分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株，该杂交瘤细胞株命名为SC16-H6，已于2011年07月14日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.5074。另一株分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株，该杂交瘤细胞株命名为SC23-G5，已于2011年07月14日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.5075。一种抗丙型肝炎病毒核心抗原的单克隆抗体，是由保藏编号为CGMCC No.5074的杂交瘤细胞株或保藏编号为CGMCC No.5075的杂交瘤细胞株分泌产生的，其对SEQ ID NO.1所示的多肽具有特异性。
文档编号C12N5/20GK102329378SQ201110272789
公开日2012年1月25日 申请日期2011年9月15日 优先权日2011年9月15日
发明者王丽丽, 王传新, 王顺 申请人:山东大学齐鲁医院