专利名称：青虾kspi基因、其扩增方法及扩增引物组的制作方法
技术领域：
本发明涉及基因克隆领域，特别涉及青虾KSPI基因、其扩增方法及扩增引物组。
背景技术：
丝氨酸蛋白酶抑制因子(Serine proteinase inhibitor, SPI)是一类广泛存在于各种生物体内的蛋白，在变态、伤口愈合、先天免疫等过程中具有重要的作用。丝氨酸蛋白酶抑制因子主要包括serpin、α -巨球蛋白、Kazal型、Kunitz型等抑制因子家族，其中 Kazal 型丝氨酸蛋白酶抑制因子(Kazal-type serine proteinase inhibitor, KSPI)是研究最广泛的酶抑制因子家族之一。KSPI最早发现于哺乳动物，随后又在克氏原蜜虫下{Procambarus e/ar左ii)、南美白对虫下{Litopenaeus vannamei) >3 i X^tIf {Penaeus fflo/ (9￡/o/ )、罗氏沼虫下(Macrobrachium rosenbergii) >{Toxoplasma gondii)禾口家H
iBombyx mori)等多种动物中被鉴定。KSPI在抗凝血、调控自我吞噬和机体防御等过程中具有重要的作用。最近研究发现，KSPI在生殖方面有着重要的功能。Li等在罗氏沼虾的研究中发现，KSPI能够抑制生殖腺中精子明胶酶的活性，推测KSPI可能在罗氏沼虾生殖过程中发挥某种重要作用。Jalkanen等在小鼠的研究中发现，KSPI对小鼠精子的成熟起调节作用。青虾(Macrobrachium nipponense)是我国重要的淡水养殖经济品种。目前青虾的分子研究多集中在群体遗传多样性方面，其基因克隆研究较少，而对青虾KSPI基因克隆的研究尚未见报道。本研究拟以青虾为实验材料，根据本实验室青虾精巢CDNA文库中筛选到的一个KSPI基因片段，通过RACE技术克隆出该基因全长cDNA序列，以期为后续青虾KSPI 基因功能的研究奠定基础，同时为甲壳类生殖研究积累背景资料。
发明内容
有鉴于此，本发明提供青虾KSPI基因、其扩增方法及扩增引物组。利用本发明提供的引物组从青虾精巢组织中克隆到了 KSPI基因序列，对青虾KSPI基因功能的研究奠定基础， 同时为甲壳类生殖研究积累背景资料。为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案
本发明提供了青虾KSPI基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO: 1所示。本发明还提供了用于扩增青虾KSPI基因的引物组，其由如下引物组成 引物组
正向外引物3 KSPI 1的核苷酸序列如SEQ ID N0:2所示； 正向内引物3 KSPI 2的核苷酸序列如SEQ ID N0:3所示； 反向外引物5 KSPI 1的核苷酸序列如SEQ ID N0:4所示； 反向内引物5 KSPI 2的核苷酸序列如SEQ ID N0:5所示。本发明还提供了一种扩增青虾KSPI基因的方法，包括如下步骤步骤1 获得青虾脑组织总RNA ； 步骤2 合成cDNA ；
步骤3 从本实验室构建的青虾精巢cDNA文库中筛选到KSPI基因片段，以此作为中间序列；
步骤4 用引物组扩增获得青虾KSPI基因片段的3’端和5’端片段；所述引物组由如下引物组成
正向外引物3 KSPI 1的核苷酸序列如SEQ ID N0:2所示； 正向内引物3 KSPI 2的核苷酸序列如SEQ ID N0:3所示； 反向外引物5 KSPI 1的核苷酸序列如SEQ ID N0:4所示； 反向内引物5 KSPI 2的核苷酸序列如SEQ ID N0:5所示。步骤5 将所述KSPI基因cDNA序列的中间片段、所述KSPI基因的3’端和5’端片段拼接，即得。作为优选，步骤4所述扩增为套式两轮PCR。本发明以青虾精巢组织为材料，分离了青虾KSPI基因全长cDNA序列，利用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)、嵌套聚合酶链反应(NeSted-PCR)、3，端cDNA快速扩增 (3，-RACE)以及5，端cDNA快速扩增(5，-RACE)的方法，对青虾KSPI基因进行了研究，首次从青虾精巢组织中克隆到了 KSPI基因全长cDNA序列，并对其所编码的KSPI的序列特征、同源性、进化地位进行了分析，为进一步研究青虾KSPI基因的表达、功能研究奠定了基础，同时也为甲壳类生殖研究提供了新的材料。
具体实施例方式本发明公开了青虾KSPI基因、其扩增方法及扩增引物组。本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。本发明提供了青虾KSPI基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO: 1所示。本发明还提供了用于扩增青虾KSPI基因的引物组，其由如下引物组成 引物组
正向外引物3 KSPI 1的核苷酸序列如SEQ ID N0:2所示； 正向内引物3 KSPI 2的核苷酸序列如SEQ ID N0:3所示； 反向外引物5 KSPI 1的核苷酸序列如SEQ ID N0:4所示； 反向内引物5 KSPI 2的核苷酸序列如SEQ ID N0:5所示。其中，正向外引物3 KSPI 1、正向内引物3 KSPI 2与反向引物——3' RACE试剂盒中提供的3' RACE Outer Primer和3' RACE Inner Primer用于扩增核苷酸序列如 SEQ ID NO: 1所示青虾KSPI基因的3，端片段；
反向外引物5 KSPI 1、反向内引物5 KSPI 2与正向引物——5' RACE试剂盒中提供的 5' RACE Outer Primer 和 5' RACE Inner Primer 用于扩增核苷酸序列如 SEQ ID N0:1所示青虾KSPI基因的5’端片段。本发明还提供了一种扩增青虾KSPI基因的方法，包括如下步骤 步骤1 获得青虾脑组织总RNA ；
步骤2 合成cDNA ；
步骤3 从本实验室构建的青虾精巢cDNA文库中筛选到KSPI基因片段，以此作为中间序列；
步骤4 用引物组扩增获得青虾KSPI基因片段的3’端和5’端片段；所述引物组由如下引物组成
正向外引物3 KSPI 1的核苷酸序列如SEQ ID N0:2所示； 正向内引物3 KSPI 2的核苷酸序列如SEQ ID N0:3所示； 反向外引物5 KSPI 1的核苷酸序列如SEQ ID N0:4所示； 反向内引物5 KSPI 2的核苷酸序列如SEQ ID N0:5所示。步骤5 将所述KSPI基因cDNA序列的中间片段、所述KSPI基因的3’端和5’端片段拼接，即得。作为优选，步骤4所述扩增为套式两轮PCR。使用ClustalWl. 83将KSPI蛋白序列与已公布的部分甲壳类KSPI蛋白序列进行了比对。比对结果显示，青虾KSPI蛋白序列与罗氏沼虾最为相似。通过对青虾中获得的KSPI基因cDNA编码的氨基酸序列与其它甲壳类KSPI氨基酸序列，利用DNAstar软件进行alignment分析和使用MEGA 4构建NJ系统发育树，可以看出青虾KSPI与同样来源于精巢的罗氏沼虾KSPI进化关系最近聚为一支，其他虾类来源于肝胰腺和血细胞的KSPI聚为另外两支。本发明中青虾由太湖无锡湖区渔民提供，试剂均可由市场够得，纯化及cDNA第一链合成试剂盒购自上海生工生物工程有限公司(Sang0n)，3'及5' RACE试剂盒购自宝生物(大连)有限公司(Takara)。下面结合实施例，进一步阐述本发明 实施例1
总RNA提取逐个取青虾精巢组织，迅速放入盛有液氮的预冷研钵中，共取三只青虾的精巢组织共约30mg，解剖速度要快并且注意添加液氮；总RNA的提取使用Takara公司的 RNAiso Plus提取试剂结合传统的酚仿抽提法进行，提取方法参照使用说明书。cDNA第一链合成据上海生工生物工程有限公司(Sangon) cDNA合成试剂盒说明书进行。青虾KSPI基因全长cDNA序列的克隆
根据本实验室构建的青虾精巢cDNA文库中筛选到的KSPI基因片段设计引物，用于3’ 端、5’端快速扩增，得到青虾KSPI基因全长cDNA序列； KSPI基因cDNA 3，端快速扩增(3，-RACE) 根据KSPI基因中间片段序列，设计特异性正向引物3 KSPI 1和3 KSPI 2 ；与正向引物3 KSPI 1和3 KSPI 2相配对反向引物是3' RACE试剂盒中提供的3‘ RACE Outer Primer 和 3' RACE Inner Primer，进行 cDNA 3，快速扩增，操作步骤按 TaKaRa 3，-RACE 试剂盒说明书进行。正反引物序列如下3 KSPI 1 5' - CTCATCGGGGTTGCATCTGG-3‘
3 KSPI 2 5' - GCACCGAACTTCCAATG -3'
3' RACE Outer Primer 5' -TACCGTCGTTCCACTAGTGATTT-3‘
3' RACE Inner Primer 5' -CGCGGATCCTCCACTAGTGATTTCACTATAGG-3‘
反转录
按照3' RACE试剂盒中的说明进行，获得3' RT液。
权利要求
1.青虾KSPI基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQID N0:1所示。
2.用于扩增青虾KSPI基因的引物组，其特征在于，其由如下引物组成 引物组正向外引物3 KSPI 1的核苷酸序列如SEQ ID N0:2所示； 正向内引物3 KSPI 2的核苷酸序列如SEQ ID N0:3所示； 反向外引物5 KSPI 1的核苷酸序列如SEQ ID N0:4所示； 反向内引物5 KSPI 2的核苷酸序列如SEQ ID N0:5所示。
3.一种扩增青虾KSPI基因的方法，其特征在于，包括如下步骤 步骤1 获得青虾脑组织总RNA ；步骤2 合成cDNA ；步骤3 从本实验室构建的青虾精巢cDNA文库中筛选到KSPI基因片段，以此作为中间序列；步骤4 用引物组扩增获得青虾KSPI基因片段的3’端和5’端片段；所述引物组由如下引物组成正向外引物3 KSPI 1的核苷酸序列如SEQ ID N0:2所示； 正向内引物3 KSPI 2的核苷酸序列如SEQ ID N0:3所示； 反向外引物5 KSPI 1的核苷酸序列如SEQ ID N0:4所示； 反向内引物5 KSPI 2的核苷酸序列如SEQ ID N0:5所示；步骤5:将所述KSPI基因cDNA序列的中间片段、所述KSPI基因的3’端和5’端片段拼接，即得。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤4所述扩增为套式两轮PCR。
全文摘要
本发明涉及基因克隆领域，特别涉及青虾Kazal型丝氨酸蛋白酶抑制因子(Kazal-typeserineproteinaseinhibitor，KSPI)基因、其扩增方法及扩增引物组。利用本发明提供的引物组从青虾精巢组织中克隆到了一种KSPI基因全长cDNA序列，对青虾KSPI基因功能的研究奠定基础，同时为甲壳类生殖研究积累背景资料。
文档编号C12N15/12GK102367440SQ20111030377
公开日2012年3月7日 申请日期2011年10月10日 优先权日2011年10月10日
发明者乔慧, 傅洪拓, 张响, 蒋速飞 申请人:中国水产科学研究院淡水渔业研究中心