专利名称：美白袪斑中药复方提取物的制备及应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种中药复方提取物，具体是涉及一种采用二氧化碳超临界萃取技术和大孔吸附树脂富集技术，以白花败酱草、文冠果种仁、白鲜皮、仙鹤草、红景天、决明子、柏子仁、金荞麦、薄荷、甘草为原料制得的提取物，该提取物具有明显的酪氨酸酶活性抑制作用和黑色素生成抑制作用。本发明还涉及了该提取物在制备美白袪班的药物制剂、保健食品和化妆品中的应用。
背景技术：
爱美之心，人皆有之。随着生活水平的提高，人们对生活质量的要求越来越高，越来越重视皮肤的自然美白，而颜面部显得尤为重要。黄褐斑是一种获得性色素沉着皮肤病， 是由多种原因所致的局限性、不规则性皮肤色素改变，临床表现为对称性色素沉着，呈蝶翅状，轻者为淡黄或浅褐色，点片状散布于面颊两侧，以眼部下外侧多发；重者呈深褐或浅黑色分布于面部。本病多发于中青年女性，一般无任何自觉症状，病程顽固，严重影响患者美观，给患者精神和生活方面带来诸多烦恼和痛苦。黄褐斑发病机理复杂，黑素过多是其核心病理表现。其确切的发病机制迄今未明， 一般认为与黑素代谢异常、内分泌失调、妊娠、口服避孕药、遗传因素、氧自由基、紫外线照射、酪氨酸酶功能障碍等诸多因素有关，其中内分泌失调、遗传、紫外线照射等造成的皮肤黑素代谢异常是其发病的主要原因。现代医学治疗黄褐斑主要包括使用避光剂(如氧化锌、二氧化钛等)，系统使用维生素类、止血环酸、褪黑素等；但基本以局部外用化学脱色为主，如氢酮、壬二酸、曲酸、谷胱甘肽、消炎痛、维甲酸、酚类化合物、皮质内固醇等；还有化学剥脱角质层或化学皮肤沙磨去除黑素及用染料激光破坏黑素颗粒等。可是，大多数方法因引起不均勻色素脱失、毛细血管扩张、接触性皮炎等毒副作用或本身不稳定、疗效缓慢易复发，并有造成永久脱色和药源性褐黄斑之弊，而未能推广应用。中医学将黄褐斑称作“黧黑斑”、“面尘”、“肝斑”等，《医宗金鉴》云“黯如尘久怠暗，原于忧思抑郁而成”。对本病的症状又云“初起色如尘垢，日久黑似煤形，枯暗不泽，大小不一。小者如粟粒赤豆，大者似莲子、或长、或斜、或圆。与皮肤相平，妇女多有之”。认为肝、肾、脾功能失调，气血运行失常，使脉络空虚不能上华于面，或瘀浊阻络，蕴结肌肤是黄褐斑发病的主要原因。中医药治疗黄褐斑讲求内脏气血阴阳平衡，注重调整脏腑功能，治以活血化瘀，疏肝解郁，滋补肝肾，健脾养血。或内治为主、或外治为主，或内外治并用。中药治疗黄褐斑历史悠久，早在《神农本草经》、《名医别录》、《太平圣惠方》、《千金方》等古典医籍中就明确记载了能够“袪面黑，好颜色”的方药。大量临床实践证明，中医药治疗黄褐斑显示出一定的优势，具有突出整体调节、疗效稳定、副作用小、患者易于接受等优点，疗效比单纯用西药治疗要好。但是，中药治疗黄褐斑仍存在疗效缓慢、治愈率不高、疗程较长、长期服用中药不方便等缺点，影响了治疗的依从性。
总之，中西医治疗黄褐斑的药物和手段比较多，但或因疗效过于缓慢、或因不良反应太多，一直未有一种疗效显著、安全、公认、令医患都满意的治疗方案，这与临床实际需要极不相符。因此，寻找组方合理、疗效确切的中药组方，并通过现代中药提取技术制备成高效、安全的中药美白袪斑提取物，已成为目前中医药美容领域的一个研究热点。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种具有优异的酪氨酸酶活性抑制作用和黑色素生成抑制作用的中药复方提取物。本发明另一个目的是提出该中药复方提取物在制备美白袪斑的药物制剂、保健食品和化妆品中的应用。为了达到上述目的，本发明采取了以下技术方案组方药材及比例为以重量份数计，白花败酱草5份、文冠果种仁5份、白鲜皮3 份、仙鹤草3份、红景天3份、决明子3份、柏子仁3份、金荞麦3份、薄荷2份、甘草1份。以重量份数计，白花败酱草5份、文冠果种仁5份、白鲜皮3份、仙鹤草3份、红景天3份、决明子3份、柏子仁3份、金荞麦3份、薄荷2份、甘草1份，称取各药材适量，混合粉碎，过药典2号筛，药粉装入二氧化碳超临界萃取装置中，加入夹带剂无水乙醇，用量为 0. 5ml/g药粉，设定萃取温度为45°C，萃取压力为40MPa，解析I压力为lOMPa、温度为40°C， 解析II压力为4MPa、温度为25°C，萃取时间为池，得棕黄色粘稠油状物。将上一步二氧化碳超临界萃取后的药渣，加入10倍量70%乙醇浸泡12小时，加热回流提取2小时，过滤，向药渣中再加入5倍量70%乙醇加热回流提取2小时，过滤，合并滤液，减压干燥得浸膏。将浸膏加适量水稀释后与等体积的D-101型大孔吸附树脂混合拌勻，上样于D-101型大孔吸附树脂柱中(上样量以生药量与树脂量之比计算为1 2)，静态吸附30分钟，然后依次用 10个柱体积的水、10个柱体积的20%乙醇和10个柱体积的50%乙醇进行洗脱，收集50% 乙醇洗脱液，减压干燥后粉碎，制得棕色粉末。将此粉末与二氧化碳超临界萃取制得的棕黄色粘稠油状物混合，即得本发明的中药复方提取物。作为对上述技术方案的改进和补充1、组方中药材的相对量可以按照白花败酱草4-6份、文冠果种仁4-6份、白鲜皮 2-4份、仙鹤草2-4份、红景天2-4份、决明子2-4份、柏子仁2_4份、金荞麦2_4份、薄荷1_3 份、甘草1-2份的比例进行调整。2、在进行二氧化碳超临界萃取时，萃取温度可以设定为30_60°C。3、在进行二氧化碳超临界萃取时，萃取压力可以设定为20_60MPa。4、在进行二氧化碳超临界萃取时，萃取时间可以设定为Ih或以上。5、在进行二氧化碳超临界萃取时，夹带剂可以为乙醇或浓度为95%以上的乙醇， 并且用量可以设定为0. 1-lml/g药粉。6、在用旋转蒸发仪对二氧化碳超临界萃取液进行减压浓缩回收乙醇时，温度可以设定为45°C或以下。7、在对二氧化碳超临界萃取后的药渣进行提取时，提取溶剂可以是30% -100%乙醇。8、在对二氧化碳超临界萃取后的药渣进行提取时，提取方式可以是加热回流提取、超声提取或者渗漉提取。9、在对乙醇提取浸膏进行大孔吸附树脂富集时，使用的柱脂可以是D-101型或者 AB-8型，以及其他非极性、弱极性或者中等极性大孔吸附树脂。10、在对乙醇提取浸膏进行大孔吸附树脂富集时，洗脱溶剂可以是水或不同浓度的乙醇，依照乙醇浓度由低到高依次洗脱。通过上述技术方案制备得到的提取物，具有明显的酪氨酸酶活性抑制作用和黑色素生成抑制作用，可以用于制备美白袪斑的药物制剂、保健食品和化妆品。当将上述提取物混合进具有美白袪斑作用的药物制剂和保健食品时，除这些提取物外，在不防碍本发明效果的范围内，可以根据需要适当混合用于通常的药物制剂和保健食品的其他成分中，例如交联聚乙烯吡咯烷酮、羧甲淀粉钠、微晶纤维素、乳糖、阿司巴坦、 硬脂酸镁等内加辅料、外加辅料和包衣辅料。其型剂可以是任何一种药学上所说的剂型，优选丸剂、片剂、胶囊剂或口服液。当将上述提取物混合进具有美白袪斑作用的化妆品及外用药物制剂时，除这些提取物外，在不防碍本发明效果的范围内，可以根据需要适当混合用于通常的化妆品、医药品等皮肤外用剂的其他成分中，例如油分、润湿剂、紫外线吸收剂、抗氧化剂、表面活性剂、防腐剂、保温剂、香料、水、醇、增稠剂等。本发明的提取物可用于化妆品及外用药物制剂，特别适合广泛用于化妆品中。其剂型只要是用于皮肤的剂型即可，可适用于溶液体系、可溶化体系、乳化体系、软膏、凝胶等任意剂型。另外，其使用形态也是任意的，例如化妆水、乳液、 霜、面膜等。本发明中药复方提取物是药食兼用的纯天然的植物提取物，随后的药效实验将证明，本发明中药复方提取物具有酪氨酸酶活性抑制作用和黑色素生成抑制的作用。
具体实施例方式下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。这些实施例应理解为仅用于说明本发明而不用于限制本发明的保护范围。在阅读了本发明记载的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等效变化和修饰同样落入本发明权利要求书所限定的范围。为说明方便，以下将本发明提取物简称为TQW。实施例1 (TQW抑制酪氨酸酶活性和黑色素生成的实验研究)1实验材料小鼠B16黑素瘤细胞(购于中科院上海细胞所)；熊果苷(购于Sigma公司)；DMEM 培养基(购于Gibco公司)；胎牛血清(购于Billab公司)；胰蛋白酶(购于Billab公司)；磷酸缓冲盐(购于北京中杉金桥有限公司)；双抗(购于Billab公司)；多巴(购于 Sigma 公司)JritonX-IOO (购于 Sigma 公司)；MTT (购于 Billab 公司)；DMSO (购于 Sigma 公司)；酶标仪(热电上海仪器有限公司)。2试剂配制取熊果苷临用时以DMEM培养基稀释成实验所需浓度。取TQW，用少量无水乙醇溶解，再用DMEM培养基溶解配成lmg/ml，其中乙醇浓度为 0.8%,调节PH值为7. 0，过滤除菌，4°C保存，备用。3细胞培养及受试药物暴露
取小鼠B16黑素瘤细胞，待细胞生长至近融合状态，经0.25%胰蛋白酶消化，用含有10%小牛血清的DMEM培养液传代，置于(X)2培养箱37°C、5% CO2饱和湿度环境中进行培养。每一次实验取自同一传代细胞。3. 1实验分组空白组是在未接种细胞的孔中加入细胞培养液；阴性对照组是在接种了细胞的孔中加入细胞培养液；给药组是在接种了细胞的孔中分别加入含不同浓度TQW的培养液；熊果苷组是在接种了细胞的孔中分别加入含不同浓度熊果苷的培养液。3. 2细胞增殖抑制率测定选择生长至近融合状态的细胞，用0. 25%胰酶消化，调整细胞浓度，以每孔5 X IO3 个接种于96孔板，每孔液体量150 μ L，置于37°C，体积分数为5% C02条件下培养24h后， 阴性对照组用新鲜培养液换液1次，给药组和熊果苷组用添加受试药物的新鲜培养液换液 1次，熊果苷、TQff浓度均分别设10 μ g/ml、50 μ g/ml、100 μ g/ml，每个浓度设12个复孔； 空白组只加培养液不加细胞；各组均置于37°C，体积分数为5 % CO2条件下培养72h，于结束前4h加入MTT 20 μ L/孔，37°C孵育4h后弃去上清液，加入二甲基亚砜(DMSO) 150 μ L/孔， 振荡IOmin左右。用酶标仪测OD值，波长为490nm。 细胞增殖抑制率％ = [ 1-(给药组OD值-空白组OD值)/(阴性对照组OD值-空白组OD值)]X 100%3. 3酪氨酸酶活性抑制率测定选择生长至近融合状态的细胞，用0. 25%胰酶消化，调整细胞浓度，以每孔5 X IO3 个接种于96孔板，每孔液体量150 μ L，置于37°C，体积分数为5% C02条件下培养24h后， 阴性对照组用新鲜培养液换液1次，给药组和熊果苷组用添加受试药物的新鲜培养液换液 1次，熊果苷、TQW浓度均分别设10 μ g/ml、50 μ g/ml、100 μ g/ml，每个浓度设12个复孔；空白组只加培养液不加细胞；各组均置于37°C，体积分数为5% C02条件下培养72h，倾去培养液，用 PBS 洗两次，加 TritonX-10090 μ L/ 孔，震荡 30min,加入 0. 2% L-dopa溶液 60 μ L/ 孔，37°C孵育20min，用酶标仪测OD值，波长为490nm。酪氨酸酶活性抑制率％ = [1_(给药组OD值-空白组OD值)/(阴性对照组OD 值-空白组OD值)]X 100%3. 4黑素含量抑制率测定选择对数生长期细胞，用0.25%胰酶消化，调整细胞浓度接种于培养瓶中，置于 37°C，体积分数为5% CO2条件下培养24h后，阴性对照组用新鲜培养液换液1次，给药组和熊果苷组用添加受试药物的新鲜培养液换液1次，熊果苷、TQW浓度均分别设10 μ g/ml、 50 μ g/mlUOO μ g/ml,每个浓度设12个复孔；空白组只加培养液不加细胞；各组均置于 37 0C，体积分数为5 % CO2条件下培养72h，用0. 25 %胰酶收获细胞，离心(1500r/min，5min) 后弃去上清液，加PBS缓冲液调节细胞密度至105/ml左右，各吸取Iml细胞悬液分别置于3 个平行具塞管中，离心(1500r/min，5min)后弃去上清液，先加入200 μ 1蒸馏水使细胞重新悬浮，然后加入Iml乙醇乙醚液(体积比为1 1)以溶解非黑素的不透明颗粒，在室温下放置15min，离心(3000r/min，5min)并弃去上清液，加入Iml质量分数为10%的二甲基亚砜、Imol/LNaOH溶液，置于80°C水浴30min，使细胞团块完全溶解。用酶标仪测OD值，波长为490nm。
黑素含量抑制率％ = [1-(给药组OD值-空白组OD值)/ (阴性对照组OD值-空白组OD值)]X 100%4结果分析4. ITQff对B-16细胞生长的影响由表1可见，TQW对细胞生长的抑制作用与同浓度熊果苷相比，差异均无统计学意义(P < 0. 05)，说明TQW的细胞生长抑制作用与传统美白剂熊果苷相似，并且细胞毒作用较轻。4. 2TQW对B-16细胞酪氨酸酶活性和黑素合成的影响由表2、3可见，TQW三个浓度均有显著的抑制酪氨酸酶活性和黑素合成的作用，并且作用均强于熊果苷，说明在抑制酪氨酸酶活性和黑素合成方面，TQW比传统美白剂熊果苷具有更明显的作用。表ITQW对小鼠B16黑素瘤细胞增殖的抑制率(X±SD，％ )
权利要求
1.一种具有美白祛斑作用的中药复方提取物，其提取方法如下以重量份计，按照白花败酱草4-6份、文冠果种仁4-6份、白鲜皮2-4份、仙鹤草2-4份、 红景天2-4份、决明子2-4份、柏子仁2-4份、金荞麦2-4份、薄荷1_3份、甘草1_2份，称取各药材适量，混合粉碎，过药典2号筛，药粉进行二氧化碳超临界萃取，以乙醇为夹带剂，在一定的工艺参数下萃取得棕黄色液体，减压浓缩回收乙醇，最终得棕黄色粘稠油状物；再将上一步二氧化碳超临界萃取后的药渣，用适当浓度乙醇浸泡后提取，提取液干燥得浸膏，浸膏利用大孔吸附树脂柱进行富集，在一定的工艺参数下制得棕色粉末；将此粉末与二氧化碳超临界萃取制得的棕黄色粘稠油状物混合，即得本发明的中药复方提取物。
2.根据权利要求1所述的中药复方提取物，其特征在于在对白花败酱草、文冠果种仁、 白鲜皮、仙鹤草、红景天、决明子、柏子仁、金荞麦、薄荷、甘草的药粉进行二氧化碳超临界萃取时，萃取温度为30-60°C，萃取压力为20-60MPa，萃取时间为Ih或以上，夹带剂无水乙醇用量为0. 1-lml/g药粉，解析压力为20MI^或以下，解析温度为40°C或以下。
3.根据权利要求1所述的中药复方提取物，其特征在于对二氧化碳超临界萃取后的药渣进行提取时，提取溶剂为30% -100%乙醇，第一次用量为10倍量，浸泡12小时，加热回流提取或者超声提取或者渗漉提取2小时，过滤，向药渣中再加入5倍量30% -100%乙醇， 再提取2小时，过滤，合并滤液，减压干燥得浸膏。
4.根据权利要求1所述的中药复方提取物，其特征在于在对乙醇提取浸膏进行大孔吸附树脂富集时，将浸膏加适量水稀释后与等体积的D-101型大孔吸附树脂混合拌勻，上样于D-101型或者AB-8型，以及其他非极性、弱极性或者中等极性大孔吸附树脂柱中，上样量以生药量与树脂量之比计算为1 2，静态吸附30分钟，然后依次用10个柱体积的不同浓度的乙醇进行洗脱，收集20% -50%乙醇洗脱液，减压干燥后粉碎，制得棕色粉末。
5.根据权利要求2所述的中药复方提取物，其特征在于在进行二氧化碳超临界萃取时，萃取温度为45°C，萃取压力为40MPa，萃取时间为池，夹带剂无水乙醇用量为0. 5ml/g药粉，解析I压力为lOMPa、温度为40°C，解析II压力为4MPa、温度为25°C。
6.根据权利要求3所述的中药复方提取物，其特征在于对二氧化碳超临界萃取后的药渣进行提取时，提取方式为加热回流提取、超声提取或者渗漉提取。
7.根据权利要求4所述的中药复方提取物，其特征在于对乙醇提取浸膏进行大孔吸附树脂富集时，使用的柱脂为D-101型或者AB-8型，以及其他非极性、弱极性或者中等极性大孔吸附树脂。
8.根据权利要求4所述的中药复方提取物，其特征在于对乙醇提取浸膏进行大孔吸附树脂富集时，洗脱溶剂为水或不同浓度的乙醇，依照乙醇浓度由低到高依次洗脱。
9.根据权利要求4所述的中药复方提取物，其特征在于对乙醇提取浸膏进行大孔吸附树脂富集时，将浸膏加适量水稀释后与等体积的D-101型大孔吸附树脂混合拌勻，上样于 D-101型大孔吸附树脂柱中(上样量以生药量与树脂量之比计算为1 2)，静态吸附30分钟，然后依次用10个柱体积的水、10个柱体积的20%乙醇和10个柱体积的50%乙醇进行洗脱，收集50%乙醇洗脱液，减压干燥后粉碎，制得棕色粉末。
10.权利要求1-9中任何一项所述的中药复方提取物在美白祛班的药物制剂、保健食品和化妆品中应用。
全文摘要
本发明涉及一种具有美白祛斑作用的中药复方提取物。本发明中的中药复方提取物是以白花败酱草、文冠果种仁、白鲜皮、仙鹤草、红景天、决明子、柏子仁、金荞麦、薄荷、甘草等十种中药为原料，采用二氧化碳超临界萃取技术和大孔吸附树脂富集技术，在一定工艺参数下提取制得的提取物。该提取物具有显著的酪氨酸酶活性抑制作用和黑色素生成抑制作用，该提取物可以直接安全地应用于美白祛斑的外用药物制剂及化妆品的制备。
文档编号A23L1/29GK102362842SQ20111029136
公开日2012年2月29日 申请日期2011年9月30日 优先权日2011年9月30日
发明者任燕冬, 刘海洋, 周琦, 张宁, 祁永华, 耿放, 赵旭 申请人:耿放