专利名称：一种耐高温木聚糖酶的高产菌株及利用该菌发酵产耐高温木聚糖酶的方法及得到的酶的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术与工程领域，尤其是一种耐高温木聚糖酶的高产菌株及利用该菌发酵产耐高温木聚糖酶的方法及得到的酶。
背景技术：
木聚糖酶(1，4_β-D-xylanase ;EC3. 2. 1.8)是一种重要的工业用酶，在造纸工业、食品、能源、饲料以及环境等领域中显示了广阔的应用前景，特别是在纸浆生物漂白中的巨大应用潜力早已引起各界的高度关注。木聚糖酶处理各种浆料的作用是降解浆料中的木聚糖，使浆料中半纤维素的含量降低，并使纤维素细胞壁结构变得松弛，同时使与浆中残余木素连接的半纤维素降解，形成脱木素或有利于脱木素的状态。通过木聚糖酶的预处理， 不仅可以提高纸浆的白度，降低打浆的能耗，改善浆料的强度性能，而且，可以减少后继工序漂剂的用量，降低废液的毒性，减轻环境污染。目前，以无元素氯和全无氯漂白工艺为代表的纸浆绿色清洁漂白已经成为世界各国造纸业纸浆漂白发展的必然趋势，木聚糖酶酶法助漂新工艺已在欧洲和北美的30余家大型纸厂得到应用，成为生物技术在造纸工业应用最成功的一例。其中，加拿大已有约10 % 的硫酸盐法纸浆厂采用了该项新工艺。丹麦诺维信公司和美国山道斯化学公司等多家酶制剂厂商，纷纷推出了专门用于纸浆处理的木聚糖酶和纤维素酶新产品，但到目前为止，工业上用于纸浆漂白的木聚糖酶大多是中性偏酸的，最适反应温度大多在50°C左右，众所周知， 纸浆蒸煮和漂白基本都是在高温和强碱的条件下进行的，使得现有的低温酸性木聚糖酶产品在此领域的应用受到了极大的限制，另外，在饲料和食品领域，木聚糖酶应用在饲料的造粒和食品的焙烤工序中，仍然要求所用的木聚糖酶在高温条件下能够保持较高的酶活，因此，研究开发耐高温的木聚糖酶产品将会带来良好的经济效益和社会效益。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足之处，提供一种在高温下有良好的稳定性，适合造纸、食品和饲料等多个工业领域的应用的耐高温木聚糖酶的高产菌株，以及利用该菌发酵产高温木聚糖酶的方法。本发明实现目的的技术方案如下一种耐高温木聚糖酶的高产菌株，分类命名为坎皮纳斯类芽孢杆菌 Gl-IPaenibacillus campinasensis G1-1，菌种保藏号CGMCC No. 5023，保藏日期2011 年 7月1日，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。—种耐高温木聚糖酶的高产菌株发酵产耐高温木聚糖酶的方法，按3%的接种量将该菌的液体种子接种于发酵产酶培养基中，37°C，ISOrpm摇瓶培养4 获得含耐高温木聚糖酶的发酵液；
所述发酵产酶培养基的成分为wt % =NaNO3O. 5，K2HPO4O. 3、MgSO4 · 7H20 0. 03、 MnSO4 · H2O 0. 002、FeSO4 · 7H20 0. 002、CaCl2 · 2H20 0. 002、桦木木聚糖 0. 5，ρΗ7· 0。而且，该耐高温木聚糖酶分离步骤如下(1)发酵液4°C下、8000rpm、离心lOmin，取上清液；(2)向发酵上清液中缓慢加入硫酸铵，使硫酸铵饱和度达到70%，4°C盐析过夜；(3)将盐析过夜的发酵上清液4°C下、8000rpm、离心lOmin，取沉淀，用pH7. O的 PBS缓冲液溶解沉淀，得到耐高温木聚糖酶粗酶液，备用；(4) Octyl Sepharose Fast Flow疏水相互作用层析将粗酶液硫酸铵饱和度调到 40%，进行疏水相互作用层析，柱型φ2.6χ 18cm;平衡液含40%饱和度硫酸铵的0. 02mol/ L PBS缓冲液(ρΗ7. 0)；流速2mL/min，上样后用饱和度为40% 0%的硫酸铵线性洗脱，收集活性组分，待下一步分离用；(5) Sephadex G-75 凝胶过滤层析柱型(pl.6><50cm;平衡液0. 02mol/L PBS 缓冲液(pH8.0)；流速0. 5mL/min。收集活性组分，待下一步分离用；(6) Q-Sepherose 强阳离子交换层析柱型φ2.6><IOcm;平衡液0. 02mol/L PBS 缓冲液(pH8. 0)；流速2mL/min，上样后用含0 1. OM NaCl的平衡缓冲液进行线性洗脱，收集活性组分，备用；(7)将上一步得到的耐高温木聚糖酶样品进行透析除盐，然后冷冻抽干，得到耐高温木聚糖酶干粉。一种耐高温木聚糖酶，由权利要求2或3所述得到的耐高温木聚糖纯酶。而且，所述耐高温木聚糖酶的相对分子量为41. 3KDa。而且，所述耐高温木聚糖酶的最适作用温度为60°C。而且，所述耐高温木聚糖酶的最适作用pH7. 0。本发明的优点和积极效果如下1、本发明提供了一种耐高温木聚糖酶的高产菌株，经菌种鉴定后，命名为坎皮纳斯类芽孢杆菌Gl-I，并对纯化后的木聚糖酶进行了酶学性质研究，发现该酶相对分子量为 41. 3KDa，最适作用温度及pH分别为60°C和7. 0 ；在40°C 70°C和pH 5. 0 9. 0范围内酶活保持相对稳定。2、本发明的木聚糖酶在高温下有良好的稳定性，适合造纸、食品和饲料等多个工业领域的应用，具有广阔的应用前景。
图1本发明产木聚糖酶菌种初筛平板；图2本发明筛选到的P. campinasensis Gl-I和与其16s rRNA序列最相近的12 个菌种构建的系统进化树；图3本发明中P. campinasensis Gl-I的生长及产酶曲线；图4本发明中木聚糖酶的SDS-PAGE图(a)及其酶谱图(b)其中a :1、蛋白Marker，2、发酵上清液，3、Octyl-Sepharose疏水相互作用层析后酶液，4、分离纯化后酶液，b :1、发酵上清液，2、分离纯化后酶液；图5本发明的耐高温木聚糖酶最适作用温度；
图6本发明的耐高温木聚糖酶的温度稳定性；图7本发明的耐高温木聚糖酶最适作用pH ；图8本发明的耐高温木聚糖酶pH稳定性。
具体实施例方式下面结合实施例对本发明的技术内容做进一步说明；下述实施例是说明性的，不是限定性的，不能以下述实施例来限定本发明的保护范围。本发明提供的产耐高温木聚糖酶的菌种是从天津广聚源造纸厂的棉杆堆料中分离得到的，通过考察其形态特征、生理生化特征和16s rRNA序列特征，将其鉴定为坎皮纳斯类芽孢杆菌(Paenikicillus campinasensis)，命名为G1-1，保藏于中国普通微生物菌种保藏中心，保藏号为CGMCC NO. 5023。一、菌种形态、生理生化特征及16s rRNA序列比对结果本菌种细胞呈杆状，有芽孢，革兰氏阳性，属好氧菌，在琼脂平板上形成白色不透明、表面干燥的圆形菌落。其生理生化特征见表1。根据其16s rRNA序列比对，选出与其序列最相近的12株已知菌种，构建系统进化树，进一步确定了其进化地位。表 1 Paenibacillus campinasensis Gl-I 的生理生化特征
权利要求
1.一种耐高温木聚糖酶的高产菌株，其特征在于分类命名为坎皮纳斯类芽孢杆菌 Gl-IPaenibacillus campinasensis G1-1，菌种保藏号=CGMCC No. 5023，保藏日期2011 年 7月1日，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
2.一种利用如权利要求1所述的耐高温木聚糖酶的高产菌株发酵产耐高温木聚糖酶的方法，其特征在于按3%的接种量将该菌的液体种子接种于发酵产酶培养基中，37°C， ISOrpm摇瓶培养4 获得含耐高温木聚糖酶的发酵液；所述发酵产酶培养基的成分为 wt% =NaNO3O. 5,K2HPO4O. 3、MgS04 ·7Η20 0. 03,MnSO4 ·Η20 0. 002、FeSO4 · 7Η20 0. 002、CaCl2 · 2Η20 0. 002、桦木木聚糖 0· 5，ρΗ7· 0。
3.根据权利要求2所述方法得到的耐高温木聚糖酶的分离纯化，其特征在于该耐高温木聚糖酶分离步骤如下(1)发酵液4°C下、8000rpm、离心lOmin，取上清液；(2)向发酵上清液中缓慢加入硫酸铵，使硫酸铵饱和度达到70%，4°C盐析过夜；(3)将盐析过夜的发酵上清液4°C下、8000rpm、离心lOmin，取沉淀，用pH7.0的PBS缓冲液溶解沉淀，得到耐高温木聚糖酶粗酶液，备用；(4)OctylSepharose Fast Flow疏水相互作用层析将粗酶液硫酸铵饱和度调到 40%，进行疏水相互作用层析，柱型φ2.6χ 18cm;平衡液含40%饱和度硫酸铵的0. 02mol/ L PBS缓冲液(pH7. 0)；流速2mL/min，上样后用饱和度为40% 0%的硫酸铵线性洗脱，收集活性组分，待下一步分离用；(5)Sephadex G-75凝胶过滤层析柱型:(pl.6><50cm;平衡液:0. 02mol/L PBS缓冲液 (pH8. 0)；流速0. 5mL/min。收集活性组分，待下一步分离用；(6)Q-Sepherose强阳离子交换层析柱型φ2.6χ 10cm;平衡液0. 02mol/L PBS缓冲液 (PH8.0)；流速2mL/min，上样后用含0 1.0M NaCl的平衡缓冲液进行线性洗脱，收集活性组分，备用；(7)将上一步得到的耐高温木聚糖酶样品进行透析除盐，然后冷冻抽干，得到耐高温木聚糖酶干粉。
4.一种耐高温木聚糖酶，其特征在于由权利要求2或3所述得到的耐高温木聚糖纯酶。
5.根据权利要求4所述的耐高温木聚糖酶，其特征在于所述耐高温木聚糖酶的相对分子量为41. 3KDa。
6.根据权利要求4所述的耐高温木聚糖酶，其特征在于所述耐高温木聚糖酶的最适作用温度为60°C。
7.根据权利要求4所述的耐高温木聚糖酶，其特征在于所述耐高温木聚糖酶的最适作用pH7. 0。
全文摘要
本发明公开了一种耐高温木聚糖酶的高产菌株及利用该菌株发酵产耐高温木聚糖酶的方法，并阐述了该酶的部分酶学性质。经菌种鉴定，将该菌命名为坎皮纳斯类芽孢杆菌G1-1(Paenibacillus campinasensis G1-1)，保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，菌种保藏号为CGMCC No.5023。该菌种发酵得到的耐高温木聚糖酶，经分离纯化得到单一组分，其相对分子量为41.3KDa，最适作用温度及pH分别为60℃和7.0；在40℃～70℃和pH 5.0～9.0范围内酶活保持相对稳定。本坎皮纳斯类芽孢杆菌木聚糖酶适合造纸、食品和饲料等多个工业领域的应用，具有广阔的应用前景。
文档编号C12N9/42GK102321558SQ201110282029
公开日2012年1月18日 申请日期2011年9月22日 优先权日2011年9月22日
发明者刘逸寒, 王建玲, 王春霞, 路福平, 郑宏臣 申请人:天津科技大学