核糖核酸酶的检测方法及其应用和试剂盒的制作方法

文档序号:398454阅读:590来源:国知局
专利名称:核糖核酸酶的检测方法及其应用和试剂盒的制作方法
技术领域
本发明涉及医学及分子诊断领域,具体而言,涉及一种受试者体液中核糖核酸酶的检测方法、该方法在肿瘤检测中的应用以及一种肿瘤检测试剂盒。
背景技术
早期诊断是疾病尤其是肿瘤治疗中的一个关键环节。通常,人们通过测量血液中的每种肿瘤对应的物质(通常被称为肿瘤标志物)来检测各种肿瘤。所述的肿瘤标志物可定义为“在癌细胞产生的物质中或是在因体内正常细胞与癌细胞相互作用而产生的物质中,可通过对血液、组织和排泄物(尿液和粪便)等进行检查从而用作为癌症诊断或治疗的标志物的物质”。
核糖核酸酶或称RNA酶,是一大类包括数十个种类的、能够将RNA底物水解成小分子核酸的酶。1958年,Miliarese首先提出血清RNase浓度与恶性肿瘤有密切关系。1970年, Reddi首次证实膜腺癌患者血清RNase异常升高(Reddi KK, Holland JF. Elevated serum ribonuclease in patients with pancreatic cancer. Proc Natl Acad Sci USA. 1976, 73(7) :2308-10)。在胰腺癌诊断中,应用最多的是测定血清RNase的浓度,这是由该酶的组织来源的和在血清中的高浓度所决定的。实验证明,RNase酶在胰腺和血清中的含量比其他组织器官高100倍以上,而且血清中提取的RNase在生物化学和免疫学特性与胰腺来源的 RNase非常类似,并且均可被RNase抑制剂所抑制。这些相同的特性表明,血清中的RNase 主要来源于胰腺。
为了检测样本中核糖核酸酶的活性或含量,研究人员在分析底物降解的基础上, 建立了许多技术方案。早期的核糖核酸酶活性检测是建立在Kunitz技术上(Kunitz M. A spectrophotometric method for the measurement of ribonuclease activity. J. Biol. Chem.,1946,164 :563-568)。在该技术中,他们向被检测样本中加入异质性的RNA样本,通过分光光度法检测RNA样本在300nm吸收值的变化 ,计算样本中核糖核酸酶的活性。除了以异质性的核糖核酸分子为底物,另一类核糖核酸酶检测方法是以人工合成的核糖核酸分子为底物,例如寡聚核糖核酸分子。通常情况下,以人工合成的寡聚核糖核酸分子为底物的检测技术具有更高的灵敏度和更好的特异性。其中的代表性技术是1991年由Witmer 等人建立的(Witmer MR, Falcomer CM, Weiner MP, Kay MS, Begley TP, Ganem B and Scheraga HA. U~3' -BCIP a chromogenic substrate for the detection of RNase A in recombinant DNA expression systems. Nucleic Acids Res. , 1991,19 :1-4)。该技术的主要特点是合成了核糖核酸酶底物U-3' -BCIP,该底物在核糖核酸酶的作用下会释放一种报告基团,利用分光光度计在650nm条件下检测报告基团的释放情况,从而计算样本中核糖核酸酶的活性和含量。这些不同的技术方案以及他们的改进方案虽然在一定程度上提高核糖核酸酶活性检测的灵敏度和准确性,但均存在一定的缺陷,不适合作为一个通用的研究手段用于样本核糖核酸酶活性的高通量检测,在技术上还有较大的可改进的空间。
综上所述,本领域迫切需要一种灵敏而特异的基于核糖核酸酶的疾病诊断尤其是肿瘤诊断标志物、以及相应的检测技术。发明内容
为了开发可用于人类疾病尤其是肿瘤早期诊断的生物标志物、以及相应的检测技术,提高人类疾病尤其是肿瘤检测的灵敏度和特异性,发明人对核糖核酸酶降解双链核糖核酸底物的过程及机制进行了广泛而深入的研究,意外地发现绝大多数降解发生在双链核糖核酸底物的两个敏感位点CA/UG和UA/UA位点上。在这一研究结果的基础上,完成了本发明。
—方面,本发明提供了一种核糖核酸酶的检测方法,该方法包括以下步骤1)从受试者个体中获得体液样本;2)使所述体液样本与双链核酸接触,使得所述双链核酸能够被所述体液样本中可能存在的核糖核酸酶切割;3)检测步骤2)中的接触后的产物,从而检测所述体液样本中核糖核酸酶的含量;
其中,所述体液样本为血液、血浆、血清、唾液、组织液和尿液样本中的至少一种;
所述双链核酸为能够被核糖核酸酶切割的双链核酸,其长度为7-30个碱基对,所述双链核酸的第一单链的碱基序列中含有至少一个CA碱基序列或UA碱基序列,第二单链的碱基序列中含有与第一单链中CA碱基序列或UA碱基序列互补的UG碱基序列或UA碱基序列,所述双链核酸的一端连接有能量供体基团,另一端连接有能量受体基团,且所述能量供体基团和能量受体基团之间能够进行能量转移。
根据本发明的一种实施方式,其中,所述双链核酸的长度为7-30个碱基对,优选为 22、23、24、25、26、27、28、29 或 30 个碱基对;还可以优选为 7、8、9、10、11、12、13、14、15、 16、17、18、19、20或21个碱基对,进 一步优选为9、10、11、12、13、14或15个碱基对,还可以进一步优选为7、8、9、10、11或12个碱基对。
根据本发明的一种实施方式,其中,所述双链核酸的第一单链的碱基序列中含有至少一个CA碱基序列,所述双链核酸的第二单链的碱基序列中含有与所述第一单链中CA 碱基序列互补的UG碱基序列。
根据本发明的一个实施方式,其中,所述双链核酸的第一单链的碱基序列中含有至少一个UA碱基序列,所述双链核酸的第二单链的碱基序列中含有与所述第一单链中UA 碱基序列互补的UA碱基序列。
根据本发明的一种实施方式,其中,所述双链核酸的第二单链与第一单链完全互补,所述双链核酸的第一单链的碱基序列优选为5’ -AUGAGCCUGAUUU、5’ -AUGAGCCUAAUUU、 5,-GGCUGCU、5,_GAAUGAGCU、5,_GAGUCAGCUAATCUU、5,-UGGUAUGAGCCUGAUUUUGAU 或 5,-AGC UGGUGGUACAGAUGAUCUUGCAUCGUC,进一步优选为 5’ -AUGAGCCUGAUUU。
根据本发明的一种实施方式,其中,所述双链核酸中含有至少一个脱氧核糖核苷酸基团。
根据本发明的一种实施方式,其中,所述双链核酸中含有至少一个修饰的核苷酸基团。
根据本发明的一种实施方式,其中,所述修饰的核苷酸基团为磷酸基团、核糖基团和碱基中的至少一种被修饰的核苷酸基团,其中,核糖基团被修饰的核苷酸基团为核糖基团的2’ -羟基被修饰的核苷酸基团,所述核糖基团被修饰的核苷酸基团优选为核糖基团的2’ -羟基被甲氧基或氟取代的核苷酸基团。
根据本发明的一种实施方式,其中,所述能量供体基团和所述能量受体基团位于双链核酸的同一条核酸单链上,或者位于不同核酸单链上。优选所述能量供体基团和所述能量受体基团位于同一或不同单链的两端。
根据本发明的一种实施方式,其中,所述能量供体基团为荧光供体基团,所述能量受体基团为荧光受体基团,其中,所述的荧光受体基团优选为荧光淬灭基团。
优选所述突光供体基团为选自突光素(fluorescein)基团、四氯突光素 (tetrachlorofiuorescein)基团、六氯突光素(hexachlorofIuorescein)基团、罗丹明 (rhodamine)基团、四甲基罗丹明(tetramethylrhodamine)基团、花青染料(Cydye)、德克萨斯红(Texas Red)基团、氟硼突光染料(Bodipy dye)基团和亚历克萨突光染料(Alexa dye)基团中的至少一种,更优选为选自6-羧基突光素基团、5-四氯突光素基团、5_六氯突光素基团、6-羧基-X-罗丹明基团、N,N'-对羧苄基吲哚三菁基团和6-羧基四甲基罗丹明基团中的至少一种。
优选所述突光受体基团为选自氮代氧杂蒽(nitrogen-substituted xanthene)基团、取代或未取代的四偶氮苯基苯胺(substituted 4-(phenyldiazenyl)phenylamine)基团、取代或未取代的四偶氮苯基萘胺(substituted4_(phenyldiazenyl)naphthyIamine) 基团,更优选所述荧光受体基团为选自4-(4' - 二甲基对氨基偶氮苯)苯甲酸 (4-(4' -dimethylaminophenylazo)benzoic acid))基团、N, N'-双甲基-N, N'-联苯-4-(5-叔丁氧羰基戍胺)哌唳砜基罗丹明(N, N’ -dimethyl-N, N’ -diphenyl-4- ((5-t-butoxycarbony laminopenty I) minocarbony I) piper idiny lsulf onerhodamine)基团、4 ', 5' - 二硝基突光素(4' , 5' -dinitrofluorescein)基团、氨基哌唳酸(pipe-colic acid amide)基团、4-(4-硝化苯嗪基)苯胺(4-[4_nitrophenyldiazinyl]phenylamine)基团、 4-(4-硝化苯嗪基)萘胺(4- [4_nitrophenyldiazinyl]naphthylamine)基团中的至少一种。
本发明提供上述的检测方法在肿瘤检测中的应用。
根据本发明的一种实施方式,所述应用包括,I)根据上述检测方法分别获得来自于受试者的体液样本和来自于健康对照个体的体液样本中的核糖核酸酶的含量;2)比较来自于受试者的体液样本和来自于健康对照个体的体液样本中的核糖核酸酶的含量,来自于受试者的体液样本中的核糖核酸酶的含量比来自于健康对照个体的体液样本中的核糖核酸酶的含量低,表明该受试者异常;优选地,受试者体液样本中的核糖核酸酶的含量比来自于健康对照个体的体液样本中的核糖核酸酶的含量低30%以上,表明该受试者异常;进一步优选地,受试者体液样本中的核糖核酸酶的含量比来自于健康对照个体的体液样本中的核糖核酸酶的含量低50%以上,表明该受试者异常;最优选地,受试者体液样本中的核糖核酸酶的含量比来自于健康对照个体的体液样本中的核糖核酸酶的含量低70%以上,表明该受试者异常。
根据本发明的一种实施方式,所述健康对照个体的体液样本中的核糖核酸酶的含量可以在需要预测受试者是否为异常时测得,更优选地,也可以预先检测健康对照个体的体液样本中的核糖核酸酶含量,设定其统计学上的取值范围为正常核糖核酸酶含量范围, 这样,针对不同的受试者,只要测定该受试者体液样本中的核糖核酸酶含量,然后以该正常核酸酶含量范围为基准,比较受试者体液样本中核酸酶含量的变化,即可进行特定肿瘤的早期预测或诊断。
其中,所述肿瘤优选为胃癌、结肠癌或肺癌。
另一方面,本发明还提供了一种肿瘤检测试剂盒,其特征在于,该试剂盒含有本发明提供的双链核酸;进一步还优选含有核糖核酸酶标准品。所述标准品即阳性对照品,是已知的具有核糖核酸酶活性的物质。
利用本发明所提供的核糖核酸酶检测底物(即,双链核酸)和检测方法,能够灵敏、准确地检测来源于不同受试者体液中的核糖核酸酶的活性及含量。本发明提供的核糖核酸酶检测方法不仅操作简便,而且大大降低了检测费用,对于多种疾病的早期检测、疗效评价、人群普查等大规模应用均具较高的使用价值。相对于现有技术而言,本发明提供的检测方法具有明显的技术优势,主要包括以下几个方面。
I)检测稳定性相对于现有技术的核糖核酸酶的单链核酸底物,本发明提供的双链核酸底物的稳定性更高,在实际应用中具有更为明显的技术优势。
2)高度特异性本发明是建立在对双链核糖核酸底物中的核糖核酸酶切割敏感位点的基础上完成的,利用所鉴定的核糖核酸酶切割敏感位点,本发明能够实现核糖核酸酶的特异性检测,从而提高了检测的特异性和准确性。
3)定量检测技术在本发明的两个突出的技术特点,即,底物稳定性和高度特异性的基础上,本发明提供的检测方法能够更加稳定地检测样本中核糖核酸酶的活性,并进一步计算出核糖核酸酶的含量,从而建立 了可行的核糖核酸酶定量检测技术,是对现有检测技术的一个重大发展和进步。
4)高通量检测技术本发明提供的利用荧光能量共振转移法检测样本中核糖核酸酶的活性和含量的方法操作简单,适合于作为标准化的检测方法而对大量样本进行高通量、低成本的检测。
5)广泛的适用性本发明提供的双链核酸底物及检测方法可用于建立标准的核糖核酸酶检测体系,及用于分析、比较样本中或样本间不同核糖核酸酶的活性及含量。
本发明提供了一种受试者体液中核糖核酸酶的检测方法及其在肿瘤检测中的应用,以及一种肿瘤检测试剂盒。与现有技术相比,由于本发明提供的检测底物更稳定和更特异,因此尤为适合于临床检测应用;另一方面,本发明建立了一种适合于高通量和大规模应用的定量检测样本中核糖核酸酶的方法,从而为疾病尤其是肿瘤的检测提供了一种简便、 高效的检测技术。


图1为本发明一种实施方式中RNase A处理前的反应体系在500-650nm范围内的荧光光谱。
图2为本发明一种实施方式中RNase A处理后的反应体系在500-650nm范围内的突光光谱。
图3为本发明一种实施方式中酶促反应时的检测时间对荧光强度的曲线。
图4为本发明一种实施方式中RNaseA浓度对K值的曲线。
图5为本发明一种实施方式中健康对照个体与肿瘤个体样本中核糖核酸酶含量
硫代磷酸修饰硼烷化磷酸盐修饰
所述核糖修饰是指对核苷酸戊糖中V -羟基C -0H)的修饰。在核糖的 2'-羟基位置引入某些取代基如甲氧基或氟后,使血清中的核糖核酸酶不易识别小干涉核酸,由此增加了小干涉核酸的稳定性,使小干涉核酸具有更强的抵抗核酸酶水解的性能。对核苷酸戍糖中2'-轻基的修饰包括2'-氟修饰(2' -fiuro modification)、8的比较图。
具体实施方式
本发明中,突光共振能量转移(Fluorescence resonance energy transfer, FRET)是指,当一个荧光基团(又称为荧光供体基团)的荧光光谱与另一个荧光基团(又称为荧光受体基团)的激发光谱相重叠时,荧光供体基团的激发能诱发荧光受体基团发出突光,同时供体荧光分子自身的荧光强度衰减的一种现象。FRET的产生及效率与荧光供体基团与荧光受体基团的空间距离紧密相关,该空间距离在7-10nm时FRET的效率最佳。随着距离延长,FRET呈显著减弱。荧光供体基团和荧光受体基团之间的FRET的效率,可以由E =l/l+(R/Ro)6反映。其中,R表示荧光供体基团和荧光受体基团之间的距离,Rtl表示福氏距离。在福氏距离R0处,荧光供体基团与荧光受体基团间的FRET效率为50%。福氏距离 R0依赖于供体发射谱和受体激发谱的重叠程度、以及供体和受体能量转移的偶极子的相对方位。
应当理解,凡是具有荧光发射光谱和荧光激发光谱重叠的荧光基团,S卩,能够发生 FRET现象的荧光基团组合均能应用于本发明。这些荧光基团组合包括但不限于本说明书中提到的各种荧光基团组合。
本发明中,对双链核酸进行修饰的方式为本领域技术人员所公知。例如,本发明对双链核酸进行的化学修饰为以下的一种或一种以上化学修饰的组合
(I)对双链核酸的骨架结构中连接核苷酸的磷酸二酯键的修饰;
(2)对双链核酸的骨架结构中核糖的修饰;
(3)对双链核酸的核苷酸残基中碱基的修饰。
所述磷酸二酯键的修饰是指对磷酸二酯键中的氧进行修饰,包括硫代磷酸修饰 (Phosphorthioate)和硼烧化磷酸盐修饰(Boranophosphate)。如下式所示分别用硫和硼烧置换磷酸二酯键中的氧。两种修饰都能稳定核糖核酸分子的结构,保持碱基配对的高特异性和高亲和力。
权利要求
1.一种核糖核酸酶的检测方法,该方法包括以下步骤1)从受试者个体中获得体液样本;2)使所述体液样本与双链核酸接触,使得所述双链核酸能够被所述体液样本中可能存在的核糖核酸酶切割;3)检测步骤2)中的接触后的产物,从而检测所述体液样本中核糖核酸酶的含量; 其中,所述体液样本为血液、血浆、血清、唾液、组织液和尿液样本中的至少一种; 所述双链核酸为能够被核糖核酸酶切割的双链核酸,其长度为7-30个碱基对,所述双链核酸的第一单链的碱基序列中含有至少一个CA碱基序列或UA碱基序列,第二单链的碱基序列中含有与第一单链中CA碱基序列或UA碱基序列互补的UG碱基序列或UA碱基序列,所述双链核酸的一端连接有能量供体基团,另一端连接有能量受体基团,且所述能量供体基团和能量受体基团之间能够进行能量转移。
2.根据权利要求1所述的检测方法,其中,所述双链核酸的长度为22、23、24、25、26、27、28、29或30个碱基对。
3.根据权利要求1所述的检测方法,其中,所述双链核酸的长度为7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20 或 21 个碱基对。
4.根据权利要求3所述的检测方法,其中,所述双链核酸的长度为9、10、11、12、13、14或15个碱基对。
5.根据权利要求3所述的检测方法,其中,所述双链核酸的长度为7、8、9、10、11或12个碱基对。
6.根据权利要求1-5中任意一项所述的检测方法,其中,所述双链核酸的第一单链和第二单链完全互补,所述第一单链的碱基序列为5’ -AUGAGCCUGAUUU、5’ -AUGAGCCUAAUUU、5,-GGCUGCU、5,_GAAUGAGCU、5,_GAGUCAGCUAATCUU、5,-UGGUAUGAGCCUGAUUUUGAU 或 5,-AGCUGGUGGUACAGAUGAUCUUGCAUCGUC。
7.根据权利要求1-5中任意一项所述的检测方法,其中,所述双链核酸的第一单链和第二单链完全互补,所述第一单链的碱基序列为5’ -AUGAGCCUGAUUU。
8.根据权利要求1-7中任意一项所述的检测方法,其中,所述双链核酸中含有至少一个脱氧核糖核苷酸基团。
9.根据权利要求1-8中任意一项所述的检测方法,其中,所述双链核酸中含有至少一个修饰的核苷酸基团。
10.根据权利要求9所述的检测方法,其中,所述修饰的核苷酸基团为磷酸基团、核糖基团和碱基中的至少一种被修饰的核苷酸基团。
11.根据权利要求10所述的检测方法,其中,核糖基团被修饰的核苷酸基团为核糖基团的2’ -羟基被甲氧基或氟取代的核苷酸基团。
12.根据权利要求1-11中任意一项所述的检测方法,其中,所述能量供体基团和所述能量受体基团位于同一条核酸单链上。
13.根据权利要求1-11中任意一项所述的检测方法,其中,所述能量供体基团和所述能量受体基团位于不同核酸单链上。
14.根据权利要求1-13中任意一项所述的检测方法,其中,所述能量供体基团为荧光供体基团,所述能量受体基团为荧光受体基团。
15.根据权利要求14所述的检测方法,其中,所述荧光供体基团为选自6-羧基荧光素基团、5-四氯荧光素基团、5-六氯荧光素基团、6-羧基-X-罗丹明基团、N, N'-对羧苄基吲哚三菁基团和6-羧基四甲基罗丹明基团中的至少一种。
16.根据权利要求14所述的检测方法,其中,所述荧光受体基团为选自4-(4’_二甲基对氨基偶氮苯)苯甲酸基团、N,N'-双甲基-N,N'-联苯-4-(5-叔丁氧羰基戊胺)-哌啶砜基罗丹明基团、4',5' -二硝基荧光素基团、氨基哌啶酸基团、4-(4-硝化苯嗪基)苯胺基团和4-(4-硝化苯嗪基)萘胺基团中的至少一种。
17.权利要求1-16中任意一项所述的检测方法在肿瘤检测中的应用。
18.根据权利要求17所述的应用,其中,所述肿瘤为胃癌、结肠癌或肺癌。
19.根据权利要求17或18所述的应用,其中,受试者体液样本中的核糖核酸酶的含量比来自于健康对照个体的体液样本中的核糖核酸酶的含量低。
20.根据权利要求19所述的应用,其中,受试者体液样本中的核糖核酸酶的含量比来自于健康对照个体的体液样本中的核糖核酸酶的含量低30%以上。
21.根据权利要求19所述的应用,其中,受试者体液样本中的核糖核酸酶的含量比来自于健康对照个体的体液样本中的核糖核酸酶的含量低50%以上。
22.根据权利要求19所述的应用,其中,受试者体液样本中的核糖核酸酶的含量比来自于健康对照个体的体液样本中的核糖核酸酶的含量低70%以上。
23.一种肿瘤检测试剂盒,其特征在于,该试剂盒含有权利要求1-16中任意一项所述的双链核酸。
24.权利要求23所述的试剂盒,其中,所述试剂盒还含有核糖核酸酶标准品。
全文摘要
本发明提供一种核糖核酸酶的检测方法,该方法包括以下步骤1)从受试者个体中获得体液样本;2)使所述体液样本与双链核酸接触,使得所述双链核酸能够被所述体液样本中可能存在的核糖核酸酶切割;3)检测步骤2)中的接触后的产物,从而检测所述体液样本中核糖核酸酶的含量。此外,本发明还提供了该检测方法的应用和肿瘤检测试剂盒。利用本发明所提供的核糖核酸酶检测底物和检测方法,能够灵敏、准确地检测来源于不同肿瘤患者血清核糖核酸酶的活性及含量,不仅操作简便,而且大大降低了检测费用,对于多种疾病的早期检测、疗效评价、人群普查等大规模应用均具较高的使用价值。
文档编号C12Q1/68GK103014132SQ201110280179
公开日2013年4月3日 申请日期2011年9月20日 优先权日2011年9月20日
发明者不公告发明人 申请人:苏州瑞博生物技术有限公司
网友询问留言 已有0条留言
  • 还没有人留言评论。精彩留言会获得点赞!
1