专利名称：一种控制水稻营养生长与花器官发育多效基因及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于植物基因工程领域。具体的说，涉及一种利用图位克隆技术克隆水稻营养生长与花器官发育的多效基因々iF7 (Dwarf and Deformed Flower 1)，并利用转基因互补实验验证了该基因的功能。同时，还涉及利用该基因调控水稻营养生长和生殖发育，即通过利用遗传工程的方法调节基因的表达，从而控制水稻的株型和育性，创造水稻育种新种质。因此，本发明对遗传改良水稻具有很好的应用前景。
背景技术：
植物的生长发育是一个极其复杂的过程。通常认为，生长是植物体积的增大，而发育则是在整个生活史中，植物体的构造和机能从简单到复杂的变化过程。营养生长是生殖生长的基础，如果营养生长不良，直接影响生殖生长或使生殖器官发育不良。因此，合理调节植物的营养生长与生殖发育在生产上具有重要的意义。花是植物的最显著特征，花的形成是植物生活史上的一个重大转折点，而且花器官的发育结果直接影响并决定农作物的产量和品质。因此，开展植物花发育研究具有重要意义。植物花器官的发育主要由花器官特征基因决定。利用大量花发育的同源异型突变体， 植物花器官发育分子遗传机理的研究在模式双子叶植物中取得重大突破，先后提出了花器官发育的“ABC”、“AB⑶”、“AB⑶E”以及“四因子”模型。现已明确，这些功能基因绝大多数属于MADS-box转录因子基因。植物花器官发育是一个复杂的过程，是由多种类型基因共同参与调控的复杂网络。除花器官发育特征基因外，其它花器官发育调节基因在花器官的形态建成中也发挥关键性的作用。近年来，越来越多的花器官发育调节基因相继被克隆。其中，F-box基因在植物中数量多、且分布广泛。它们通过泛素化蛋白酶体途径(ubiquitin proteasome pathway, UPP)在细胞周期调控、转录调控、细胞凋亡和信号转导等过程中发挥了重要功能。目前已从植物中鉴定出大量的F-box蛋白，它们在植物激素调控、营养生长和花器官发育等多种生物学过程中发挥着重要作用。其中，拟南芥的^/ {Unusual Floral Organs)是植物中鉴定出的第一个F-box基因(Levin et al.，1995 ；Ingram et al.，1997)， /ο 突变体的花发育明显异常(Lee et al.，1997)，其生物学功能可能是“B”类花器官特征基因的正调控因子。此外，呢喃届拟南芥的和mM突变体表型也出现明显变异，且“B”类花器官特征基因的功能增强(Ni et al., 2004)。有趣的是，植物中部分F-box基因的生物学功能表现出多效性，这些基因同时参与植物营养生长与生殖发育的调控。如水稻的仍基因同时影响水稻的营养生长和生殖发育在营养生长期，apol突变体的出叶速度快，叶片数增多；在生殖生长期，apol突变体的穗明显短小、一级枝梗数目和小穗数目变少，而且即07小穗发育明显异常(雄蕊转化为浆片、心皮畸形伸长、颖片心皮化)(Gonza et al. , 2007)。拟南芥M基因的表型功能与水稻A^V类似，它在调控拟南芥生长与发育过程中也起着重要作用。M基因的功能缺失导致植株过量生长，而花瓣底部边缘出现融合；相反，M基因过量表达植株明显矮小，而花瓣底部边缘提前分裂(Lee et al.，1997)。而拟南芥的JiCFZi基因的点突变可导致花器官数目减少、且4个叶轮发育明显缺陷。总之，F-box类基因广泛参与了植物生长发育过程的调节，在均衡植物的营养生长与生殖发育中起关键性作用，对其开展深入研究具有重要的意义。本发明利用一个植株矮化、花器官明显变异的突变体 / //7 {dwarf and deformed flower乃，通过图位克隆技术克隆了水稻的々iF7基因，该基因编码一个F-box蛋白。从 ddfl的花器官表型推断，DDFl基因在调控花器官发育方面的功能与 /州相似，可能是“B” 类基因的正调控因子，该基因的突变导致了水稻的雄蕊的发育异常。同时，由于^/7的植株矮小、叶片短细，推测该基因可能还参与了植物生长激素的信号传导等途径。总之，DDFl 是维持水稻正常的生长发育、调节植株的形态建成与花器官发育的重要多效基因。目前，已在水稻中发现687个F-box蛋白基因，推测其中至少有100多个与水稻生殖发育有关(Jain et al., 2007)，但绝大多数基因的生物学功能未知。目前，水稻中尚未见有类似^/7突变体的报道。利用ddfl突变体开展深入研究， 揭示该基因在决定植物的形态建成与器官发育方面的多重作用，将具有重要理论意义。同时，本发明也为利用遗传工程手段调节水稻等植物的营养生长与生殖发育之间的矛盾、创造植物新种质提供了新的途径。
发明内容
本发明的目的在于提供一种控制水稻营养生长与花器官发育的多效基因及其应用，该基因失活造成水稻植株明显矮化，花器官中雄蕊发育异常而不育。因此通过调节该基因在水稻不同部位或器官中的表达，利用该基因的转基因植株改良水稻的株型和育性，从而培育出理想株型(和)或雄性不育系新种质，可作为水稻育种的新材料。本发明的控制水稻营养生长与花器官发育的多效基因々iF7基因具有如％(1 ID No. 1所示的DNA序列，也包括与kq ID No. 1所示的DNA序列至少有90%同源性的基因序列。本发明中的ID No. 2所编码的蛋白质是一个F-box蛋白，其中包括进行一个或几个氨基酸替换、插入或缺失所获得的功能类似物。另外，也包括在^^ ID No. 1中添加、取代、插入或缺失一个或多个核苷酸而生成的突变体、等位基因或衍生物，具有相同功能的序列也能达到本发明的目的。本发明克隆的水稻々iF7基因的单碱基突变体^/7表现为植株明显矮小、小穗的雄蕊部分或全部退化、基本不育(见实施例1)。将正常功能的基因转化该突变体后，植株恢复正常表型(见实施例2)。本发明还提供一种用々iF7基因进行高效的植物转化的方法，具体地说，本发明提供Tkq ID No. 1所示的序列基因或该基因类似的部分功能片段的载体，如图4所示的 PCAMBIA1300- DDFl (见实施例2)。该载体还有一种含有以上表达载体的宿主细胞。该宿主细胞包括大肠杆菌、农杆菌和植物细胞。本发明利用反义RNA技术抑制水稻内源々iF7基因的表达，造成水稻株型不同程度矮化，同时小穗的雄蕊基本不育，可以培育水稻理想株型和(或)水稻不育系材料(见实施例 3)。具体地说，就是将々iF7基因与其它调控元件如组成型启动子(CaMV35S启动子)或器官特异性启动子融合构建基因抑制表达载体，通过转基因技术(如反义RNA或RNAi)人为控制水稻的株型和育性，创造新的水稻新种质，用于选育水稻新品种。实现本发明的具体技术步骤如下一.水稻ddfl突变体的分离和遗传分析
本发明从水稻(籼稻)育种材料中获得了一种营养生长与花器官发育均明显异常的突变体^/7。在营养生长阶段，该突变体表现为营养器官均明显细小，节间和叶片的细胞体积变小、数目减少；在生殖发育阶段，突变体的一、二次枝梗数和小穗数明显减少，穗长相应变短，小穗的内外稃不能完全闭合，雄蕊部分或完全转化为雌蕊，几乎所有小穗不能正常发育成种子。通过突变杂合体植株自交及与野生型植株正反交实验，证明^/7是一个符合单基因控制的遗传规律、如图1所示的隐性突变体。二、图位克隆控制水稻々iF7基因 1. DDFl的初步定位
为了分离々iF7基因，本发明采用图位克隆的方法，首先创建了一个F2定位群体，由 ddfl突变杂合体(基因型为/ ^^/"/)为母本，选用DZ60为父本杂交获得的F2中的ddfl 突变体组成。利用水稻RM系列微卫星标记对基因进行初步定位。定位结果如图2所示,DDFl基因初步定位在第6染色体短臂上的RM588和RM587之间两个标记之间。2. DDFl基因的精细定位
通过对RM588和RM587两个标记之间的BAC/PAC序列分析，开发出新的水稻SSR微卫星标记和InDel标记，将々iF7基因精细定位于如图3所示的BAC克隆AP003708上的DF7 和DF9之间约45 1Λ的范围内，通过分析此区段开放阅读框(ORF)推测侯选基因。进一步通过比对突变体与野生型的基因组序列，确定候选基因。3.々iF7基因的鉴定和功能分析
构建了一个如图4所示的互补实验载体。本发明通过转基因技术将互补载体转入^/7 突变体后获得了如图5所示的表型恢复正常的转基因水稻，证明了本发明正确克隆了々iF7 基因；氨基酸序列分析表明，/ ^编码一个F-box蛋白。三、抑制水稻内源々iF7的表达，培育理想株型的不育系材料
利用反义RNA技术抑制水稻内源々iF7基因的表达，造成水稻株型不同程度矮化，同时小穗雄蕊产生的花粉粒基本不育、部分雄蕊退化，可以培育出理想株型的水稻不育系材料 (见实施例3)
水稻是我国乃至世界的主要粮食作物。水稻生产在我国国民经济中占有举足轻重的地位，是我国第一大栽培作物，约占我国粮食总产量的40%。目前主要是利用杂交水稻的杂种优势来培育高产水稻品种。而株型改良对提高水稻产量具有重要的作用，并一直是品种选育的重要指标。从我国水稻产量的两次突破来看，矮秆品种比高秆品种增产、杂交稻比矮秆品种增产的主要原因是在株型改良中不断取得进步的结果。株型改良的第一阶段是矮化育种，第二阶段是理想株型育种，它的发展方向是形态与机能兼顾，理想株型与优势利用相结合。所以，理想株型的研究越来越受到育种家的重视和关心。基因工程技术使得应用々iF7 基因培养理想株型的水稻成为可能。本发明获得的水稻株型矮小、雄蕊退化而不育的突变体^/7，是单基因隐性突变， 符合孟得尔遗传规律。本发明通过图位克隆技术获得了々iF7基因，并通过功能互补实验鉴定了该基因的功能。氨基酸序列分析表明，该基因编码一个F-box蛋白，同时参与了水稻营养生长与生殖发育的调控，其生物学功能表现出多效性。因此，可以利用基因工程技术有目的地调节它在水稻中的表达，进而可培育出理想株型的水稻不育系新种质，从而可提高水稻的产量、提高杂交制种质量、降低生产成本。因此，该基因具有非常重要的应用价值和广阔的应用前景。
图1水稻野生型与对应突变体W/7的表型。图IA 野生型与对应突变体ddfl的植株表型。图IB 野生型与对应突变体 / //7的小穗表型。图IC -.ddfl突变体的小穗表型(张开内、外稃片)。图ID ,ddfl突变体小穗的表型(去除内、外稃片)。图2 ,DDFl基因在水稻第6染色体上的初步定位图。图3 ,DDFl基因精细定位及候选基因确定图。图4 互补实验载体pCAMBIA1300-々iF7图谱。图5 野生型、 / //7突变体与转基因水稻Ttl代互补株系的表型图。图5Α 野生型(wild)、W/7突变体与一个Ttl代互补株系(line 1)的表型图。图5B 野生型(wild)、ddfl突变体与一个Ttl代互补株系(line 1)的一次枝梗的表型图。图5C 野生型小穗的形态结构。
图5D ,ddfl突变体小穗的形态结构。图5E =Ttl代互补株系的小穗形态结构。图6 反义表达载体pTCK303 -.DDFl-cMk图谱。图7 野生型(wild)与4个转反义表达载体获得的Ttl株系(line 1 line 4)表达水平对比分析图。图8 野生型与转反义表达载体的Ttl代转基因植株的表型图。图8A 野生型与4个转基因的Ttl代株系表型图。图8B 野生型(左)与转反义表达载体的Ttl代植株(右)的一次枝梗形态图。图8C 野生型小穗的花器官(去除内、外稃片)。图8D 转反义表达载体的Ttl代植株的小穗外形。图8E和图8F 转反义表达载体的Ttl代植株小穗的花器官(去除内、外稃片)。图8G 野生型植株产生的正常发育的花粉粒。图8H 转反义表达载体的Ttl代植株产生的不育花粉粒。
具体实施例方式实施例1 水稻DDFl基因的图位克隆 1.水稻材料
水稻(ftrza sativa L.)突变体W/7，原始野生型亲本为籼型水稻。该突变体为本发明者从籼型水稻育种中间材料中获得。2.分析和定位群体
突变杂合体0 ^^/"/ )与野生型品种DZ60进行杂交，F1代自交，得到F2群体，在水稻分蘖盛期选出3632个^/7突变表型的植株作为定位群体，每株取1克左右的叶片，用来提取总DNA。
3.利用水稻微卫星标记(RM与SSR)和InDel标记定位々iF7基因
采用水稻微量法快速抽提水稻的总DNA。取大约0. 3克水稻叶片，放入1. 5ml离心管中经液氮快速冷冻，用小塑料研棒研成粉末后提取DNA，获得的DNA溶于100 ul超纯水中。 每一个20 ul的反应体系中加入1 ul DNA样品。IDDFl基因的初步定位实验中，利用DNA池的定位方法，选175个F2群体中的突变体个体用水稻RM系列微卫星进行分析。根据公布的水稻SSR遗传图谱，按照一定的遗传距离，均勻选取分布于各条染色体上的RM引物进行PCR扩增，然后在6%的非变性聚丙烯酰胺凝胶上分离和硝酸银染色，检测PCR产物的多态性，将々iF7基因初步定位在水稻第6染色体短臂上的RM588和RM587两个标记之间。在精细定位々iF7基因时，对F2群体中的3632个突变体个体进行SSR标记和InDel 标记的连锁分析。根据分子标记RM588和RM587之间的BAC序列分析，利用已公布的水稻基因组序列，设计了 20对SSR引物和6对hDel引物用于精细定位々iF7基因，其中有6 对SSR引物和1对hDel引物(引物序列见表1)在两个亲本间有多态。用这7个有多态的标记对F2群体中的3632个突变体个体进行了连锁分析。表1用于精细定位DDFl基因的引物序列
根据精细定位的结果，々々Ζ7/基因位于BAC克隆ΑΡ003708上的DF7和DF9之间约45 kb 的范围内。根据TIGR (http://rice, plantbiology. msu. edu/)网站上提供的基因注释信急、，DDFl基因所在的451Λ区间内共有8个基因，包括如图3所示的2个F_box蛋白基因(分别命名为F-boxl和F-box2)、1个转座子基因和5个假设蛋白基因(分别命名为H1—H5)。 基因组序列分析结果表明，该区域内的一个F-box基因(F-box 2)发生了单碱基(A — Τ)突变，导致其中的Arg251变为Tyr251，而其余7个基因的基因组序列在突变体和野生型中完全一致。因此，将该F-box基因作为DDFl的候选基因。
实施例2 互补实验
1.构建互补实验载体
根据籼稻明恢86基因的序列，利用pCAMBIA1300载体构建了如图4积示DDFl侯选基因的互补实验载体PCAMBIA1300- DDFl0载体构建的具体过程是在候选的F_box基因区和启动子区设计一对带有酶切位点的引物，利用高保真酶进行高保真PCR扩增并测序，挑选序列完全正确的克隆，经酶切和连接，构建成如图4所示的表达载体，再将其转入农杆菌中。该互补载体的DNA序列为8869bp，包括起始密码前3740bp和终止密码后609bp片段。 扩增互补实验的DNA序列所用引物是(下划线部分为酶切位点与保护碱基) 上游引物5，-AACTGCAGGCAACGCATGGGCATTCAGC-3‘ 下游引物5，-TCCCCCGGGACGGACCGGTCTCAAACTGAACACT-3‘
2.互补实验
突变体愈伤组织的培养由于突变体不育，无法收获种子，因此突变基因只能由杂合体种子0 ^/ 保存，其自交后代会分离出突变体。同时，由于^/7为籼稻品种，通过农杆菌介导进行遗传转化比较困难，所以互补试验所用种子是以突变杂合体0 ^ ddfl) 与粳稻品种中花15杂交后再与中花15连续回交2代后，从中鉴定出杂合体植株上收获的种子，按单粒培养成熟胚愈伤组织，以保证每一粒种子形成的愈伤互不混杂。突变体愈伤组织基因型的鉴定因 / //7的表型由单碱基突变引起，采用J^fNI内切酶进行酶切的方法可以将单粒种子培养的愈伤组织基因型加以区分。具体方法是，提取单粒种子的少量愈伤组织DNA，用1对引物扩增出1174bp的基因组序列；用J^rNI内切酶对PCR产物进行酶切后电泳。结果是野生型UJDF 1 DDFl)有857bp和317bp两条带，杂合基因型UJDFl ddfl)有1174bp、857bp和317bp三条带，而突变体DNA不能被切开而只有 1174bp的条带。PCR扩增所用的引物序列为上游引物5’ -TTATGCCATTGAATAACATGC-3’
下游引物5’ -GCCTATCATTAGTGTGTCAGGT-3，。遗传转化利用愈伤侵染法技术转化^/7突变体的愈伤组织。挑选生长迅速、 颜色鲜黄、表面光滑、质地致密、直径大小为2-3mm的胚性愈伤组织颗粒作转化的受体。用含有双元质粒载体的农杆菌EHA105菌株浸染水稻愈伤，置25°C条件下暗培养3天后，在含有30 mg/L Hygromycin的筛选培养基上培养15天，后再重复筛选培养一次；30天后，将筛选出的愈伤组织转至含有50 mg/L Hygromycin的筛选培养基上继续筛选一周。将继续增生分裂的抗性愈伤转入分化培养基上于光照条件下培养，一周后愈伤开始转绿，三周后开始长出幼芽和根，当芽长至2-3cm时，移至1/2MS培养基上，待幼苗在生根培养基上生长 10天后，在水中炼苗三天，移至大田。对突变体胚性愈伤转基因后所获得的14个再生植株进行鉴定和连续的观察，显示转基因水稻植株生长发育状况如图5所示，所有转基因植株营养生长与花器官发育正常，与野生型比较没有明显区别，说明该侯选的F-box蛋白基因 MMlDDFI。实施例3抑制水稻内源DDFl的表达培育理想株型和育性的新种质首先提取野生型水稻叶片总RNA，然后反转录成cDNA，以cDNA为模板PCR扩增出
的cDNA序列；PCR产物经回收、纯化后连接到pGEMT-easy载体上；经测序确认完全正确后， 同时用Bamm和feci双酶切pGEMT-easy载体及pTCK303载体，酶切产物分别回收后，利用 T4 DNA连接酶进行连接，将々iF7的cDNA反向连接到pTCK303载体W^iquitin启动子的下游，构建成如图6所示的表达载体，再将其转入农杆菌中。T^DDFl的cDNA所用引物序列为(下划线分别为酶切位点Sacl和汉3 H1)上游引物5’ -CGAGCTCGGAGAGAGATCCCCTCACC ACCATG-3’
下游引物5，-CGGGATCCCAGAATCATCATCAGCAGCAGCACG-3。利用愈伤侵染法技术将构建好的反义RNA载体转化水稻品种中花种子诱导的愈伤组织中，获得转反义RNA的转基因植株(转化方法同实施例2的第二部分)。以转化 PTCK303空载体分化出的植株作对照。通过本实施例申请人共获得36个独立的转化苗。进一步用定量PCR 'Mf^DDFl在部分干扰植株中的表达水平与转基因植株的表型之间的关系，结果如图7和图8所示，随着干扰程度的增强，干扰植株的株高逐渐降低。而且，所有干扰植株的花器官均表现出发育异常，如图8所示，雄蕊畸形，并产生干瘪且数量减少的花粉，花粉完全不育。可见，利用反义 RNA抑制水稻内源々iF7的表达后，转基因植株显示出与^/7类似表型。因此，可以利用遗传工程的方法，通过控制水稻内源i^H的表达，以培育理想株型和雄性不育系的新种质。以上所述仅为本发明的若干个具体实施方式
，应当指出，对与本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。参考文献
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1.DDF1基因在控制水稻营养生长与花器官发育、特别是雄蕊发育中的应用，其特征在于，所述的々iF7基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO. 1所示。
2.DDF1基因在控制水稻营养生长与花器官发育、特别是雄蕊发育中的应用，其特征在于，所述的^5 基因编码的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO. 2所示。
3.权利要求1或2所述的基因在培育水稻理想株型和水稻雄性不育系中的应用。
全文摘要
本发明属于植物基因工程技术领域，公开了一种控制水稻营养生长与花器官发育多效基因DDF1及其应用。具体涉及一个控制水稻营养生长与花器官发育多效基因的定位、克隆、功能验证和应用。所述的DDF1基因的核苷酸序列如序列表SEQIDNO.1所示，其编码的氨基酸序列如序列表SEQIDNO.2所示。DDF1决定水稻的营养生长和花器官发育，特别是雄蕊的发育。利用基因工程技术有目的地调控该基因在水稻中的表达，可以调节水稻的株型和育性，创造水稻育种新种质。因此，本发明对遗传改良水稻具有很好的应用前景。
文档编号C12N15/84GK102321633SQ20111029478
公开日2012年1月18日 申请日期2011年9月28日 优先权日2011年9月28日
发明者兰涛, 吴为人, 周元昌, 官华忠, 李生平, 段远霖, 郑蕾蕾, 陈志伟 申请人:福建农林大学