专利名称：诸葛菜染色体乙酸地衣红显带方法
技术领域：
本发明属于细胞遗传学领域，具体涉及诸葛菜染色体显带方法。
背景技术：
染色体分带技术是鉴别染色体和研究染色体结构变异的常规而经典的技术。它是将染色体经过一定程序的处理，并用特定的染料染色后，使染色体在其长轴上显示出一个个明暗交替或深浅不同的横纹，这样的横纹就叫做染色体的带。分带技术能够揭示染色体的 “解剖学”特征，可以显示出真核生物每一条染色体的特异带型，提供丰富的可用于识别的染色体的特殊标记，这为识别和分析每条染色体提供了必要的条件，因而可以比常规核型分析方法更准确地鉴别染色体。染色体带纹的多样性、杂合性等反映了染色体本身结构的复杂性，以及种下变异、物种分化和形成的遗传机制。通过对显带机理的深入研究，可以对染色体的成分、结构、功能和行为等进行更深入的了解，从而找出生物染色体带型变化的规律，这对于从细胞和分子水平真正揭示生物进化的遗传机理具有重要意义，并在此基础上进而达到人工控制和改造生物遗传、变异的目的。染色体显带技术是用染料对染色体进行分化染色的方法，将染色体经酸、碱、温度等处理后再以染料染色，或单用某些荧光染料染色就可以观察到深浅不同或亮暗不同的带纹的纵向结构。在植物染色体显带上最常用的是Giemsa分带技术，其中常用的有C 一带、 G 一带和N —带等。C 一带在植物中分布较广，在染色体末端、中端、着丝点两侧、核仁缢痕处都可能出现，而且准确性较高，是植物分带的主要方法，已广泛应用与植物细胞学、细胞遗传学、植物分类学、物种起源、染色体工程、植物育种等方面的研究。目前常用的方法如下
1.材料准备待洋葱鳞茎发根长2cm左右，蚕豆种子浸种发芽，待幼根长至3cm左右，切取根尖进行预处理。蚕豆主根根尖切去后继续长出的次生根，可再切取次生根根尖进行预处理。大麦种子发芽至幼根长Icm左右，切取白色的幼根进行预处理。2.预处理根尖在0。05%秋水仙碱溶液中预处理2 3h。处理温度一般为 25°C。预处理后须用清水冲洗多次，洗去药液。3.固定以上各材料经预处理后，放入卡诺氏固定液中固定0.5 24h，转换到 70%酒精，置于冰箱中保存备用。4.解离根尖在0. IN盐酸溶液中置于60°C恒温下处理10 15min。大麦根尖在37°C下用果胶酶处理30min，然后在0. IN盐酸溶液中置于60°C下处理5min。上述材料用酸处理后，须用蒸馏水冲洗多次，除去残留酸液，否则将会影响染色体的显带效果。5.压片与常规的植物染色体压片方法相同。在45%醋酸中压片，制成白片。 在相差显微镜下检查染色体分散程度，挑选出分裂相多，染色体分散均勻的片子。选出的玻片经液氮、C02干冰或半导体致冷器冻结，用刀片揭开盖玻片。置室温下干燥。6.空气干燥脱水后的染色体标本一般需经过4 7天的空气干燥，再进行分带处理。不同的材料所需干燥的时间不一样。洋葱要求空气干燥的时间较严，未经空气干燥的染色体不显带，干燥一周后经显带处理显示末端带，干燥半个月后能同时显示末端带和着丝点带。而蚕豆、黑麦、大麦则要求干燥时间不十分严格。7.显带处理空气干燥后的染色体标本即可进行显带处理。处理方法不同，可显示不同的带型。(I)C 带 HSG 法(Hydrochloric acid Saline Giemsa method)将空气干燥后的染色体标本浸入0. 2N盐酸(25°C左右)分别处理30和60min。用蒸馏水冲洗多次后，在60°C的2XSSC溶液中保温30min，再用蒸馏水冲洗数次，室温风干，即可染色。BSG法(Barium Saline Giesa method):将空气干燥后的染色体标本浸入盛有新配制的5%氢氧化钡饱和液的染色缸中，在室温条件下处理5 lOmin，然后用蒸馏水小心地多次冲洗浮垢后，在60°C的2 X SSC溶液中保温60min，再用蒸馏水冲洗数次，室温风干，即可染色。2)N带将黑麦、大麦种子发根Icm左右切取，在0°C冰水中预处理24h。卡诺氏固定液中固定半小时以上，醋酸洋红染色液中染色2h，然后在45%醋酸中压片，冰冻法揭开。尔后在45%醋酸60°C条件下脱色lOmin，再在95%酒精室温下脱水lOmin，气干过夜。最后在IM NaH2P04溶液中95°C恒温下保温2min，蒸馏水冲洗，气干后即可染色。8.吉姆萨染色吉姆萨母液用1/15M磷酸缓冲液按一定的比例稀释。例如，10 份磷酸缓冲液加1份吉姆萨母液稀释即为10 :1，一般都采用扣染法染色。在一干净的玻璃板上，对称放置两根牙签或火柴棒，距离与载玻片上的材料范围相等。将带有材料的玻片翻转向下，放在牙签上，然后沿载玻片一边向载玻片与玻璃板之间的空隙内缓缓滴入染色液， 在室温下染色。染色时间因材料而异，因吉姆萨染料批号不同、质量上有差异，因此其染色液浓度和染色时间需作适当调整。9.镜检和封片染色后的玻片标本，用蒸馏水洗去多余染料，染色过深可用磷酸缓冲液脱色。室温下风干后即可镜检，挑选染色体带型清晰的片子，用树胶垫片。上述的方法取材步骤用于小染色体的诸葛菜不能满足显带效果，显带成功率低， 预处理使用秋水仙素，有毒，污染环境。解离后压片，然后进行显带处理，才能染色呈现带纹，操作步骤很多，不确定性增加，显带成功率低。
发明内容
本发明的目的是提供一种程序简单，步骤少，所用试剂少，操作简便，显带成功率高，适用于小染色体植物诸葛菜染色体的乙酸地衣红显带方法。本发明是这样实现的
本发明诸葛菜染色体乙酸地衣红显带方法，包括以下步骤
(1)取材将种子用温水浸泡6 12h，然后换入600mg/L的赤霉素溶液中放入4°C冰箱中20—25小时，然后将种子在培养皿中22—23°C发芽，避光.种子萌动后，再将种子放入4°C冰箱中20— 25小时，取出放回22— 23°C温室发芽，待根长至1 一2cm时，截取根尖分生组织；
(2)预处理将根尖分生组织经冰水0—1°C处理23— 24小时；
(3)固定用卡诺氏液I对根尖分生组织在4°C固定23—25小时，卡诺氏液I配方无水酒精冰醋酸=3:1，体积比;
(4)解离将根尖分生组织放入预热到60°C的lmol/LHCl解离，解离时间为8分钟，(5)染色，将根尖分生组织放入乙酸地衣红染色液中，地衣红在乙酸溶液中的质量百分浓度为0. 1%，20— 26°C保持12—24小时；
(6)将根尖分生组织用蒸馏水洗后用体积百分浓度为45%的乙酸压片。本发明方法中的取材和预处理步骤；结合了各种浸种方法的优点，使之适合于诸葛菜的种子萌发，并但不污染环境，染色体显带处理在染色过程中一并进行，不用分开处理，乙酸可以起到显带处理作用，而地衣红染料也同时染色，程序得到简化，减少了在操作中的很多步骤；因此避免了许多的影响因素，如每一步的操作误差，每一个步骤的温度、时间等不确定性的影响，因而显带成功率提高。比如传统方法中的空气干燥，干燥时间长短对显带影响很大，有些植物对干燥时间要求很严格，不好掌握。又如在压片后冰冻揭盖片时， 容易把染色体一同随盖片揭掉，造成染色体丢失。在显带处理中，所用的酸或碱等试剂的处理时间也很难撑握，长了，短了都不能显带。因而传统方法因步骤太多，所用试剂也多，要求严格，影响因素众多，成功率太低。本发明程序简单，步骤和所用试剂少，受操作和试剂的影响较小，因而显带成功率高。传统方法用吉姆萨染色的时间也因材料而异，染料批号不同、质量上有差异，因此其染色液浓度和染色时间不好撑握。用乙酸地衣红染色时间容易撑握，操作简单，易染色。本发明所用盐酸与背景技术盐酸无差异，只是解离时间的差别，因为植物种类不同，解离时间不同，本发明离解时间8分种只对诸葛菜合适，为最佳离解时间。本发明公开的植物小染色体显带方法适用于诸葛菜等小染色体植物。在本发明中种子的取材和预处理方法在传统方法上进行了优化，用温水浸泡、GA3 (赤霉素)催芽，然后在4度冰箱中春化，当种子萌动露白时又春化一次，长度种子根长至1 2 c m时，截取根尖，过短或过长则根尖分生细胞较少。截取的根尖用冰水处理23— 24小时，处理时间过长，则染色体浓缩程度高，不容易显带，过短则处于有丝分裂中期的染色体较少且多数还未形成合适显带的染色体形状。实验表明，按本发明的取材和预处理方法则种子的发芽时间较整齐，且出芽质量好，根分裂旺盛，处于有丝分裂中期的细胞较多，染色体形状较好，适于显带操作。在本发明的植物小染色体显带方法中，诸葛菜根尖细胞通过60°C的lmol/L HCl 中八分钟的解离，使细胞压片容易分开，染色体分散程度好，易识别无重叠。如解离时间过短，则细胞不容易压开，染色体重叠无法识别；如解离时间过长，则细胞破裂，染色体易丢失。根尖细胞解离后用乙酸地衣红中常温染色过夜，方法简单，效果好，没用传统方法那么多复杂的程序，避免了诸多因素对染色体显带的影响。染色后用45%的乙酸常规压片，用普通光学显微镜镜检即可观察到紫红色的带纹。本发明的显带方法，操作容易，简便、高效、实用，是一种新颖的植物小染色体显带方法，并同样适合于其他大染色体植物的显带分析，具有重要的科研价值。 本发明与现有方法相比，其优点及效果可进一步概括为
1、本发明提供的植物小染色体乙酸地衣红显带方法，其取材和预处理方法使种子的发芽时间较整齐，且出芽质量好，根分裂旺盛，处于有丝分裂中期的细胞较多，染色体形状较好，适于诸葛菜等植物的显带操作。传统方法对于诸葛菜的效果不理想。2、采用本发明提供的植物小染色体乙酸地衣红显带方法，其解离时间对于诸葛菜恰到好处的掌握，使其细胞压片容易分开，染色体分散程度好，易识别无重叠。
3、本发明提供的植物小染色体乙酸地衣红显带方法，用乙酸地衣红常温染色过夜，经乙酸常规压片，用普通光学显微镜镜检即可观察到紫红色的带纹。该染色方法简单， 成功率高，显带效果好，没用传统方法那么多复杂的程序，避免了诸多因素对染色体显带的影响。4、本发明提供的植物小染色体乙酸地衣红显带方法，适用性广，既可适用于小染色体植物，如诸葛菜、油菜，也适用于大染色体植物，只需改变解离时间和取材方法即可，染色和其它方法不变。所用药品都为常规试剂，价格便宜，易得。
具体实施例方式
以下通过实施例对本发明作进一步的具体描述。有必要指出的是，以下的实施例只用于对本发明做进一步的说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，所属领域技术熟悉人员根据上述发明内容，对本发明做出一些非本质的改进和调整，应仍属于本发明的保护范围。发明人将本发明诸葛菜染色体显带的用于诸葛菜染色体显带的实验，目前都已经取得了良好效果。具体实施方法
1 )取材。取种子在温水中浸泡8h，然后换入600mg/L的赤霉素溶液中放于4°C冰箱中 24h。然后将种子在培养皿中22°C发芽，放于垫有蒸馏水润湿的滤纸上，避光。当种子萌动时再将种子放入4°C冰箱24h，然后再取出，放回22°C温室。待根长至1 2cm时，截取根尖分生组织。2)预处理。植物根尖分生组织经0— 1°C冰水处理23h后，用卡诺氏液I (无水酒精冰醋酸=3 1)对材料4°C固定24h左右。3)解离。将材料放入预热60°C的lmol/ L HCl中解离，解离时间为八分钟。4)染色。将材料放入质量百分浓度为0.1%的乙酸地衣红染色液中常温染色24h。5)染色体压片。用蒸馏水水洗后用45%的乙酸常规压片，镜检。2、显带效果
诸葛菜染色体分散良好，带纹清晰，染色体特征易识别，有利于进一步遗传分析。
权利要求
1.诸葛菜染色体乙酸地衣红显带方法，其特征在于，包括以下步骤(1)取材将种子用温水浸泡6 12h，然后换入600mg/L的赤霉素溶液中放入4°C冰箱中20—25小时，然后将种子在培养皿中22—23°C发芽，避光.种子萌动后，再将种子放入4°C冰箱中20— 25小时，取出放回22— 23°C温室发芽，待根长至1 一2cm时，切取根尖分生组织，(2)预处理将根尖分生组织经0—1°C冰水处理23—24小时；(3)固定用卡诺氏液I对根尖分生组织在4°C固定23—25小时，卡诺氏液I配方无水酒精冰醋酸=3:1，体积比;(4)解离将根尖分生组织放入预热到60°C的lmol/LHCl解离，解离时间为8分钟，(5)染色，将根尖分生组织放入乙酸地衣红染色液中，地衣红在乙酸溶液中的质量百分浓度为0. 1%，20— 26°C保持12—24小时；(6)将根尖分生组织用蒸馏水洗后用体积百分浓度为45%的乙酸压片。
全文摘要
本发明为诸葛菜染色体乙酸地衣红显带方法，解决传统染色体分离显带方法不适于小染色体植物诸葛菜，程序复杂，操作条件不易掌握，显带成功率低的问题。本发明采用乙酸地衣红进行染色，结合染色体制备方法，可使细胞染色体容易分离，染色体经轻压后形态良好，带型显示清晰，利于目标染色体的识别。采用本发明提供的植物染色体显带方法非常简便，操作容易，尤其适合染色体小的植物带型分析，所显带型清晰，成功率高，便于植物的遗传分析。
文档编号C12Q1/68GK102329878SQ20111031152
公开日2012年1月25日 申请日期2011年10月14日 优先权日2011年10月14日
发明者冯雷, 周丽蓉, 陈文清 申请人:四川大学