专利名称：双特异性单克隆抗体及其制备方法与用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种双特异性单克隆抗体及其制备方法与用途，具体涉及抗克仑特罗、沙丁胺醇、莱克多巴胺三种β -激动剂双特异性抗体及其制备方法与用途。技术背景
克仑特罗(Clenbuterol,CL)、沙丁 胺醇(Salbutamol, Sal)和莱克多巴胺 (Ractopamine, RCT)都属于β -激动剂，能加快畜禽生长速度、减少脂肪沉淀提高瘦肉率， 因此被一些畜牧养殖企业作为养殖促进剂非法使用。当人们食用了具有上述药品残留的动物源食品后，会出现以下中毒症状肌肉震颤、心动过速、心律失常、腹痛、肌肉疼痛、恶心和晕眩等。欧盟、日本等国已经禁止使用，我国在《禁止在饲料和动物饮用水中使用的药物品种目录》中也有明文规定。
目前，主要采用理化检测方法，如高效液相色谱法(HPLC)、液相色谱-质谱法 (LC-MS)、气相色谱-质谱法(GC-MS)和免疫学检测方法，如酶联免疫法(ELISA)等方法检测食品中克仑特罗、沙丁胺醇、莱克多巴胺三种β_激动剂药物的残留。仪器检测方法，具有检测精密度高，假阳性率低等特点，但是仪器本身价格昂贵，操作比较繁琐，耗时长，对检测人员专业要求较高，检测费用昂贵，难以进行现场大量样本筛查，主要作为确证方法。免疫学检测方法，尤其是酶联免疫法，作为快速检测方法，酶联免疫检测法基于抗原-抗体的特异性反应，反应灵敏度高，特异性好，技术操作简便，便于现场大量样本的快速筛查，目前在我国得到大量推广应用。
目前国内已经有关于用单克隆抗体建立酶联免疫试剂盒检测方法同时检测克仑特罗和沙丁胺醇的报道和用莱克多巴胺单克隆抗体建立酶联免疫试剂盒方法特异性检测莱克多巴胺的报道，克仑特罗、沙丁胺醇、莱克多巴胺三种β_激动剂药物均属于动物源性食品中规定的检 测项目，分别检测无疑增加了检测时间，提高检测成本，不利于现场测定。 双特异性单克隆抗体(BsAb)是在普通单克隆抗体的基础上发展起来的一种新型抗体，它的两个Fab片段能特异性结合不同的抗原决定簇，在免疫诊断方面有着广泛的应用前景。 本发明提供了能够同时检测克仑特罗、沙丁胺醇、莱克多巴胺的双特异性抗体，并用此特异性抗体建立间接竞争酶联免疫检测方法用于克仑特罗、沙丁胺醇、莱克多巴胺及其残留量的测定。发明内容
本发明针对现有技术检测克仑特罗、沙丁胺醇、莱克多巴胺难度较大，检测成本高的缺点，提供了一种同时抗克仑特罗、沙丁胺醇、莱克多巴胺的双特异性抗体及此双特异性抗体制备方法，该双特异性抗体可用于制备检测克仑特罗、沙丁胺醇和莱克多巴胺的快速检测试剂盒。
一种双特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞，其保藏编号为CGMCC No. 5129，保藏日期 2011年08年19日，保藏单位是中国微生物菌种保藏管理委员会。
一种双特异性抗体是由杂交瘤细胞CGMCC No. 5129分泌的。
一种双特异性抗体的制备方法，将抗克仑特罗、沙丁胺醇的杂交瘤细胞株与抗莱克多巴胺的杂交瘤细胞株分别进行驯化，使其成为HAT敏感株，再进行筛选融合得到同时抗克仑特罗、沙丁胺醇和莱克多巴胺的双特异性抗体杂交瘤细胞，注射老鼠腹腔，采集腹水，得到双特异性单克隆抗体。
有益效果本发明方法制备的抗克仑特罗、沙丁胺醇和莱克多多巴胺的双特异性单克隆抗体性能较好，经间接ELISA测定，其效价达到350000，其对克仑特罗、沙丁胺醇和莱克多巴胺有较好的特异性反应，并且制备双特异性抗体的制备方法简单，成本较低，用于免疫快速检测试剂盒时，便于推广利用。
具体实施方式
实施例一
抗克仑特罗、沙丁胺醇的单克隆杂交瘤细胞株制备
克仑特罗半抗原的合成
1. 0-10. Og盐酸克仑特罗加入到20-100ml DMF中，加入5_25ml三乙胺，10-20%摩尔当量的DMAP，0°C下滴加1. 1-1. 5摩尔当量的叔丁基二甲基氯硅烷在10_50ml DMF中的溶液，滴加完毕后，室温继续反应ι- ο小时，蒸除大部分溶剂，加水，乙酸乙酯萃取，水洗， 干燥，除去溶剂后在环己烷-乙酸乙酯中重结晶得到白色固体，所得产物加入20-50ml DMF 溶解，加入O. 5-1. 5g NaOH，搅拌下滴加1. 1-1. 5摩尔当量的溴丁酸乙酯在10_20ml DMF中的溶液，室温至60°C反应10-20小时，乙酸乙酯萃取，水洗，干燥，除去溶剂后在环己烷-乙酸乙酯中重结晶得到白色固体，为O-硅烷化-N-烷基化克仑特罗，取O-硅烷化-N-烷基化克仑特罗1. 0-3. Og,溶入50-100ml THF中，加入1. 5-2. O摩尔当量的TBAF，室温反应10-20 小时，蒸除溶剂，乙酸乙酯溶解，水洗，干燥，得到N-烷基化克仑特罗，取1. 0-2. OgN-烷基化克仑特罗溶入50-1OOml DMF中，加 入10-20mll0% NaOH水溶液，室温至80°C下反应2-5小时后，稀盐酸酸化，除去溶剂，乙醇-水中重结晶得到克仑特罗半抗原。
克仑特罗完全抗原合成
将克仑特罗半抗原与牛血清白蛋白偶联合成克仑特罗完全抗原。
完全抗原的具体合成方法为
(I)取12mg克仑特罗半抗原溶解于ImL DMF中，加入用O. 2ml去离子水溶解后的 15mg EDC，室温下搅拌24h，得到I液；
(2)称取BSA40mg溶解在pH7. 2的3mL PBS液中，将反应液I液滴加到蛋白溶液中，并于室温下搅拌24h;
(3)pH为7.2的0.01mol/L PBS在4°C下透析3天，分装，于_20°C保存备用。
克仑特罗杂交瘤细胞株的制备
1、动物免疫
用无菌pH7. O的PBS液将合成的免疫抗原溶解，然后按免疫原与弗氏佐剂 (FCA) I I的比例充分乳化制成油乳剂疫苗。首次免疫用弗氏完全佐剂疫苗，对8-10周龄 Balb/c小鼠进行免疫,颈背部皮下多点注射,免疫剂量为IOOyg/只。14天后二免,采用弗氏不完全佐剂，免疫剂量同上；28天后三免，采用弗氏不完全佐剂，免疫剂量同上；31天后不加佐剂加强免。
2、细胞的融合和克隆化
将Balb/c小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞SP20按8 I比例混合，将混合好的细胞离心，倒干上清，把沉淀细胞块弹成糊状，置37°C水浴，加入聚乙二醇(PEG)4000融合剂1ml， 作用2min，并轻轻搅拌细胞，在随后加入20ml无血清的PEG营养液，IOOOrpm离心lOmin， 弃上清。用20 50ml完全培养液重悬细胞，铺种于含饲养细胞96孔细胞培养板，每孔 ΙΟΟμ L·置培养箱中。待细胞长至孔底的1/2 1/3时，采用间接竞争ELISA测定细胞上清液，筛选阳性孔。将阳性细胞在检测后2天内采用有限稀释法进行亚克隆，直到得到稳定的能够分泌克仑特罗单克隆抗体的杂交瘤细胞株。
抗莱克多巴胺的单克隆杂交瘤细胞株的制备
莱克多巴胺免疫抗原的制备
(I)取莱克多巴胺2g溶于20ml，O. 5mol/L的氢氧化钠溶液中，得到莱克多巴胺半抗原溶液，取2g氮羟基琥珀酰甲胺溶于8ml蒸馏水并加到莱克多巴胺半抗原溶液中，室温搅拌反应2. 5小时，得到I液；
(2)取人血清白蛋白(HSA)22g溶于75ml，pH9碳酸盐缓冲液中，得到载体蛋白溶液，将载体蛋白溶液滴加到I液中，4°C搅拌过夜，得到II液。
(3)将得到的II液用O. 2mol/L的磷酸盐缓冲液透析7天，每天换液3_4次，得到莱克多巴胺免疫抗原。
莱克多巴胺杂交瘤细胞株的制备
1、动物免疫
用无菌PH7. O的PBS液将合成的免疫抗原溶解，然后按莱克多巴胺完全抗原与弗氏佐剂(FCA)I I的比例充分乳化制成油乳剂疫苗。首次免疫用弗氏完全佐剂疫苗，对 8-10周龄Balb/c小鼠进行免疫,颈背部皮下多点注射,免疫剂量为ΙΟΟμ g/只。14天后二免，采用弗氏不完全佐剂，免疫剂量同上；28天后三免，采用弗氏不完全佐剂，免疫剂量同上；31天后不加佐剂加强免。
2、细胞的融合和克隆化
将Balb/c小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞SP20按8 :1比例混合，将混合好的细胞离心，倒干上清，把沉淀细胞块弹成糊状，置37°C水浴，在Imin内加入Iml融合剂，融合剂为聚乙二醇(PEG) 4000，作用2min，并轻轻搅拌细胞，在随后4min内加入20ml无血清的PEG 营养液，IOOOrpm离心lOmin，弃上清。用20 50ml完全培养液重悬细胞，铺种于含饲养细胞96孔细胞培养板，每孔100μ I。置培养箱中。待细胞长至孔底的1/2 1/3时，采用间接竞争ELISA测定细胞上清液，筛选阳性孔。将阳性细胞在检测后2天内采用有限稀释法进行亚克隆，直到得到稳定的能够分泌莱克多巴胺单克隆抗体的杂交瘤细胞株。
HAT敏感株的建立
将上述制备的抗克仑特罗、沙丁胺醇的单克隆杂交瘤细胞和抗莱克多巴胺的单克隆杂交瘤细胞，传代培养两次，待大部分细胞状态达到最佳时，用2、5、10、20、30、40μ8/πι1 的8-Ag对分泌克仑特罗、沙丁胺醇的细胞株进行驯化，获得能耐受30 μ g/ml 8-Ag的HAT 敏感株；将分泌莱克多巴胺抗体的细胞株接种于含5-BrdU的培养液中，在2、5、10、20和 40mg/ml等5个浓度条件下进行驯化,获取能耐受20mg/ml 5-BrdU的敏感株,驯化完成后，用HAT选择培养液分别测定克仑特罗、沙丁胺醇驯化株和莱克多巴胺驯化株对HAT的敏感性，用间接ELISA法分别检测抗克仑特罗、沙丁胺醇驯化细胞株和莱克多巴胺驯化细胞株产生抗体的情况。
经8-Ag和5-BrdU驯化得到的在完全培养液中能生长，但在HAT培养液中不能存活的杂交瘤细胞，用ELISA法检测，克仑特罗、沙丁胺醇细胞株驯化前后，1000倍稀释，其 OD值分别是1. 683和1. 620。莱克多巴胺驯化前后，800倍稀释，其OD值分别是1. 871和1.756，其效价均与未驯化前相当。
饲养细胞的制备
取6 8周龄Balb/c小鼠断颈处死后浸泡于75%酒精中消毒，无菌条件下剥开表皮，将PRM1-1640培养液注入小鼠腹腔，轻轻抖动和按摩腹腔，然后原注射器抽回腹腔内液体，如此反复三次；将刚抽回的液体离心，弃上清，加完全培养基混匀，铺板，置37°C 5% CO2 培养箱备用。
分泌双特异性抗体的杂交瘤细胞的建立
取克仑特罗、沙丁胺醇驯化细胞和莱克多巴胺驯化细胞按1:1混合，50% PEG 融合，铺板于已经制备好的饲养细胞板，置37°C 5% CO2培养箱培养。待融合细胞长至1/5 孔底面积左右取其上清液进行检测，并对阳性细胞孔用有限稀释法进行克隆化培养与再筛选，从克隆板中筛选出分泌阳性双特异性抗体的单克隆细胞进行扩大培养。
腹水的制备
液体石蜡致敏6 8周的Balb/c小鼠，注射体积500 μ I/只，取用1640洗两次的杂交瘤细胞，取100-150万细胞注射于老鼠腹腔，注射细胞一周后对腹腔肿大的鼠用无菌注射器采集腹水，采集到的腹水，用辛酸-饱和硫酸铵法进行纯化，纯化后的腹水放入_20°C环境保存，腹水在使用前经过O. Olmol/LNaCl于4°C环境下透析48小时，中间每隔 6h-8h换液一次。
腹水的检测
克仑特罗-卵清蛋白偶联抗原制备
取3. Omg克仑特罗溶于O. 5ml O. lmol/L盐酸溶液中，预冷至O 5°C,加入6. Omg NaNO2，搅拌反应15分钟。取卵清蛋白18mg溶于2. 5ml三蒸水中，加入前述制备的克仑特罗溶液，搅拌反应24小时，4°C条件下，用O. 01mol/L PBS透析3天，分装，于_20°C保存备用。
莱克多巴胺-辣根过氧化物酶酶标抗原的制备
莱克多巴胺半抗原制备称取莱克多巴胺1. Og溶解于20ml无水吡啶中，加入 0. 75g琥珀酸酐，回流反应24小时。停止反应后，用旋转蒸发去除吡啶，加入15ml丙酮溶解，用旋转蒸发仪蒸干，添加20ml三蒸水，用20ml乙酸乙酯萃取三次，合并有机相，用无水硫酸钠干燥有机相。将有机相旋转蒸干得黄色油状物，加IOml乙醇将油状物溶解完全后， 缓慢加入IOml石油醚有晶体析出，离心取固体烘干。即为莱克多巴胺半抗原。
莱克多巴胺酶标抗原制备取IOmg莱克多巴胺半抗原，溶解于Iml DMF中，取 12. 5mg EDC用0. 2ml水充分溶解后加入上述溶液中，室温下搅拌24小时，即可得到反应液 A。称取辣根过氧化物酶10mg，使之充分溶解在3ml PBS (pH 7.2)中，将A逐滴缓慢滴加到酶溶液中，室温下搅拌24小时。4°C条件下用O.Olmol/L PBS透析3天。分装，于_20°C保存备用。
用克仑特罗-卵清蛋白包被酶标板,封闭,加腹水,分别以SP2/0细胞上清和培养液作为阴性对照和空白对照，孵育，洗涤，加莱克多巴胺-辣根过氧化物酶，孵育，洗涤后加底物显色，酶标仪双波长450/630nm处读数。
用ELISA法测定腹水效价为15000-350000，OD值为1. 402-1. 986，筛选出效价较好的抗克伦特罗、沙丁胺醇和莱克多巴胺的双特异性抗体杂交瘤细胞株D-2-4，于2011年08 月19日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址北京市朝阳区北辰西路I号院3号，邮编:100101)，保藏编号CCGMCC No. 5129。
双特异性抗体的制备
将克隆化的D-2-4CGMCC No. 5129细胞株扩大培养，待细胞浓度达2/3以上时停止换液，直至细胞全部死亡，收集培养液，ELISA测定其效价。体内诱生腹水给腹腔注射液体石蜡10天后的小鼠腹腔注射克隆化细胞株107个细胞，7天左右抽取腹水，以硫酸铵盐析法提纯抗体球蛋白，以ELISA测其效价，此腹水效价达350000。
细胞染色体计数
采用秋水仙素终止细胞分裂法，将两种亲本细胞和双特异性细胞传代培养2天左右，待大部分细胞状态最佳时，加秋水仙素继续培养6小时，进行离心，低渗处理，3次固定后制片，10% Giensa染液染色，油镜下观察150个完整的中期核细胞染色体数量。
双特异性抗体细胞染色体平均数目是亲本细胞的两倍左右，表明细胞融合成功， 此细胞染色体为两个亲本细胞的染色体整合而成。
表2两个亲本细胞和双特异性抗体细胞染色体数目比较 克仑特罗莱克多巴胺双特异性亲本细胞亲本细胞抗体细胞染色体数目90 9895 105188 198平均数95101192
双特异性抗体稳定性实验
将腹水置_20°C冻存半年、_20°C反复冻融5次，比较处理前后腹水效价变化情况。
取D-2-4CGMCC No. 5129株腹水，测双特异性抗体对热的稳定性。在保存之前所检测的D-2-4CGMCC No. 5129腹水效价为350000，0D值为1. 758。以下效价情况中的OD值均为抗体350000倍稀释后检测所得。
表3不同温度对D-2-4CGMCC No. 5129腹水效价的影响温度__效价情况_3] - 20 0C 6 个月 1.752 -20 0C_反复冻融5次_1.687
双特异性抗体交叉反应的测定
将BsAb与克仑特罗、沙丁胺醇、肾上腺素、特步他林、异丙肾上腺素和莱克多巴胺等β -激动剂类药物反应，检测其与同类药物交叉反应。
参照Shelver和Smith的方法，以单抗对克仑特罗的50%抑制浓度(IC5tl)与对竞争物的IC5tl之比的百分数为其交叉反应率(CR% )。用竞争性ELISA测定各竞争物的吸光度值。双特异性抗体对克仑特罗的IC5tl为lng/ml，对沙丁胺醇的IC5tl为1. 2ng/ml，对莱克多巴胺的IC5tl为1. 5ng/ml，对肾上腺素、特步他林、异丙肾上腺素的交叉反应率小于1%。
表4双特异性抗体对几种激动剂类药物交叉反应
权利要求
1.一种双特异性抗体杂交瘤细胞株，其保藏编号为CGMCC No. 5129，保藏日期2011年08年19日，保藏单位是中国微生物菌种保藏管理委员会。
2.一种双特异性单克隆抗体是由权利要求1的杂交瘤细胞分泌的。
3.一种双特异性单克隆抗体的制备方法，其特征在于将抗克仑特罗、沙丁胺醇的杂交瘤细胞株与抗莱克多巴胺的杂交瘤细胞株分别进行驯化，使其成为HAT敏感株，再进行筛选融合得到同时抗克仑特罗、沙丁胺醇和莱克多巴胺的双特异性抗体杂交瘤细胞，注射老鼠腹腔，采集腹水，得到双特异性单克隆抗体。
全文摘要
本发明提供一种分泌双特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞、单克隆抗体及其制备方法，具体涉及一种保藏编号为CGMCC No.5129的杂交瘤细胞株以及其分泌的双特异性单克隆抗体，本发明是通过将抗克仑特罗、沙丁胺醇的杂交瘤细胞株与抗莱克多巴胺的杂交瘤细胞株分别进行驯化，使其成为HAT敏感株，再进行筛选融合得到同时抗克仑特罗、沙丁胺醇和莱克多巴胺的双特异性抗体杂交瘤细胞，注射老鼠腹腔，采集腹水，得到双特异性单克隆抗体。本方法制备的双特异性单克隆抗体性能较好，效价达到350000，可特异性检测克仑特罗、沙丁胺醇、莱克多巴胺，并且本发明抗体制备方法简单，成本较低，用于免疫快速检测试剂盒时，便于推广利用。
文档编号C12N5/20GK103013925SQ20111028213
公开日2013年4月3日 申请日期2011年9月21日 优先权日2011年9月21日
发明者何方洋, 万宇平, 冯才伟, 何丽霞, 余厚美, 冯静 申请人:北京勤邦生物技术有限公司