专利名称：利用天然油体重构法制备固定化脂肪酶用于生产生物柴油的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种以基因工程的方法表达脂肪酶，并使用天然油体作为固定化酶基质以制备固定化脂肪酶来生产生物柴油的方法。
背景技术：
1.生物酶法制备生物柴油的概况
生物酶法制备生物柴油是利用脂肪酶的酯化和转酯反应活性，催化油脂和醇反应生成生物柴油。与物理法和化学法相比，用脂肪酶作催化剂制备生物柴油，具有应用范围广、原料选择性较低、催化效率高、反应条件温和及对环境友好、醇用量少、后处理简单、无污染物排放、副产物甘油较易分离等优点。目前，天然的脂肪酶作为催化剂来生产生物柴油存在着一定的局限性，主要有 (1)脂肪酶对低链醇的转化率较低，致使脂肪酶用量过大、反应周期过长，脂肪酶的转酯反应活性有待进一步提高；( 短链醇特别是甲醇对脂肪酶有一定的毒性，酶的使用寿命缩短，生产成本过高，脂肪酶的甲醇耐受性也必须进一步改善。正是这些因素制约着酶法生产生物柴油的大规模应用。固定化酶是在一定空间内呈闭锁状态存在的酶，能连续地进行反应，反应后的酶可以回收重复利用。将游离脂肪酶固定在载体上催化反应合成所需要的产物，使昂贵的脂肪酶得以重复使用，降低了反应的成本。且固定化酶具有可以回收，重复使用，稳定性高，产品质量高等优点。因此，固定化脂肪酶应用前景被普遍看好。2.脂肪酶的固定化方法
当前固定化脂肪酶的方法很多，可概括为物理法、化学法及生物法。由于载体材料、制备方法及固定酶的来源等不同，导致制备固定化酶的难易程度、固定效果、酶的稳定性等也有所不同。物理方法，包括吸附法和包埋法。吸附法是通过物理吸附将酶固定于纤维载体的一种固定化方法。物理吸附法具有酶活性中心不易被破坏和酶高级结构变化少的优点，另外，吸附过程可以同时达到纯化和固定化的目的，且酶失活后可重新活化再生。因而酶活力损失较少，若能找到适当的载体，这是很好的方法。包埋法是将酶物理包埋于多聚物内以达到固定化的目的。包埋法一般不需要与酶蛋白的氨基酸残基进行结合反应，很少改变酶的高级结构，因此酶活回收率较高。但是在包埋时发生化学聚合反应，酶容易失活，必须巧妙设计反应条件，使之化学反应时不至于破坏酶的活性部位和活性中心。北京化工大学研究者将自有菌株发酵提取的脂肪酶(Candida sp. 99-12 用硅藻固定，采用酯化法直接将脂肪酸与甲醇反应，油酸和甲醇摩尔比为1 1.4，反应过程中加入硅胶作吸水剂，反应Mh，酯化率可达92%。^mi Watanabe等人运用固定的假丝酵母(Candida antarctica)脂肪酶催化豆油与甲醇反应中获得了 93. 8%的转酯率，并且其固定化酶循环25次之后活性没有发生任何改变。官春云等用硅藻土对实验室筛选得到的成团肠杆菌脂肪酶干燥酶粉进行固定化，转酯率达到91. 03%。
化学法主要是采用共价结合法。该方法是通过酶分子之间或酶蛋白分子的功能团与载体表面上的反应基团之间以共价键相互连接，形成固定化酶。罗文等以多孔玻璃为载体，采用共价法对假丝酵母99-125脂肪酶进行了固定，并以所制备的固定化酶为催化剂， 在温水体系中利用菜籽油合成生物柴油，采用3次流加甲醇的方式在石油醚中合成生物柴油，每一批次反应后过滤出固定化酶，用叔丁醇清洗后继续进行下一批次的反应，固定化酶连续反应13批(每批30 h)后，生物柴油反应转化率仍维持在70%以上。固定化脂肪酶的半衰期在390 h以上。生物法是采用分子生物学手段将目的基因克隆表达并将表达蛋白进行固定从而制备固定化酶的方法。当前生物法制备固定化脂肪酶主要是采用全细胞固定法。全细胞固定化法是将产脂肪酶的微生物直接固定到支持物上，从而制备全细胞催化剂，这种方法比固定化酶更为简便、经济，而且固定化过程可在批量化发酵时同步完成，不仅省去了分离纯化的过程，而且又避免在提取，纯化过程中酶的损失。根据全细胞催化剂的发展历程和固定方法的差异，主要分为真菌全细胞催化剂、酵母全细胞催化剂、大肠杆菌全细胞催化剂三种。kizaburo Shiraga等将稻根霉菌脂肪酶固定到酿酒酵母菌表面，与游离脂肪酶相比， 所得固定化脂肪酶催化软脂酸和η-戊醇(0.2 %水存在)的转酯活性得到了巨大的提高。 Hama等将根霉菌lihizopus oryzae细胞固定在聚氨酯泡沫体BSI3s中，在一个20L的填充床生物反应器中进行间歇培养。流速为25L / h时在第一个生产周期甲酯含量超过90%，第 10个周期后可以达到80%。Kazuhiro等将根霉菌Iihizopus oryzae固定在聚氨酯泡沫体颗粒上，采用分3次加入甲醇的方式，当反应体系中含有质量分数为15%的水时，甲酯得率可以高达90%。经过6次回用，胞内脂肪酶的活性并没有明显的下降。同时还发现利用不同的脂肪酸作为碳源，全细胞催化剂的催化活性和稳定性也不同，不饱和脂肪酸有利于提高细胞膜的通透性，使酶催化活性提高，而饱和脂肪酸有利于提高细胞的刚性，使酶稳定性提高。Matsumoto等构建了能大量表达米根霉脂肪酶(lihizopus oryzae lipase)的酵母菌株MT821，其胞内脂肪酶的活性达到474. 5 IU / L0用预先经冻融或风干方法增强了渗透性的酵母细胞来催化大豆油合成脂肪酸甲酯，在37°C时以逐步添加甲醇的方式反应165h， 最后反应液中脂肪酸甲酯质量分数达到71%。该法省去了分离和外部固定化的步骤。3.现有生物柴油生产中脂肪酶固定化方法的评价及发展趋势
虽然固定化酶法制备生物柴油具有条件温和、醇用量小、产品易于收集、无污染排放等优点，是一种很有潜力的绿色生产方法。但目前实际生产中仍未广泛使用，主要是由于在生物柴油的生产中他们都存在着一些严峻的缺陷物理法制备固定化脂肪酶具有操作简单、 成本较低的优点，但达不到纯化的目的，而且包埋法只适用于分子量比较小的底物和产物的酶催化反应；化学法生产的固定化脂肪酶具有结合牢固、不易脱落、可连续使用时间较长等优点，但在固定过程中不可避免地会导致酶部分活性位点的损失，从而降低酶的活力。 反应条件苛刻、操作复杂、酶活回收率低，甚至酶的底物专一性有时也会发生变化，并且在操作过程中常常会引起酶蛋白高级结构发生变化，从而导致活性中心受到破坏，其重复性不高，从而不适于生物柴油的生产。此外，因为必须对脂肪酶进行一定的分离提纯才能获得较高的固定化效率，使得固定化脂肪酶法的生产成本依然较高，限制了其在实际生产中的应用。全细胞固定化脂肪酶操作简单、成本低，但是存在一个最大的问题是目的蛋白(脂肪酶)的量无法得到充分的提高。
综上分析固定化脂肪酶生产生物柴油今后的研究重点，仍然在于寻找更好的固定化材料和固定化方法，进一步改善固定化酶的相对活力、热稳定性、低碳醇耐受性和催化底物适用范围等性能。入背景技术描述段落。
发明内容
本发明是利用天然油体重构法同步纯化和固定化脂肪酶，该发明提供了一种全新的脂肪酶固定化技术可用于生产生物柴油，解决了当前酶法生产生物柴油过程中固定化脂肪酶成本高、效率低的缺点。本发明的特征在于该方法步骤如下利用天然油体崩解后能自发重构的特点，以油脂植物总mRNA的反转录产物cDNA为模板，采用PCR法获得的40(Tl000bp的油体蛋白基因，标记为0。以根据文献《廉价油脂青睐型脂肪酶产生菌株的筛选及其鉴定》的方法获得的产脂肪酶微生物基因组为模板采用PCR法获得信号肽缺失的脂肪酶及其伴侣蛋白基因的ORF序列，标记为Lipd25AB。利用《分子克隆实验指南3》上基因工程的方法构建油体蛋白和脂肪酶及其伴侣蛋白表达载体PET32 (a+)-0-Lipd25AB。将该原核表达载体转入表达宿主菌E. coli BL2KDE3)中，获得用于表达融合蛋白(油体蛋白-脂肪酶)的工程菌株E. coli BL21(DE3) -0-Lipd25AB。将诱导表达的工程菌株与天然油体按比例混合后超声处理，利用油体蛋白的特异疏水性使融合蛋白锚定到新组成的油体半单位膜上，形成含有脂肪酶的重构油体即固定化脂肪酶。利用所制备的固定化脂肪酶催化动植物油脂的转酯反应获得生物柴油。所述的脂肪酶是用天然油体重构技术固定的脂肪酶，用于制备生物柴油。所述的天然植物油体来源于油脂植物种子如麻疯树种子、油菜籽、拟南芥种子、 大豆、花生、棉籽、棕榈、椰子等天然油体。所述的天然油体与含表达载体的大肠杆菌合并混勻进行超声波处理条件为功率 20%- %;破碎时间5-10min，将超声处理后的混合物于10 000 g离心10 min，收集上层白色物质，即为天然油体固定化脂肪酶。所获得的油体蛋白基因大小在40(Tl000bp。脂肪酶基因来源可为根据文献《廉价油脂青睐型脂肪酶产生菌株的筛选及其鉴定》的方法获得的产脂肪酶的不同微生物。所述的转酯反应包括将收集的天然油体固定化脂肪酶加入到含有脂溶性有机溶剂、动植物油脂的密闭容器中，然后加入低元醇及水后放于相应温度的摇床中进行转酯反应，每隔一段时间再加入相应量的低元醇，连续多次，转酯后获得相应的脂肪酸酯即为生物柴油。所述的油脂是一种或多种选自麻疯树种子油、菜籽油、猪油、大豆油、花生油、棉籽油、棕榈油、椰子油、食用废油、皂角或酸化油等的动植物油脂。所述的低元醇为甲醇、乙醇、乙酸乙酯等，可以一次或多次加入。所述的转酯反应参数为温度15 - 45°C，摇床转速70 - 200 r/min，每隔5_10 h 再加入相应量的低元醇，连续3-5次。本发明采用天然油体重构技术来固定化脂肪酶达到了同步固定及高效纯化的目的，简化了制备固定化酶的工艺；其次，天然油体固定化酶用于转酯反应后经过简单的处理或自然崩解，其主要成分(油脂)可以作为生物柴油生产底物循环利用，不仅达到了资源的充分利用而且有利于环保；再次，本发明首次采用天然油体作为固定化酶的基本材料，不仅成本低廉，而且显著提高了脂肪酶的稳定性以及对低元醇的耐受能力。
权利要求
1.一种使用天然油体作为固定化酶基质以制备固定化脂肪酶来生产生物柴油的方法， 其特征在于该方法步骤如下利用天然油体崩解后能自发重构的特点，以油脂植物总mRNA 的反转录产物cDNA为模板，采用PCR法获得的40(Tl000bp的油体蛋白基因，标记为0 ；以根据文献《廉价油脂青睐型脂肪酶产生菌株的筛选及其鉴定》的方法获得的产脂肪酶微生物基因组为模板采用PCR法获得信号肽缺失的脂肪酶及其伴侣蛋白基因的ORF序列，标记为Lipd25AB ；利用《分子克隆实验指南3》上基因工程的方法构建油体蛋白和脂肪酶及其伴侣蛋白表达载体pET32(a+)-0-Lipd25AB ；将该原核表达载体转入表达宿主菌Ε. coli BL21(DE3)中，获得用于表达融合蛋白(油体蛋白-脂肪酶)的工程菌株Ε. coli BL21(DE3) -0-Lipd25AB;将诱导表达的工程菌株与天然油体按比例混合后解构处理，利用油体蛋白的特异疏水性使融合蛋白锚定到新组成的油体半单位膜上，形成含有脂肪酶的重构油体即固定化脂肪酶；利用所制备的固定化脂肪酶催化动植物油脂的转酯反应获得生物柴油。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的脂肪酶是用天然油体重构技术固定的脂肪酶，用于制备生物柴油。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的天然植物油体来源于油脂植物种子如麻疯树种子、油菜籽、拟南芥种子、大豆、花生、棉籽、棕榈、椰子等天然油体。
4.如权利要求1所述的方法，所获得的油体蛋白基因来源于油脂植物如麻疯树、油菜、拟南芥、大豆、花生、棉籽、棕榈、椰子等，大小在40(Tl000bp。
5.如权利要求1所述的方法，脂肪酶基因来源可为根据文献《廉价油脂青睐型脂肪酶产生菌株的筛选及其鉴定》的方法获得产转酯酶活脂肪酶的不同微生物。
6.如权利要求1所述的方法，其转酯反应包括将收集的天然油体固定化脂肪酶加入到含有亲脂性有机溶剂、动植物油脂的密闭容器中，然后加入低元醇及水后放于相应温度的摇床中进行转酯反应，每隔一段时间再加入相应量的低元醇，连续多次，转酯后获得相应的脂肪酸酯即为生物柴油。
7.如权利要求7所述的转酯反应，其特征在于所述的油脂是一种或多种选自麻疯树种子油、菜籽油、猪油、大豆油、花生油、棉籽油、棕榈油、椰子油、食用废油、皂角或酸化油等的动植物油脂。
8.如权利要求7所述的转酯反应，其特征在于所述的亲脂性有机溶剂可以为正己烷/ 石油醚/叔丁醇/乙醚等。
9.如权利要求7所述的转酯反应，其特征在于所述的低元醇为甲醇、乙醇、乙酸乙酯等，可以一次或多次加入。
10.如权利要求7所述的转酯反应，其特征在于所述的转酯反应参数为温度15-45°C，摇床转速70 - 200 r/min，每隔5-10 h再加入相应量的低元醇，连续3_5次。
全文摘要
本发明是一种利用天然油体重构法同步纯化和固定化脂肪酶的方法，该方法是利用天然油体崩解后能自发重构的特点，将表达有融合蛋白脂肪酶油体蛋白的大肠杆菌与天然油体按比例混合后超声处理，利用油体蛋白的特异疏水性使融合蛋白锚定到新组成的油体半单位膜上，形成含有脂肪酶的重构油体，从而达到脂肪酶纯化和固定化同步完成的目的。该发明提供了一种全新的可用于生产生物柴油的脂肪酶固定化技术，解决了当前酶法生产生物柴油过程中固定化脂肪酶成本高、效率低的缺点，制备工艺简单；本发明首次采用天然油体作为固定化酶的基质，成本低廉、底物适应性广泛，并显著提高脂肪酶的稳定性以及对低元醇的耐受能力。
文档编号C12P7/64GK102321693SQ20111028311
公开日2012年1月18日 申请日期2011年9月22日 优先权日2011年9月22日
发明者张树军, 白方文, 白林含 申请人:四川大学