专利名称：一株具有水稻促生功能的根瘤菌及其用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及具有促进植物生长功能的根瘤菌及其用途。
背景技术：
植物内生菌是指能够定殖在植物各种组织和器官的细胞间或细胞内、并与植物建立和谐联合关系的一类微生物，包括真菌和细菌。一部分植物内生细菌可通过分泌生长素，富集根际土壤中的铁离子和固氮作用等不同机制，对植物发挥抗生促生作用，为我们提供了一类新的微生物资源。近年来，有关植物内生细菌的论著数量日趋增加，随着植物内生细菌研究的深入，不同学者从不同植物中不仅分离鉴定出多种细菌新种，还获得了一大批具 有防病、促生或固氮等生物学功能的内生细菌，显示出了良好的研究和应用前景，已成为植物学、微生物学、植物保护学及植物育种学等多学科的研究热点。近年来的研究发现，在自然条件下，根瘤菌作为多种非豆科植物的内生菌广泛存在，如棉花、玉米、小麦、油菜、甘蔗、胡萝卜、水稻等植物。从不同地区不同品种的水稻中，已报道的内生根瘤菌主要包括如下Rhizobium leguminosarum、R. loti、R. oryza、Bradyrhizobium elkanii、B. japonicum、Azorhizobium cau Linodans^Ensifer (Sinorhizobium)meliloti^Mesorhizobium hukuii 以及 Agrobacterium 属不同种的菌株等，同时还从在水稻根部分离到可与菜豆结瘤的Burkholderia cepacia菌株,根瘤菌能够定殖在植株根、茎、叶组织但并不形成真正的根瘤。目前的许多试验已经证明，根瘤菌对水稻的生长有着促进作用。在埃及，将水稻和埃及车轴草进行轮作系统已经有几个世纪的历史，这种轮作系统好像是R. leguminosarum bv. trifolii的生物库。从水稻根内分离到的R. leguminosarum bv. trifolii接种水稻的田间试验表明，根瘤菌可以显著地提高水稻的产量和氮利用率(Nitrogen-use efficiency, NUE),并增加产量的30%或者更高，尤其是施肥量在推荐水平的三分之一的情况下增产更加明显。然而，进一步研究表明，产量的增加并不是因为生物固氮作用，而是归功于根的结构变化，通过根瘤菌分泌的植物生长素IAA和GA7刺激根的结构发生改变，加强了对氮和土壤中其他营养物地摄取，从而促进作物的增长，增加作物产量及氮利用率。Biswa等用六种不同的根瘤菌接种水稻也得到上述相似的结果，可分别提高水稻产量的8% -22%和秸杆产量4% -19%, N、P、K的吸收增长10% -28%, Fe的吸收增长10% -64%。利用N15同位素研究同样发现，氮吸收的增加并非是因为生物固氮，而是产生IAA及根的结构变化。Singh等分离自无菌水稻根部、可与扁豆结瘤固氮的三株菌，其中两株属于Burkholderia cepacia,另一株为R. leguminosarumbv. phaseoli，在温室条件下，可显著促进水稻产量和植物量。还有研究发现，接种根瘤菌对水稻植株的光合作用产生影响，并提高水稻产量。也有报道根瘤菌在水稻植株中具有固氮功能。在非洲，Chaintreuil等从敏感和萌(Aeschynomene sensitiva,一种豆科植物)生长的湿地中采集的野生稻根部分离到20株慢生根瘤菌菌株，在温室条件下接种水稻，用乙烯还原法可以测得固氮酶活性，并可以提高水稻产量20%。
发明内容
本发明的目的是提供能够促进植物生长，有效固氮的细菌。本发明所提供的细菌为祁阳根瘤菌(Rhizobium qiyangensis) ZYY136,该菌株已于2011年08月19日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为北京市朝阳区北辰西路I号院3号)，保藏编号为CGMCC No. 5171。本发明的另一个目的是提供一种菌剂，它的活性成分为所述的祁阳根瘤菌(Rhizobium qiyangensis)ZYY136CGMCC No. 5171。该菌剂除包含作为活性成分的祁阳根瘤菌(Rhizobium qiyangensis)ZYY136CGMCC No. 5171外，还可包括辅料，如草炭、动物的粪便、各类作物的秸杆、松壳、稻
草、花生皮等。该菌剂可用于促进植物生长、用于固氮、用于产生固氮酶、用于产生吲哚乙酸(IAA)等。在本发明的实施例中所述植物具体为水稻。所述的祁阳根瘤菌(Rhizobiumqiyangensis)ZYY136CGMCC No. 5171 在制备下述I)-4)中任一的菌剂中的应用也属于本发明的保护范围I)用于促进植物生长的菌剂；2)用于固氮的菌剂；3)产生固氮酶的菌剂；4)产生吲哚乙酸(IAA)的菌剂。在本发明的实施例中所述植物具体为水稻。所述的祁阳根瘤菌(Rhizobiumqiyangensis)ZYY136CGMCC No. 5171、或所述菌剂在促进植物生长、生产固氮酶、及生产生物有机肥中的应用也属于本发明的保护范围。在本发明的实施例中所述植物具体为水稻。本发明的再一个目的是提供一种生物有机肥，所述生物有机肥含有所述的祁阳根瘤菌(Rhizobium qiyangensis)ZYY136CGMCC No. 5171、或所述的菌剂。本发明的又一个目的是提供培养所述祁阳根瘤菌(Rhizobium qiyangensis)ZYY136CGMCC No. 5171的方法，该方法包括将祁阳根瘤菌(Rhizobium qiyangensis)ZYY136CGMCC No. 5171在用于培养根瘤菌的培养基中培养的步骤。本发明的又一个目的是提供所述菌剂的制备方法，该方法包括如下步骤将所述的祁阳根瘤菌(Rhizobium qiyangensis)ZYY136CGMCC No. 5171作为活性成分,得到所述菌剂。本发明经分泌植物生长素性能及固氮酶活性促生功能测定及大试管和盆栽实验发现，祁阳根瘤菌(Rhizobium qiyangensis)ZYY136CGMCC No. 5171对水稻有较强促生作用，体现在以下几方面每毫升0D600值为I的祁阳根瘤菌(Rhizobium qiyangensis)ZYY136CGMCC No. 5171 发酵液分泌 IAA 量达 98. 65 y g ;祁阳根瘤菌(Rhizobiumqiyangensis) ZYY136CGMCC No. 5171 的固氣酶活性为 12. 18nmol mg 1 h 1 ;祁阳根瘤菌(Rhizobium qiyangensis)ZYY136CGMCC No. 5171菌株浸种处理，水稻植株地上部鲜重质量相对未接种的阴性对照组增加133. 36% ;干重质量相对未接种的阴性对照组增加150% ;植株高度相对未接种的阴性对照组增加30.27%。这表明祁阳根瘤菌(Rhizobiumqiyangensis) ZYY136CGMCC No. 5171能够分泌植物生长素IAA，又具有较高固氮酶活性，可在其生长过程中为植物体输送必要的氮素营养，盆栽结果更加直观的显示其对水稻具有较强的促生作用，有利于其在农业生产上的应用。
图I为灭菌土盆栽的水稻幼苗。其中CK表示以无菌水代替祁阳根瘤菌(Rhizobiumqiyangensis)ZYY136CGMCC No. 5171 菌液的阴性对照。保藏说明 菌种名称祁阳根瘤菌拉丁名(Rhizobiumqiyangensis)菌株编号ZYY136保藏机构中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏机构简称CGMCC地址北京市朝阳区北辰西路I号院3号保藏日期2011年08月19日保藏中心登记入册编号CGMCC No. 517具体实施例方式本研究采用多相分类方法确定水稻根内生细菌ZYY136菌株的分类地位，对其分泌生长素和固氮酶活性进行研究，并利用盆栽试验等检测其促生功能。下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。R2A固体培养基的配方0. 5g酵母浸粉,0. 5g胰蛋白胨,0. 5g酪蛋白氨基酸,0. 5g葡萄糖，0.5g可溶性淀粉，0.3g丙酮酸钠，0.3g K2HPO4jO. 05g MgSO4 7H20，琼脂20g，去离子水定容至IOOOmL, pH为7. 2 ±0. 2。R2A液体培养基的配方0. 5g酵母浸粉,0. 5g胰蛋白胨,0. 5g酪蛋白氨基酸,0. 5g葡萄糖，0. 5g可溶性淀粉，0. 3g丙酮酸钠，0. 3g K2HPO4jO. 05g MgSO4 *7H20,0. 2g L-色氨酸，去离子水定容至IOOOmL, pH为7. 2±0. 2。改良YMA固氮培养基的配方10g甘露醇，Ig酵母膏，0. 5g K2HPO4,0. 2gMgS04 7H20，0. Ig NaCl，0. 05g (NH4) 2804，0. 00121g Na2MoO4 2H20，5g 蔗糖，20g 琼脂，去离子水定容至lOOOmL，pH为6. 8-7. 0。实施例I、内生细菌ZYY136的分离与鉴定一、内生细菌ZYY136的分离取采自中国农业科学院祁阳红壤实验站(中国湖南省祁阳县官山坪村)的长期稻-稻-紫云英轮作(高菊生，徐明岗，秦道珠.长期稻-稻-紫云英轮作对水稻生长发育及产量的影响.湖南农业科学.2008，(6) :25-27.)的健康水稻根部，水稻根表面采用乙醇-次氯酸钠联合灭菌(孙磊，宋未.非培养方法和培养方法对水稻内生细菌和根结合细菌的研究.首都师范大学博士学位论文.2006.)，按照参考文献(朱凤，陈夕军，童蕴慧，等.水稻内生菌的分离及其拮抗性与潜在致病性测定.中国生物防治，2007，23 (I)68-72.)所述梯度稀释的方法，在R2A固体培养基上涂布分离，28°C培养48h，挑取平板上单菌落划线纯化，得到纯化菌株，接斜面置于4°C冰箱内保存。将其中一株分离纯化所得的内生细菌命名为ZYY136。二、内生细菌ZYY136的鉴定从以下几个方面鉴定步骤一分离并纯化得到的内生细菌ZYY136。I、形态学鉴定一方面，将处于对数生长期，且菌落大小稳定，上述步骤一分离并纯化得到的内生细菌ZYY136进行单菌落状态描述，主要包括菌落的大小、颜色、透明度、湿润度、菌落表面状态(是否平坦、突起、褶皱、凹陷等)、菌落边缘状态(是否整齐、不规则、放射状等)。另一方面，对处于对数生长期的所述内生细菌ZYY136，经涂片染色后采用光学显微镜观察菌 体的形态。分离并纯化得到的内生细菌ZYY136的单菌落偏小，圆形，直径lmm-2mm，呈乳白色，不透明，较湿润，菌落表面凸起，菌落边缘整齐。对处于对数生长期的所述内生细菌ZYY136，经涂片染色后采用光学显微镜观察其菌体为革兰氏染色阴性，细杆状，无芽孢。2、16S rDNA序列同源性分析采用菌落PCR方法扩增步骤一所得的内生细菌ZYY136的16S rDNA片段，相关试剂由全式金公司提供。具体操作步骤如下先在I. 5mL离心管中加入50 无菌水，用灭菌牙签挑取少量菌体于水中制成菌悬液，开水煮沸lOmin，迅速放入冰中5min, 4 °C 12000r/min离心5min,上清液作为PCR模板。用细菌16S rDNA通用引物27F(5’ -AGAGITTGATCCTGGCTCAG-3’ )和 1492R(5’ -GGTTACCTTGTTACGACTT-3 ’)对内生细菌ZYY136的16S rDNA部分片段进行扩增。反应体系(50 y L) :10Xbuffer (5 y L)、dNTP(2. 5m mol/L)4u L,引物 27F(10m mol/L)2u L,引物 1492R(10m mol/L)2u L,Taq酶(5U/L) 0. 25 ii L、5 ii L上清液作为模板、ddH20补足至50 ii L。PCR反应程序94 °C 5min ；94 °C lmin，52 °C lmin，72 °C lmin，30 个循环；72 °C IOmin0 将扩增片段克隆到载体PEASY-Tl (天根公司)，用蓝白斑筛选的方法选取阳性克隆，委托北京宝瑞通公司以17和SP6作为测序引物双向测序。相关序列通过Eztaxon server
2.I (http ://147. 47. 212. 35:8080/)进行序列分析。通过16S rRNA基因片段进行扩增并克隆测序，获得长度为1442bp片段，其序列详见序列表中序列I。将该基因序列在Eztaxon网站进行相似性比对，结果表明菌株ZYY136的16s rDNA序列与Rhizobium alkalisoli的相似性最高为96. 174%,低于97% ,可初步确定该菌株为Rhizobium属中的新种。3、C/N源利用的测定利用C/N源培养基测定其对唯一碳源和唯一氮源的利用。测定结果见表I。其碳源利用结果表明ZYY136可以较好的利用D-阿拉伯糖、果糖、D(+)_半乳糖、肌醇、乳糖、苹果酸钙、麦芽糖、松三糖、蜜二糖、丙酮酸盐、鼠李糖、乙酸钠、琥珀酸钠、蔗糖、酒石酸钠、海藻糖、木糖、L-甲硫氨酸为唯一碳源提供能量；对糊精、D-甘露醇、D-葡萄糖酸钠、D-山梨糖醇、DL-天冬氨酸、L-苏氨酸利用能力很弱；不能利用葡萄糖、菊糖、淀粉、甘氨酸。氮源利用结果表明ZYY136可以较好利用L-精氨酸、L-胱氨酸、D-谷氨酸、L-赖氨酸、L-苯丙氨酸、甘氨酸、L-甲硫氨酸为唯一氮源提供能量；对DL-丙氨酸、D-苏氨酸、D-缬氨酸利用能力很弱、不能利用L-苏氨酸。表I ZYY136菌株及近缘菌碳源、氮源利用比较
权利要求
1.祁阳根瘤菌(Rhizobiumqiyangensis) ZYY136,它在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCC No. 5171。
2.一种菌剂，它的活性成分为权利要求I所述的祁阳根瘤菌(Rhizobiumqiyangensis)ZYY136CGMCC No. 5171。
3.根据权利要求2所述的菌剂，其特征在于所述菌剂为下述I)-4)中任一的菌剂 1)用于促进植物生长的菌剂； 2)用于固氮的菌剂； 3)产生固氮酶的菌剂； 4)产生吲哚乙酸的菌剂。
4.权利要求I 所述的祁阳根瘤菌(Rhizobium qiyangensis)ZYY136CGMCC No. 5171 在制备下述I)-4)中任一的菌剂中的应用 1)用于促进植物生长的菌剂； 2)用于固氮的菌剂； 3)产生固氮酶的菌剂； 4)产生吲哚乙酸的菌剂。
5.权利要求I 所述的祁阳根瘤菌(Rhizobium qiyangensis)ZYY136CGMCCNo. 5171、或权利要求2或3所述菌剂在促进植物生长中的应用；或 权利要求I所述的祁阳根瘤菌(Rhizobium qiyangensis)ZYY136CGMCC No. 5171、或权利要求2或3所述菌剂在生产固氮酶中应用；或 权利要求I所述的祁阳根瘤菌(Rhizobium qiyangensis)ZYY136CGMCC No. 5171、或权利要求2或3所述菌剂在生产生物有机肥中应用。
6.根据权利要求3所述菌剂，或权利要求4或5所述应用，其特征在于所述植物为水稻。
7.含有权利要求I所述的祁阳根瘤菌(Rhizobiumqiyangensis) ZYY136CGMCCNo. 5171、或权利要求2或3所述菌剂的生物有机肥。
8.培养权利要求I 所述的祁阳根瘤菌(Rhizobium qiyangensis) ZYY136CGMCCNo. 5171的方法，包括将祁阳根瘤菌(Rhizobium qiyangensis)ZYY136CGMCC No. 5171在用于培养根瘤菌的培养基中培养的步骤。
9.权利要求2或3所述菌剂的制备方法，包括如下步骤将权利要求I所述的祁阳根瘤菌(Rhizobium qiyangensis)ZYY136CGMCC No. 5171作为活性成分,得到所述菌剂。
全文摘要
本发明公开了具有促进植物生长功能的根瘤菌及其用途。该根瘤菌是祁阳根瘤菌(Rhizobium qiyangensis)ZYY136，在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏号为CGMCC No.5171。本发明所提供的祁阳根瘤菌(Rhizobium qiyangensis)ZYY136 CGMCC No.5171分泌IAA的能力可达到98.65μg每毫升OD600值为1的祁阳根瘤菌(Rhizobium qiyangensis)ZYY136 CGMCC No.5171发酵液；固氮酶活性为12.18nmol·mg-1·h-1；浸种处理后水稻植株其地上部鲜重质量相对未接种的阴性对照组增加133.36％；干重质量相对未接种阴性对照组增加150％；植株高度相对未接种阴性对照组增加30.27％。这表明祁阳根瘤菌(Rhizobium qiyangensis)ZYY136 CGMCC No.5171菌株对水稻具有较强的促生作用，有利于其在农业生产上的应用。
文档编号C12N1/20GK102643761SQ20111030139
公开日2012年8月22日 申请日期2011年10月8日 优先权日2011年10月8日
发明者姜瑞波, 张晓霞, 曹卫东, 曹艳花, 马晓彤, 高菊生 申请人:中国农业科学院农业资源与农业区划研究所