专利名称：乙酰胆碱酯酶的固定化方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种酶的固定化方法和应用，具体地说，是将重组乙酰胆碱酯酶固定到M-NTA树脂上制成固定化乙酰胆碱酯酶的方法及其应用。
背景技术：
乙酰胆碱酯酶(AChE)是一种重要的水解酶。它能够选择性地催化底物乙酰胆碱水解，其催化活性能被有机磷或氨基甲酸酯类农药所抑制。利用这一特性乙酰胆碱酯酶可用于检测有机磷及氨基甲酸酯类农药。因而，AChE在环保、医学、农业、军事等领域具有重要用途。但是游离酶性质不稳定，极易失活，不能重复使用。与游离酶相比，固定化酶具有稳定性强，重现性好，能重复使用等优点。因此，酶的固定化技术研究已成为酶工程的重要组成部分。目前，乙酰胆碱酯酶的固定化方法有吸附法、包埋法和交联法。吸附法根据物理吸附原理将乙酰胆碱酯酶吸附于载体上，此法的优点是方法简单易行，酶活保存完好。但是由于物理吸附作用力弱，因此采用吸附法固定的乙酰胆碱酯酶易流失，酶活下降快。包埋法将乙酰胆碱酯酶包裹在聚合物网格中，虽然解决了酶流失问题，但是，苛刻的聚合条件会使乙酰胆碱酯酶失活，并且包埋在聚合物深处的乙酰胆碱酯酶难于发挥作用。交联法采用双功能试剂将酶以共价键的形式牢固地连接到载体上，但是剧烈的化学反应仍然会使乙酰胆碱酯酶失活。因此寻找到合适的载体材料，研发出酶活性高、稳定性好、易于保存的固定化重组乙酰胆碱酯酶是相关产业部门十分期望的。Ni-NTA树脂(His标签纯化树脂)是用于纯化His标签重组蛋白的一种纯化介质， 它是由4%交联的凝胶耦连了一种四齿螯合剂NTA而得，带有Ni2+。目前，Ni-NTA树脂已被用来纯化含有组氨酸标签的重组乙酰胆碱酯酶，即将重组蛋白和经处理的Ni-NTA树脂混合后，利用亲和层析进行结合、洗涤、洗脱以纯化重组蛋白的方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种用Ni-NTA树脂制备固定化重组乙酰胆碱酯酶的方法。发明人在长期研究过程中，意外发现不进行洗涤、洗脱步骤能使含有组氨酸标签的重组乙酰胆碱酯酶有效地固载到Ni-NTA树脂上，直接用于酶活测定、抑制剂筛选和农药残留检测，并具有乙酰胆碱酯酶活性高、稳定性好、易于保存等优点。本发明的目的是通过如下技术措施实现一种制备固定化重组乙酰胆碱酯酶的方法，其特征在于A.原料准备采用基因工程技术获得带有组氨酸标签的重组乙酰胆碱酯酶粗酶液；
用缓冲液洗涤Ni-NTA树脂，离心处理； B.将步骤A中制得的重组乙酰胆碱酯酶粗酶液和处理后的Ni-NTA树脂混合，离心处理。上述的基因工程技术是指将某些特定的基因或DNA片断，通过载体或其它手段送入受体细胞，使它们在受体细胞中增殖并表达的一种遗传学操作。步骤包括(I)DNA片段的取得，即目的基因的分离和制备(2) DNA片段和载体的连接，制得重组体DNA(3)外源重组DNA片段导入宿主细胞(4)选择(5)目的基因表达发明人在实际操作过程中发现，在使用基因工程技术制备重组乙酰胆碱酯酶过程中，限制性内切酶、转移质粒载体、感受态细胞、宿主的选择也很重要，这些因素的合理选择与配合可进一步影响固定化乙酰胆碱酯酶的制备。优选地，上述宿主是毕赤酵母Pichia pastoris KM71。更优选地，上述重组DNA制备中感受态细胞是大肠杆菌JM109菌株。最优选地，上述目的基因分离和制备中目的基因引入的限制性内切酶位点是EcoR I，转移质粒载体是PPIC9K，使重组表达质粒载体线性化的限制性内切酶是Ml I。发明人同时发现在利用此法制备固定化重组乙酰胆碱酯酶过程中，Ni-NTA树脂与酶液的用量，离心速度和时间，对固定化乙酰胆碱酯酶的制备效果有进一步的影响。优选地，上述重组乙酰胆碱酯酶粗酶液的总蛋白含量为500 μ g -πιΓ1及以上，粗酶液与处理后的Ni-NTA树脂按3 1的体积比混合。更优选地，上述缓冲液的配方是300mM NaCl, 50mM Na3P04, IOmM咪唑，pH 7. 4。进一步优选地，上述缓冲液用量是Ni-NTA树脂体积的5倍。最优选地，上述离心操作的转速为3000rpm，时间为30秒钟。具体地说，基因工程技术的操作步骤如下①设计用于扩增乙酰胆碱酯酶基因序列的上下游引物，在引物5’ -端均引入限制性内切酶酶切位点，在下游引物引入六个组氨酸标签，以便于结合到Ni-NTA树脂上；②PCR扩增乙酰胆碱酯酶基因cDNA ；③用步骤①所提供的限制性内切酶酶切扩增得到的乙酰胆碱酯酶基因cDNA片段，产生粘性末端；④用步骤①的限制性内切酶酶切转移质粒载体，完全切开后进行去磷酸化处理；⑤将步骤③所得乙酰胆碱酯酶基因cDNA片段与步骤④所得的转移质粒载体连接，转化感受态细胞；⑥用转移质粒载体上游引物和乙酰胆碱酯酶基因下游引物或者用乙酰胆碱酯酶基因上游引物和转移载体下游引物进行PCR，筛选连接方向正确的转化子，测序；⑦提取经测序验证后的重组表达质粒，用不同于步骤①的限制性内切酶酶切使表达质粒线性化；⑧采用电击转化的方法将线性化表达质粒转入作为外源基因表达系统的宿主感受态细胞；⑨挑取阳性转化子，置于装有25mL BMGY培养基的摇瓶中，于30°C，250rpm培养至 OD600 = 2。室温下3000rpm离心5min，收集菌体，用50mL BMMY诱导培养基重悬菌体，放置于30°C，250rpm的摇床上继续生长7_9天，每Mh向培养基中添加100%甲醇至终浓度为 2. 0% ；⑩室温下3000rpm离心5min，收集诱导培养基上清，即得带有组氨酸标签的重组乙酰胆碱酯酶粗酶液。如果重组乙酰胆碱酯酶的含量较低，可采用超滤的方法进行浓缩。本发明具有如下的有益效果1.本发明方法流程短、操作简单，节省了大量的人力和物力；实现了快速制备固定化重组乙酰胆碱酯酶，适合于工业和实验室应用。2.本法制备的固定化乙酰胆碱酯酶活性高、稳定性好、易于保存。 3.本法制备的固定化乙酰胆碱酯酶直接且有效地用于底物检测、抑制剂筛选和农药残留检测。
具体实施例方式下面通过实施例对本发明进行具体的描述，有必要在此指出的是以下实施例只用于对本发明进行进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，该领域的技术人员可以根据上述本发明内容对本发明作出一些非本质的改进和调整。实施例1A.原料准备采用基因工程技术获得带有组氨酸标签的重组乙酰胆碱酯酶粗酶液；①设计用于扩增东亚飞蝗乙酰胆碱酯酶基因序列的上下游引物，在引物5’ -端均引入EcoR I酶切位点，在下游引物引入六个组氨酸标签，以便于结合到Ni-NTA上；②PCR扩增东亚飞蝗乙酰胆碱酯酶基因cDNA ；③用EcoR I酶切扩增得到的东亚飞蝗乙酰胆碱酯酶基因cDNA片段，产生EcoR I 粘性末端；④用EcoR I酶切载体pPIC9K，完全切开后进行去磷酸化处理；⑤将EcoR I酶切后的东亚飞蝗乙酰胆碱酯酶基因cDNA片段与经过同种酶切后的 PPIC9K载体连接，转化大肠杆菌JM109 ；⑥用PPIC9K载体上游引物和东亚飞蝗乙酰胆碱酯酶基因下游引物，筛选连接方向正确的转化子，测序；⑦提取经测序验证后的重组表达质粒pPIC9K，用Ml I酶切进行表达质粒线性化；⑧采用电击转化的方法将线性化表达质粒转入毕赤酵母(Pichia pastoris KM71)感受态细胞；⑨挑取阳性转化子，置于装有25mL BMGY培养基的摇瓶中，于30°C，250rpm培养至 OD600 = 2。室温下3000rpm离心5min，收集菌体，用50mL BMMY诱导培养基重悬菌体，放置于30°C，250rpm的摇床上继续生长7-9天，每Mh向培养基中添加100%甲醇至终浓度为 2. 0% ；⑩室温下3000rpm离心5min，收集诱导培养基上清，即得带有组氨酸标签的重组乙酰胆碱酯酶粗酶液。在1. 5mL离心管中装入60 μ L的Ni-NTA树脂(Novagen公司，IOOmL装)，常温下以3000rpm转速离心30秒，弃上清；用5倍体积的结合缓冲液(300mMNaCl，50mM Na3P04, IOmM咪唑，pH 7.4)洗涤树脂三遍，离心，弃上清；B.在离心管中加入粗酶液(90 μ L)，重悬树脂，轻微振摇30分钟后离心，弃上清。按照如下步骤检测固载乙酰胆碱酯酶的活性①用250 μ L测试缓冲溶液重悬树脂，分别加入25 μ L 5，5 ‘ - 二硫代双(2_ 二硝基苯甲酸)和硫代乙酰胆碱溶液，使其终浓度分别为0. 40mmol · L—1和0. 25mmol · L—1 ；②混勻，30 0C孵育5分钟；③离心，取上清； ④将上清在50°C孵育30秒；⑤以未加受检样品并经相同处理的上清为空白对照，测定加入受检样品所得上清在412纳米波长处的吸光度。⑥在4°C冰箱储存半年后，按照上述步骤① ⑤测定固载乙酰胆碱酯酶活性。
权利要求
1.一种制备重组乙酰胆碱酯酶固定化载体的方法，特征在于，采用如下步骤制备A.原料准备采用基因工程技术获得带有组氨酸标签的重组乙酰胆碱酯酶粗酶液；用缓冲液洗涤Ni-NTA树脂，离心处理；B.将步骤A中制得的重组乙酰胆碱酯酶粗酶液和处理后的Ni-NTA树脂混合，离心处理。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述的基因工程技术包括目的基因的分离和制备、重组体DNA的制备、外源重组DNA片段导入宿主细胞等步骤；所述宿主是毕赤酵母Pichia pastoris KM71。
3.如权利要2所述的方法，其特征在于所述重组体DNA的制备中，采用的感受态细胞是大肠杆菌JM109菌株。
4.如权利要求2或3所述的方法，其特征在于所述目的基因分离和制备中目的基因引入的限制性内切酶位点是EcoR I，转移质粒载体是PPIC9K，使重组表达质粒载体线性化的限制性内切酶是Ml I。
5.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于所述重组乙酰胆碱酯酶粗酶液的总蛋白含量为500 mg-πιΓ1以上，粗酶液与处理后的Ni-NTA树脂按3 1的体积比混合。
6.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于所述步骤A中缓冲液的配方是300mM NaCl，50 mM Na3P04,10 mM 咪唑，pH 7.4。
7.如权利要求1、2或5所述的方法，其特征在于所述缓冲液用量是M-NTA树脂体积的5倍。
8.如权利要求1、2、5或6所述的方法，其特征在于所述离心的转速为3000rpm，时间为30秒。
9.如权利要求1所述的方法，其特征在于A.原料准备采用基因工程技术获得带有组氨酸标签的重组乙酰胆碱酯酶粗酶液，所述的基因工程技术包括目的基因的分离和制备、重组体DNA的制备、外源重组DNA片段导入宿主细胞等步骤；所述宿主是毕赤酵母Pichia pastoris KM71 ；所述重组体DNA的制备中，采用的感受态细胞是大肠杆菌JM109菌株；所述目的基因分离和制备中目的基因引入的限制性内切酶位点是EcoR I，转移质粒载体是PPIC9K，使重组表达质粒载体线性化的限制性内切酶是 Sal I，用5倍体积的缓冲液(300 mM NaCl, 50 mM Na3P04,10 mM咪唑，pH 7. 4)洗涤树脂三遍，以3000rpm转速离心30秒，弃上清；B.将步骤A中制得的重组乙酰胆碱酯酶粗酶液和处理后的Ni-NTA树脂按3:1的体积比混合，离心处理，重组乙酰胆碱酯酶粗酶液的总蛋白含量为500 mg*ml-l。
全文摘要
一种用Ni-NTA树脂制备固定化重组乙酰胆碱酯酶的方法，即将由基因工程技术制得的重组乙酰胆碱酯酶粗酶液与经缓冲液处理的Ni-NTA树脂混合后，离心处理制得固定化乙酰胆碱酯酶。在使用基因工程技术制备重组乙酰胆碱酯酶过程中，限制性内切酶、转移质粒载体、感受态细胞、宿主的合理选择与配合可进一步影响固定化乙酰胆碱酯酶的制备。Ni-NTA树脂与酶液的用量，离心速度和时间，对固定化乙酰胆碱酯酶的制备效果也有进一步的影响。通过本法制得的固定化重组乙酰胆碱酯酶活性高、稳定性好、易于保存，并可直接且有效地用于底物检测、抑制剂筛选和农药残留检测。本法流程短，操作简单，节省了大量人力物力，适合于工业应用。
文档编号C12N11/08GK102409037SQ20111031250
公开日2012年4月11日 申请日期2011年10月14日 优先权日2011年10月14日
发明者周小霞, 夏玉先 申请人:中国人民解放军第三军医大学, 重庆大学