专利名称：一株植物乳杆菌r23的制作方法
技术领域：
本发明涉及微生物技术领域，特别涉及一株具有益生特性、产苹果酸乳酸发酵酶的植物乳杆菌R23及其在果酒降酸等方面的应用，该菌为植物乳杆菌属的植物乳杆菌 (Lactobacillus plantarum)，命名为植物乳杆菌R23，该菌已于2011年8月1日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，其保藏号为CGMCC No. 5105。
背景技术：
果酒中高含量的苹果酸会导致酒体酸涩、粗糙感强，苹果酸-乳酸发酵(MLF)是乳酸菌以双羧基的L-苹果酸为底物，在苹果酸-乳酸酶(MLE)催化下转变成单羧基L-乳酸和CO2的过程，此过程可使酒体变柔和，并起到风味修饰作用，是酿造优质果酒的重要生物降酸工序之一。但是果酒中高含量的二氧化硫和酒精浓度、低PH值，以及较低的发酵条件等均抑制了乳酸菌的生长，从而大大降低了乳酸菌的降酸效果；迫切需要选育一种耐高二氧化硫、高酒精度、低PH和酿酒特性好的乳酸菌种。
发明内容
为了解决现有技术所存在的问题，本发明提供了一株植物乳杆菌R23，它不仅高产苹果酸乳酸酶，具有良好的生物降酸能力，而且具有较强的益生特性。本发明技术方案由以下几部分构成方案一一株植物乳杆菌R23 (Lactobacillus plantarum R23)，其特征在于所述植物乳杆菌于2011年8月1日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCCJi 于北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，其保藏号为CGMCC No. 5105。本发明所述的植物源乳杆菌是从自然发酵的“早钟六号”枇杷酒中分离、筛选出的具有较强的益生特性与产酶能力的乳酸菌，命名为植物乳杆菌R23 (Lactobacillus plantarum R23)，简称 R23。所述植物乳杆菌具有以下形态特征菌落直径1.0 1.8mm，呈圆形，表面光滑，边缘完整，中央突起，乳白色，不透明；液体培养无菌膜、无气泡、菌液浑浊、分层明显、菌体不易离心且底部有白色沉淀；细胞形态为杆状或椭圆，杆状菌体大小为 0. 37ymX2. 25 μ m(长X宽)，椭圆状菌体大小为0. 58 μ mX 2. 01 μ m(长X宽)，细胞常呈单个排列，无芽孢，不运动。所述植物乳杆菌具有以下生理生化特性菌株能在15°C以下生长，甲基红试验和 0. 美兰牛乳试验为阳性，兼性厌氧，接触酶试验、氧化酶试验、伏普试验、淀粉水解试验、 吲哚试验、明胶水解试验、硫化氢试验、硝酸盐还原试验、葡萄糖酸盐试验及精氨酸产氨试验均为阴性；糖发酵试验结果表明，所述植物乳杆菌不能代谢山梨醇，对木糖呈阳性弱反应，其它15种碳源均可利用。此外，所述植物乳杆菌具有以下益生特性①较强 的抗逆性能耐受PH值大于等于2. 5的酸度，能耐受高达0. 5%的胆盐浓度；②较强的抗氧化能力所述植物乳杆菌培养24h后的胞外代谢产物，对超氧阴离子自由基和羟自由基的清除率分别达77. 8%和 80. 94% ；③较强的粘附能力表面疏水性达17. 71%。所述植物乳杆菌具有以下发酵特性抗逆能力强，即所述植物乳杆菌能在具有如下一个以上条件的酒体内正常生长SO2 含量120 士 10mg/L;酒精度(ν/ν)13士2% ；ρΗ 值3. 3 士 0.2; 总酸(以苹果酸计)1. 0士0. 2% ；培养温度18 士 2°C。所述植物乳杆菌具有苹果酸乳酸发酵特性，即所述植物乳杆菌产苹果酸乳酸酶， 并且在植物乳杆菌菌体对数生长期内，产苹果酸乳酸酶量及其活力随着植物乳杆菌菌量的增加而增加，在稳定期的4-8h内酶活较高；所述植物乳杆菌菌体产苹果酸乳酸酶的培养条件为发酵温度30士5°C，ρΗ值6. 5士0. 5，L-苹果酸浓度4. 5士0. 5g/L ；各因素对产苹果酸乳酸酶量的影响主次顺序是起始L-苹果酸浓度>发酵温度>起始ρΗ值。所述植物乳杆菌菌体产苹果酸乳酸酶的最适培养条件为发酵温度33. 5°C，ρΗ值 6. 2，L-苹果酸浓度4. Og/L。在此条件下植物乳杆菌R23厌氧发酵28h的产酶量为1. 34mg/ mL,酶活力为462. 33u，总活力为619. 52U。所述植物乳杆菌在枇杷果酒中的生长及苹果酸乳酸发酵特性如下所述植物乳杆菌在枇杷果酒的菌量总体呈下降趋势，厌氧条件能明显提高菌体细胞在枇杷果酒中的存活率和降酸效果；生长曲线的下降趋势与接种量、总二氧化硫浓度、酒精度及发酵温度呈正效应，与PH值呈负效应，完成苹果酸乳酸发酵后菌量下降速率加快；当接种量为108CFU/mL、 总二氧化硫<70!^/1且酒精度<12.7% (体积分数)时，能完全将枇杷果酒中的苹果酸转化为乳酸；当PH值< 3. 3时，苹果酸乳酸发酵无法完成。方案二方案一所述的植物乳杆菌R23在果酒酿造中的应用，其特性在于所述植物乳杆菌在含有苹果酸的果酒中能够优先利用苹果酸，经苹果酸乳酸发酵，实现生物降酸。发酵方法如下将所述植物乳杆菌菌株在种子发酵培养基中活化后，以 9. 8 X IO7 5. 6 X 108cfu/mL接种量接入总硫浓度39.6 - 120. 7mg/L、酒精度10 13%且总酸6. 8 11. 9g/L的果酒中，在22士 1°C下恒温发酵4_5天。所述植物乳杆菌适宜的种子发酵培养基LH18由以下组分构成番茄汁IOOmL,酵母膏7. 4g，牛肉膏10g，葡萄糖30g，硫酸镁0. 36g，苹果酸钠20g，吐温lg，胰蛋白胨15g，柠檬酸铵2g，MnSO4O. 05g，加水补足1L。所述含有苹果酸的果酒包括枇杷酒、猕猴桃酒和刺葡萄酒等①所述植物乳杆菌应用于枇杷酒酿造中，能将高含量的苹果酸转化为乳酸，降低枇杷酒中的苹果酸含量，增加酒体柔和度，提高枇杷酒质量，降酸率达30%以上，柔和指数提高33%以上。②所述植物乳杆菌应用于“中华”猕猴桃酒生物降酸中，总酸下降31 %以上，柔和指数提高27%以上。
③所述植物乳杆菌应用于“溪塔”刺葡萄酒生物降酸中，总酸下降28%以上，柔和指数提高20%以上。方案三 方案一所述的植物乳杆菌R23在生产发酵型无菌果汁饮料中的应用，其特性在于所述植物乳杆菌能用于果汁饮料加工中生产发酵型无菌果汁饮料，所生产的发酵型无菌果汁饮料含有所述植物乳杆菌的益生型代谢产物、细胞碎片或分泌物中的至少一种。方法如下将所述植物乳杆菌菌株的扩培菌液以8. 6 X IO7 2. 1 X 108cfu/ml接种量，接入到无菌发酵罐内，该罐内装有经95 100°C处理2min的果汁，人工调节发酵温度30°C 士2°C、好氧发酵48小时后得到适度乳酸发酵的果汁乳酸发酵液，过滤后进行饮料调配，制成含量在20%的浑浊型乳酸发酵饮料，再灌装杀菌即可。例如所述植物乳杆菌能用于枇杷汁饮料加工中，生产发酵型无菌枇杷汁饮料，所生产的发酵型无菌枇杷汁饮料含有所述植物乳杆菌的益生型代谢产物、细胞碎片或分泌物中的至少一种。所述植物乳杆菌能用于葡萄汁饮料加工中，生产发酵型无菌葡萄汁饮料，所生产的发酵型无菌葡萄汁饮料含有所述植物乳杆菌的益生型代谢产物、细胞碎片或分泌物中的至少一种。所述植物乳杆菌能用于猕猴桃汁饮料加工中，生产发酵型无菌猕猴桃汁饮料，所生产的发酵型无菌猕猴桃汁饮料含有所述植物乳杆菌的益生型代谢产物、细胞碎片或分泌物中的至少一种。方案四方案一所述的植物乳杆菌R23在生产发酵性乳酸菌活菌饮料中的应用，其特性在于所述植物乳杆菌能用于果汁饮料加工中生产发酵型乳酸菌活菌饮料，所生产的发酵型乳酸菌活菌饮料含有活性植物乳杆菌，并含有所述植物乳杆菌的益生型代谢产物、细胞碎片或分泌物中的至少一种。方法如下将该菌株的扩培菌液以8. 6 X IO7 2. 1 X 108cfu/ml接种量，接入到无菌发酵罐内，该罐内装有经95 100°C处理2min的果汁，人工调节发酵温度30°C 士2°C、好氧发酵48小时后得到适度乳酸发酵的活性果汁乳酸发酵液，过滤后进行饮料调配，制成含量在20%的浑浊型活性乳酸发酵饮料，再灌装即可。例如所述植物乳杆菌能用于枇杷汁饮料加工中，生产发酵型枇杷汁乳酸菌活菌饮料，所生产的发酵型乳酸菌活菌饮料含有活性植物乳杆菌，或者含有活性植物乳杆菌以及所述植物乳杆菌的益生型代谢产物、细胞碎片或分泌物中的至少一种。所述植物乳杆菌能用于葡萄汁饮料加工中，生产发酵型葡萄汁乳酸菌活菌饮料， 所生产的发酵型乳酸菌活菌饮料含有活性植物乳杆菌，或者含有活性植物乳杆菌以及所述植物乳杆菌的益生型代谢产物、细胞碎片或分泌物中的至少一种。所述植物乳杆菌能用于猕猴桃汁饮料加工中，生产发酵型猕猴桃汁乳酸菌活菌饮料，所生产的发酵型乳酸菌活菌饮料含有活性植物乳杆菌，或者含有活性植物乳杆菌以及所述植物乳杆菌的益生型代谢产物、细胞碎片或分泌物中的至少一种。方案五含有方案一所述的植物乳杆菌R23的菌剂，其特征在于所述菌剂为直投式发酵齐U，其中含有植物 乳杆菌，活菌数在IO11CfuAil以上。所述菌剂在4-6°C条件下保存1年，活菌数在101(lCfu/ml以上，细胞存活率达70% 以上。所述菌剂可用于果酒降酸、果蔬汁饮料加工、发酵乳制品等。此外，还可对所述植物乳杆菌生产的苹果酸乳酸酶进行提取纯化，制得酶制剂，用于果酒降酸、果蔬汁饮料加工等。较之现有技术而言，本发明所提供的植物乳杆菌不仅具有较强的益生特性，而且高产苹果酸乳酸酶，可在MLE的作用下进行苹果酸乳酸发酵，能有效降低果酒、果汁中的苹果酸、增加乳酸及挥发酯等的含量，从而使果酒、果汁口感更加柔和、协调，气味芳香浓郁， 为提高果酒、果汁品质奠定基础；此外该菌还有一定的抑菌效果，对一些致病菌具有抑制作用。
图1是植物乳杆菌R23和对照菌6045的表面疏水性对比示意图，参见实施例1。图2是植物乳杆菌R23和对照菌6045的抗氧化能力对比示意图，参见实施例1。图3-a是植物乳杆菌R23的生长曲线示意图，参见实施例2。图3-b是植物乳杆菌R23在不同生长期的MLE产量及酶活力示意图，参见实施例 2。图4是发酵温度对植物乳杆菌R23的MLE的影响示意图，参见实施例2。图5是pH值对植物乳杆菌R23的MLE的影响示意图，参见实施例2。图6是L-苹果酸对植物乳杆菌R23的MLE的影响示意图，参见实施例2。图7是NAD+的添加量对植物乳杆菌R23的MLE的影响示意图，参见实施例2。图8是供氧条件对植物乳杆菌R23的MLE的影响示意图，参见实施例2。图9是植物乳杆菌R23的抗氧化能力的阳性对照标准曲线示意图。
具体实施例方式以下将结合实施例说明本发明所述的植物乳杆菌的益生特性，诸如抗逆性、抗氧化能力、粘附能力等；产苹果酸乳酸酶特性，诸如产酶条件、影响因子等；以及植物乳杆菌在果酒酿造、生产发酵型无菌果汁饮料、生产发酵型乳酸菌活菌饮料等方面的应用。实施例1 本发明所述的植物乳杆菌的益生特性1.耐酸及耐胆盐能力将收集的植物乳杆菌R23菌泥和对照菌6045分别用无菌生理盐水洗涤2次，并以原体积的十分之一制成悬悬菌，以的接种量分别接种于PH值为3. 5,3. 0,2. 5,2. 0,1. 5 和胆盐浓度为0%、0. 1%、0. 3%、0. 5%的LH18培养基中，25°C控温培养4h，每2h取样进行活菌计数，平行3次取平均值。各菌株在不同pH值及胆盐浓度环境中培养4h后的菌量变化见表1、表2 植物乳杆菌R23在pH值2. 5环境下培养4h的生物量仍达106CFU/mL，而 6045仅可耐受pH值3. 0的酸度，在pH值2. 5酸性条件下培养4h和2h均已死亡；植物乳杆菌R23可耐受0. 5%胆盐，培养4h后的生物量仍可达107CFU/mL，而6045仅可耐受0. 3% 胆盐浓度。结果表明，植物乳杆菌R23对酸度和胆盐的抗逆能力均优于对照菌6045。
表1各菌株的耐酸能力(lgCFU/mL，i士 s )
权利要求
1.一株植物乳杆菌R23(Lactoabcillus ρlantarum R23)，其特征在于所述植物乳杆菌于2011年8月1日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，其保藏号为 CGMCC No. 5105。
2.根据权利要求1所述的植物乳杆菌R23，其特征在于所述植物乳杆菌具有以下益生特性①较强的抗逆性能耐受PH值大于等于2. 5的酸度，能耐受高达0. 5%的胆盐浓度；②较强的抗氧化能力所述植物乳杆菌培养24h后的胞外代谢产物，对超氧阴离子自由基和羟自由基的清除率分别达77. 8%和80. 94% ；③较强的粘附能力表面疏水性达 17. 71%。
3.根据权利要求2所述的植物乳杆菌R23，其特征在于所述植物乳杆菌具有以下发酵特性抗逆能力强，即所述植物乳杆菌能在具有如下一个以上条件的酒体内正常生长SO2 含量120 士 10mg/L;酒精度(ν/ν)13士2% ；ρΗ 值3. 3 士 0.2;总酸(以苹果酸计)1.0士0.2% ；培养温度18 士 2°C。
4.根据权利要求1所述的植物乳杆菌R23，其特征在于所述植物乳杆菌在枇杷果酒的菌量总体呈下降趋势，厌氧条件能明显提高菌体细胞在枇杷果酒中的存活率和降酸效果。
5.如权利要求1-4中任一项所述的植物乳杆菌R23在果酒酿造中的应用，其特性在于 所述植物乳杆菌在含有苹果酸的果酒中能够优先利用苹果酸，经苹果酸乳酸发酵，实现生物降酸。
6.如权利要求1-4中任一项所述的植物乳杆菌R23在生产发酵型无菌果汁饮料中的应用，其特性在于所述植物乳杆菌能用于果汁饮料加工中生产发酵型无菌果汁饮料，所生产的发酵型无菌果汁饮料含有所述植物乳杆菌的益生型代谢产物、细胞碎片或分泌物中的至少一种。
7.如权利要求1-4中任一项所述的植物乳杆菌R23在生产发酵型乳酸菌活菌饮料中的应用，其特性在于所述植物乳杆菌能用于果汁饮料加工中生产发酵型乳酸菌活菌饮料，所生产的发酵型乳酸菌活菌饮料含有活性植物乳杆菌，并含有所述植物乳杆菌的益生型代谢产物、细胞碎片或分泌物中的至少一种。
8 一种含有权利要求1-4中任一项所述的植物乳杆菌R23的菌剂，其特征在于所述菌剂为直投式发酵剂，其中含有植物乳杆菌，活菌数在IO11CfuAil以上。
全文摘要
本发明涉及一株植物乳杆菌R23(Lactobacillus plantarumR23)，其特征在于所述植物乳杆菌于2011年8月1日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，其保藏号为CGMCC No.5105。所述植物乳杆菌R23不仅高产苹果酸乳酸酶，具有良好的生物降酸能力，而且具有以下所述的较强的益生特性①较强的抗逆性，②较强的抗氧化能力，③较强的粘附能力。所述植物乳杆菌在含有苹果酸的果酒中能够优先利用苹果酸，经苹果酸乳酸发酵，实现生物降酸。所述植物乳杆菌能用于果汁饮料加工中生产发酵型无菌果汁饮料，所述植物乳杆菌能用于果汁饮料加工中生产发酵型乳酸菌活菌饮料。
文档编号C12G3/02GK102358888SQ20111028156
公开日2012年2月22日 申请日期2011年9月20日 优先权日2011年9月20日
发明者任香芸, 何志刚, 庄林歆, 李维新, 林晓姿, 梁璋成, 魏巍 申请人:福建省农业科学院农业工程技术研究所