专利名称：一种用于池蝶蚌养殖的微生物制剂的制作方法
技术领域：
本发明属于水产养殖微生物制剂技术领域，具体涉及一种可用于增强池蝶蛘疾病抵抗力和净化养殖水质的微生物制剂。
背景技术：
我国是世界上最早采集和利用珍珠的国家，是世界最大的珍珠生产国，在世界珍珠行业中有着举足轻重的地位。2005年我国淡水珍珠产量已达到1500余吨，占世界珍珠总产量的95%，创造了巨大的经济和社会效益。然而，随着珍珠养殖业的迅速发展，养殖水域的污染也日趋严重，养殖的生态环境正遭受着不同程度的破坏，珍珠蛘的暴发性疾病频繁发生，给整个养殖业造成巨大的经济损失。为了解决这一问题，水产养殖工作者除了通过遗传育种方法筛选出抗病力强的品系外，还从养殖方法、饵料等外部因素入手，来减少珍珠贝染病的机率；或是提高珍珠贝的疾病抵抗力。在这些方法中，一种值得借鉴的手段就是目前在鱼类养殖中大力提倡的生态养殖模式，通过在养殖水体中加入有益微生物，来调节和改善养殖生态环境，控制和减少养殖动物暴发性病害发生。有益微生物是指能够提高水产养殖动物产量、提高其抗病能力及改善水质环境的微生物；用有益微生物制成的制剂，被称为微生态制剂，又称益生素、促生素、竞生素等。通过在养殖水体中或是养殖饵料中加入有益微生物，可以有效的消除水体中的氨氮、硫化氢、 有机酸等有害物质，从而改善水质，平衡酸碱度；并将养殖动物的排泄物、残饵、浮游生物残体等分解成二氧化碳、硝酸盐、磷酸盐等。而这些分解产物又能够作为营养促进单细胞藻类的生长繁殖；单细胞藻类进行光合作用释放氧气，不仅可以给养殖生物提供氧气，还能氧化有机物。因此，制备出一种性能良好的微生物制剂对于淡水珍珠贝的健康养殖具有重要的作用。
发明内容
本发明的目的是提供一种微生物制剂，即一种能够有效的对淡水珍珠贝池蝶蛘的养殖水体进行净化，提高池蝶蛘抗病力的微生物制剂，已弥补现有技术的不足。本发明的微生物制剂，包括有通过生物夺氧，创造厌氧环境供有益菌生长的芽孢杆菌；通过产酸抑制致病菌生长繁殖，合成维生素，促进消化吸收和代谢，克制腐败的乳酸菌；能够促进生长发育并具有生物拮抗和免疫功能，抵制病原微生物的双歧杆菌；能够促进营养物质消化吸收的酵母菌的活菌。同时，为了增强淡水珍珠贝的疾病抵抗力，在本发明的微生物制剂的干粉中又加入了贝类常见的致病菌(溶藻弧菌、副溶血弧菌)的菌体灭菌干粉，以增强珍珠贝的非特异性免疫能力，进一步提高贝类对病源生物的侵扰。本发明用于制备微生物制剂的菌株可以采用任一市售的产品，例如芽孢杆菌采用广东省微生物研究所的枯草芽胞杆菌(Bacillus Subtilis Cohn,GIMI136)；乳酸菌选用植物乳杆菌(LactcAacillus plantarum)，保藏号CGMCC1. 298 ；或是嗜酸乳杆菌，选购自中国普通微生物菌种保藏管理中心，分类命名为嗜酸乳杆菌(LactcAacillus acidophilus)，
3保藏号CGMCC 1.1854。双歧杆菌选用动物双歧杆菌，中国普通微生物菌种保藏管理中心， 商品号CGMCC 1.2268.酵母菌购自中科院微生物菌种库。溶藻弧菌、副溶血弧菌也购自中科院微生物菌种库。本发明微生物制剂，包括有芽孢杆菌、乳酸菌、双歧杆菌和酵母菌的活菌。上述的微生物制剂中活菌的浓度为IO7 109CFU/ml，微生物制剂中活菌以菌液或菌粉形式存在。为了更好的增强本发明制剂的增强免疫效果，在干粉状态的微生物制剂中又加入溶藻弧菌和/或副溶血弧菌的发酵液灭菌干粉。为了防止微生物干粉制剂在放置过程中产生霉变，在干粉制剂中又加入了黑曲霉的发酵液灭菌干粉；黑曲霉可选用购自中国普通微生物菌种保藏管理中心，分类命名为黑曲霉(Aspergillus niger)，保藏号CGMCC 3.316。上述微生物制剂作为饵料添加剂，用于增强养殖淡水珍珠贝的疾病抵抗力。本发明的微生物制剂中包含有芽孢杆菌、乳酸菌、双歧杆菌和酵母菌的活菌，能够有效的促进淡水养殖珍珠的抗病能力，提高珍珠的生长速度，并能够改善水质环境。并且， 在干粉状态的制剂中加入了灭活的溶藻弧菌、副溶血弧菌的菌粉，进一步增强了微生物制剂的免疫增强效果。实际应用表明本发明的制剂相比于对照组明显增强了淡水珍珠池蝶蛘对疾病的抵抗力，并提高了淡水珍珠的生长速率。
具体实施例方式本发明的芽孢杆菌、乳酸菌、双歧杆菌和酵母菌的培养基可选用任一种上述四种菌都适用的配方，也可以是四种菌分别对应的培养基。适用培养基的配方如下=NaCl 0. 5g、 酵母浸出粉0. 3g、琼脂30g、葡萄糖0. 3g，依次溶解到850ml的纯净水中。另外也可以选用四种菌单独使用的培养基，具体如下1、芽孢杆菌的培养基1L蒸馏水+20g葡萄糖+15g蛋白胨+5g氯化钠+0. 5g牛肉膏+20g琼脂；2、乳酸菌培养基(MRS固体培养基)蛋白胨10g、牛肉膏10g、酵母膏5g、 K2HPO4 ·3Η20 2g、乙酸钠 5g、葡萄糖 20g、吐温 801g、柠檬酸二铵 2gMgS04*7H20 0. 58g、 MnSO4 · 4H20 0. 25g，加蒸馏水 lOOOmL，调 PH6. 2-6. 4 在 121°C，15min 灭菌备用；3、双歧杆菌培养基选用BS培养基，可购买自青岛高科园海博生物技术有限公司；4、酵母菌培养基为麦芽汁培养基或马铃薯葡萄糖培养基。溶藻弧菌的培养基可以选用胰胨大豆胨琼脂培养基(TSA+2% NaCl)，副溶血弧菌的培养基为TCBS培养基。下面结合具体实施例对本发明的微生物制剂进行描述。实施例1 菌液形式的微生物制剂将芽孢杆菌、乳酸菌、双歧杆菌和酵母菌的培养基配制好后，分别将菌种按照2% 的接种量接种于培养基中，接入后，在35°C过夜培养M 4 后，或是测量0D600值为0. 5 时停止培养。将各菌的培养液等体积混合，就制成本发明的微生物制剂。制得的微生物制剂中菌的浓度为2.8X109CFU/ml，其中四种菌的菌株数目大致相同，比例为1 1 1 1。
实施例2 菌粉形式的微生物制剂按实施例1中的方法制成菌液制剂后，将混合菌液按照中国发明专利 200310105423. 1所描述的方法进行干燥，具体就是菌液经过高速离心后加入保护剂，在真空冻干机中经180-300分钟降温至-20-50°C时开始抽真空，同时经1000-2000分钟升温至 20-40°C，停止升温并维持180-500分钟即得到菌粉形式的微生物制剂。测试结果表明菌粉中活菌的比例还保存在80 %左右。实施例3 微生物制剂中加入溶藻弧菌、副溶血弧菌的灭菌菌粉将胰胨大豆胨琼脂培养基和TCBS培养基配制好后，分别接入溶藻弧菌和副溶血弧菌的菌种，在36°C过夜培养制成发酵菌液，发酵菌液中的菌数为IO8 109CFU/ml。然后将混合菌液进闪蒸干燥塔干燥，进口温度85°C，出口温度48-50°C，干燥10s，40目粉碎，即得到溶藻弧菌、副溶血弧菌的灭菌菌粉。将溶藻弧菌、副溶血弧菌的灭菌菌粉加入到实施例 2制备的菌粉制剂中，每IOOg实施例2制备的菌粉制剂中分别加入4 8g的溶藻弧菌、副溶血弧菌灭菌菌粉。之所以加入溶藻弧菌、副溶血弧菌的灭菌菌粉，是防止制备的微生物制剂中有致病活菌的存在。但灭活的菌粉蛋白不但不会使养殖的珍珠贝发生病害，菌粉中的抗原蛋白还可诱导池蝶蛘产生非特异的免疫应答，从而提高对病原的抵抗力。实施例4 在菌粉制剂中加入黑曲霉的发酵液灭菌干粉饵料等在放置的过程中如果保藏不善，很容易发生霉变，导致产生玉米赤霉烯酮等有害物质。本发明在菌粉制剂中加入黑曲霉的发酵液灭菌干粉，可以有效地抑制霉变菌的生长，从而使添加了本发明微生物制剂的饵料能够在使用过程中减少霉变的几率，这对于经常处于潮湿状态的淡水珍珠饵料的保存具有重要的作用。首先制备黑曲霉的发酵液灭菌干粉将黑曲霉的菌种接入到PDY培养基(马铃薯 20%，葡萄糖2%，酵母膏)中，在35°C，120 150r/min条件下培养2d。发酵结束后， 将发酵液在120°C干燥10s，40目粉碎，即得到黑曲霉发酵液的干粉。将干粉按质量百分比 1 3%加入到实施例2或3制备的菌粉制剂中备用。实施例5 本发明微生物制剂的应用在两个各挂养700只池蝶蛘的0. 5亩水池中投放IOL实施例1制备的菌液形式的微生物制剂。同时将另外两个相同面积，也是挂养了 700只池蝶蛘的水池作为对照，在同样条件下养殖三个月后，分别统计各个池塘中池蝶蛘的存活率和生长率。结果，在拖放了微生物制剂的两个池塘中，存活的池蝶蛘为632和647只，存活率分别为90%和92%。而对照池塘中存活的池蝶蛘为520和542只，存活率仅为74%和77%。在生长率上，投放了微生物制剂的池塘中池蝶蛘的生长率也有明显提高，并且在贝壳的光泽度上也好于未投放微生物制剂池塘中挂养的池蝶蛘。在另一组实验中，将实施例2中的菌粉形式的微生物制剂添加到池蝶蛘饵料中， 制剂的添加质量百分比为5%，搅拌均勻后投喂池蝶蛘作为实验组，同时对照组投喂没有添加微生物制剂的饵料。在投喂半年后，实验组的池蝶蛘比对照组高出了 20%，这个结果证实了本发明微生物制剂对池蝶蛘抗病能力的提高上是很有效的。同时，在这组实验中还验证了加入的黑曲霉的发酵液灭菌干粉的微生物制剂对饵料保存的效果，结果表明，本发明微生物制剂中添加的黑曲霉的发酵液灭菌干粉能有效防止饵料中霉菌的生长，添加了本发明微生物制剂的饵料在同样的湿度下比对照组的饵料迟了二十天左右才出现了霉变的迹象。同时，黑曲霉灭菌干粉中的蛋白也能用来增强池蝶蛘的非特异免疫效果。
权利要求
1.一种用于池蝶蛘养殖的微生物制剂，包括有芽孢杆菌、乳酸菌、双歧杆菌和酵母菌的活菌。
2.如权利要求1所述的微生物制剂，其特征在于上述活菌的浓度为IO7 109CFU/ml。
3.如权利要求1所述的微生物制剂，其特征在于所述的微生物制剂为菌液制剂或菌粉制剂。
4.如权利要求3所述的微生物制剂，其特征在于所述的菌粉制剂中还添加有溶藻弧菌和/或副溶血弧菌的发酵液灭菌干粉。
5.如权利要求4所述的微生物制剂，其特征在于在所述的菌粉制剂中加入了黑曲霉的发酵液灭菌干粉。
6.权利要求1-5中任一项所述的微生物制剂作为池蝶蛘饵料添加剂的应用。
全文摘要
本发明涉及一种用于池蝶蚌养殖的微生物制剂，该微生物制剂包含有芽孢杆菌、乳酸菌、双歧杆菌和酵母菌的活菌，以及溶藻弧菌、副溶血弧菌和黑曲霉的发酵液灭菌干粉。本发明的微生物制剂中包含有的芽孢杆菌、乳酸菌、双歧杆菌和酵母菌的活菌，能够有效的促进淡水养殖珍珠的抗病能力，提高珍珠的生长速度，并能够改善水质环境。并且，加入了灭活的溶藻弧菌、副溶血弧菌的菌粉，进一步增强了微生物制剂的免疫增强效果。实际应用表明本发明的制剂相比于对照组提高了淡水珍珠池蝶蚌对常见疾病的抵抗力，并提高了淡水珍珠的生长速率。
文档编号C12R1/25GK102304488SQ20111027741
公开日2012年1月4日 申请日期2011年9月19日 优先权日2011年9月19日
发明者王纪军, 王纪卫, 王纪荣 申请人:浙江天地润珍珠有限公司