专利名称：一种草莓原生质体的提取及融合方法
技术领域：
本发明涉及植物品种改良技术领域，即一种草莓原生质体的提取及融合方法。
背景技术：
草莓属蔷薇科(Rosaceae)草莓属(Fragaria)植物，多年生草本果树，它的经济价值和营养价值很高，栽种范围广。20世纪80年代以来草莓生产就有了迅速的发展，我国草莓生产上的多数品种引自国外，品种混杂，且普遍存在抗性差及品质下降等问题，真正适合我国不同气候条件栽培的品种不多，这就迫切需要选育适宜我国栽培的优良品种。目前，国内外草莓育种主要集中在草莓的茎尖培养、花药培养、体细胞突变体筛选、草莓基因工程、草莓的细胞悬浮培养、草莓的原生质体培养及细胞融合等，应用现代生物技术是草莓品种改良的重要手段。我国在草莓现代生物技术育种研究的某些方面(如单倍体植株的获得，转化植株的再生等)处于国际先进水平，而不少方面与国外同行相比存在较大差距，抗性体细胞突变体筛选、原生质体培养以及草莓的基因转化研究尚属空白。随着草莓组织培养技术的进一步完善和生物技术的发展，解决气候、冻害、虫害的问题将更有希望。原生质体操作是现代生物技术领域中的重要组成部分，为草莓育种工作开辟了一条新的途径。通过原生质体融合可以产生种、属间的杂种，从而克服远缘杂交障碍，另外，原生质体还可以用来分离和纯化突变体。草莓遗传上的高度杂合性、染色体多倍性和丰富的野生草莓资源，使得原生质体操作成为草莓育种的一种重要手段。
发明内容
本发明的目的在于建立高效的草莓原生质体分离、融合技术体系，以提高原生质体活力，融合效率，为草莓新品种培育提供技术支撑的草莓原生质体的提取及融合方法。为达到上述目的，本发明采用的技术方案是一种草莓原生质体的提取及融合方法，其特征在于步骤如下(1)分别取绿叶东方草莓和卢比草莓试管苗移入降低了蔗糖浓度的MS培养基培养10天，或者暗培养一周；所述的MS培养基含有6-苄基腺嘌呤(6-BA) 1. 0-1. 5mg/L,蔗糖 1-1. 5%和琼脂 0. 7% ；(2)取步骤(1)预处理的叶片剪成细条并去除叶脉；所述细条为2. OmmX 2. 0mm。(3)将材料与酶液按照1 10体积比混合，用Parafilm封口，锡箔纸密封，置于摇床上在恒温、速度60r/min条件下进行暗酶解，时间ll_14h，并定时镜下观察酶解情况；所述的酶液组成为1. 0-2. 0%纤维素酶Cellulase Onozuka R-10+0. 5-1. 0%果胶酶 Pectolyase Y-23+0. 6mol/L 的甘露醇 +0. 1-0. 2% 2-(N-吗啡啉)乙磺酸 MES+0. 05mol/L 的CaCl2的组合。(4)分别将酶解完全的绿叶东方草莓和卢比草莓的叶肉原生质体悬浮液分别经 200目尼龙纱网过滤后，离心、去上清液，将沉淀的原生质体悬浮在2ml0. 2mol/L的CaCl2中，用移液器向离心管底部缓缓注入质量浓度为20%蔗糖溶液后离心，取在两相溶液的界面之间纯化的原生质体带，用6ml 0. 2mol/L的CaCl2悬浮(去除杂质，纯化)；所述定时镜下观察酶解情况为酶液消化7小时后，每隔一小时在倒置显微镜下观察。所述取在两相溶液的界面之间纯化的原生质体，是用移液器吸出管底的沉淀和蔗糖溶液及上部的CaCl2溶液。(5)采用台盼蓝染色法鉴定原生质体的活性，重复三次取平均数；原生质体浓度为0. 5 X IO5个/mL，六孔板滴加时每滴为0. lmL。(6)将两种草莓的原生质体以1 1体积比混合，用移液器将混合好的原生质体滴在6孔板内，静置lOmin，使原生质体贴在6孔板底部，观察其形态；(7)吸取PEG溶液，等体积滴加在每滴原生质体上，轻轻转动6孔板，使其混勻，静止lOmin，观察原生质体的聚集现象，并统计聚集体所占百分率，向其中依次间隔5min加入高Ca2+，高pH洗液洗涤，观察聚集的细胞团的融合过程；所述PEG 溶液组成为 30-45% PEG 6000+0. 3mM 葡萄糖 +8mM Cacl2+0. 7mMKH2P04, KOH 调 pH 为 5. 8。所述高Ca2+，高 pH 洗液为 50mM CaCl2 · 2H20+0. 2M 甘氨酸，NaOH 调 pH 为 9-10。本发的明优点是本发明以草莓的叶片为研究材料，提供一种草莓原生质体分离及融合的最佳方法，通过前处理和酶解相结合的方式获得高活力的原生质体，利用PEG结合高Ca2+，高pH法诱导两者融合，提高了原生质体一对一相融合的概率。本方法作用温和， 分离的原生质体活力在85%以上，一对一融合率最高可达到11.7%，操作简便，具备了形成杂种细胞的可能，适合于克服远源杂交障碍进行新品种的诱导及培育，在生物育种方面具有一定的意义。下面将结合实施例对本发明的实施方式作进一步详细描述。
图1是初步得到杂质较多的原生质体图。图2是纯化后得到的草莓原生质体图。图3是加PEG后聚集的原生质体图。图4是融合后的细胞形态图。
具体实施例方式实施例1草莓原生质体的提取及融合方法，步骤如下1)分别取绿叶东方草莓和卢比草莓试管苗移入降低了蔗糖浓度的MS培养基培养 10天，MS培养基含有6-苄基腺嘌呤(6-BA) 1. Omg/L，蔗糖1. 5%和琼脂0. 7% ；2)取步骤1)预处理的叶片用剪刀剪成2. OmmX 2. Omm大小细碎的小条并去除叶脉；3)将材料与酶液按照1 10体积比混合，用Parafilm封口，锡箔纸密封，置于摇床上在恒温，速度60r/min条件下进行暗酶解，7小时后每隔一小时镜下观察酶解情况，酶液组成为1.0%纤维素酶Cellulase Onozuka R-10+0. 5 %果胶酶Pectolyase Y-23+0. 6mol/L 的甘露醇 +0. 1-0. 2% 2-(N-吗啡啉)乙磺酸 MES+0. 05mol/L 的 CaCl2 的组合，酶消化时间为14小时；4)将酶解完全的两种草莓叶肉原生质体悬浮液经200目尼龙纱网过滤后，600R/ min的转速离心5min，使原生质体沉淀、去上清液，将沉淀的原生质体悬浮在^iil 0. 2mol/L 的CaCl2中.用移液器向离心管底部缓缓注入20%蔗糖溶液后离心，取在两相溶液的界面之间纯化的原生质体带，用:3ml 0. 2mol/L的CaCl2悬浮；5)采用台盼蓝染色法鉴定原生质体的活性，重复三次取平均数，调整原生质体密度为 0. 5X105 个/mL ；6)将两种草莓的原生质体以1 1体积比混合，用移液器将混合好的原生质体滴在6孔板内，每滴为0. lmL，静置lOmin，使原生质体贴在6孔板底部，观察其形态；7)吸取30 % PEG溶液，等体积滴加在每滴原生质体上，轻轻转动6孔板，使其混勻，静止lOmin，观察原生质体的聚集现象，并统计聚集体所占百分率；向其中依次间隔 5min加入高Ca2+，高pH洗液洗涤，观察聚集的细胞团的融合过程；台盼蓝染色法鉴定原生质体的活性为90%，在倒置显微镜下观察并计算一对一的融合率为10.4%。参见图1、2、3、4。实施例2草莓原生质体的提取及融合方法，步骤如下1)分别取绿叶东方草莓和卢比草莓试管苗移入降低了蔗糖浓度的MS培养基培养 10天，MS培养基含有6-苄基腺嘌呤(6-BA) 1. 5mg/L，蔗糖1. 5%和琼脂0. 7% ；2)取步骤1)预处理的叶片用剪刀剪成2. OmmX 2. Omm大小细碎的小条并去除叶脉；3)将材料与酶液按照1 10比例混合，用Parafilm封口，锡箔纸密封，置于摇床上在^TC恒温低速(60r/min)条件下进行暗酶解，7小时后每隔一小时镜下观察酶解情况，酶液组成为2.0%纤维素酶Cellulase Onozuka R-10+0. 5 %果胶酶Pectolyase Y-23+0. 6mol/L 的甘露醇 +0. 1-0. 2% 2-(N-吗啡啉)乙磺酸 MES+O. 05mol/L 的 CaCl2 的组合，酶消化时间为12小时；4)将酶解完全的两种草莓叶肉原生质体悬浮液经200目尼龙纱网过滤后，600R/ min的转速离心5min，使原生质体沉淀、去上清液，将沉淀的原生质体悬浮在^iil 0. 2mol/L 的CaCl2中.用移液器向离心管底部缓缓注入20%蔗糖溶液后离心，取在两相溶液的界面之间纯化的原生质体带，用:3ml 0. 2mol/L的CaCl2悬浮；5)采用台盼蓝染色法鉴定原生质体的活性，重复三次取平均数，调整原生质体密度为 0. 5X105 个/mL ；6)将两种草莓的原生质体以1 1的比例混合，用移液器将混合好的原生质体滴在6孔板内，每滴为0. lmL，静置IOmin左右，使原生质体贴在6孔板底部，观察其形态；7)吸取40 % PEG溶液，等体积滴加在每滴原生质体上，轻轻转动6孔板，使其混勻，静止IOmin左右，观察原生质体的聚集现象，并统计聚集体所占百分率.向其中依次间隔5min加入高Ca2+，高pH洗液洗涤，观察聚集的细胞团的融合过程；台盼蓝染色法鉴定原生质体的活性为85%，在倒置显微镜下观察并计算一对一的融合率为10.7%。实施例3草莓原生质体的提取及融合方法，步骤如下1)分别取绿叶东方草莓和卢比草莓试管苗在条件下暗培养一周；2)取步骤1)预处理的叶片用剪刀剪成2. OmmX 2. Omm大小细碎的小条并去除叶脉；3)将材料与酶液按照1 10比例混合，用Parafilm封口，锡箔纸密封，置于摇床上在^TC恒温低速(60r/min)条件下进行暗酶解，7小时后每隔一小时镜下观察酶解情况，酶液组成为1.0%纤维素酶Cellulase Onozuka R-10+1. 0 %果胶酶Pectolyase Y-23+0. 6mol/L 的甘露醇 +0. 1-0. 2% 2-(N-吗啡啉)乙磺酸 MES+0. 05mol/L 的 CaCl2 的组合，酶消化时间为13小时；4)将酶解完全的两种草莓叶肉原生质体悬浮液经200目尼龙纱网过滤后，600R/ min的转速离心5min，使原生质体沉淀、去上清液，将沉淀的原生质体悬浮在^iil 0. 2mol/L 的CaCl2中.用移液器向离心管底部缓缓注入20%蔗糖溶液后离心，取在两相溶液的界面之间纯化的原生质体带，用:3ml 0. 2mol/L的CaCl2悬浮；5)采用台盼蓝染色法鉴定原生质体的活性，重复三次取平均数，调整原生质体密度为 0. 5X105 个/mL ；6)将两种草莓的原生质体以1 1的比例混合，用移液器将混合好的原生质体滴在6孔板内，每滴为0. lmL，静置IOmin左右，使原生质体贴在6孔板底部，观察其形态；7)吸取45% PEG溶液，等体积滴加在每滴原生质体上，轻轻转动6孔板，使其混勻，静止IOmin左右，观察原生质体的聚集现象，并统计聚集体所占百分率.向其中依次间隔5min加入高Ca2+，高pH洗液洗涤，观察聚集的细胞团的融合过程；台盼蓝染色法鉴定原生质体的活性为87%，在倒置显微镜下观察并计算一对一的融合率为11.7%。实施例4草莓原生质体的提取及融合方法，步骤如下1)分别取绿叶东方草莓和卢比草莓试管苗在条件下暗培养一周；2)取步骤1)预处理的叶片用剪刀剪成2. OmmX 2. Omm大小细碎的小条并去除叶脉；3)将材料与酶液按照1 10比例混合，用Parafilm封口，锡箔纸密封，置于摇床上在^TC恒温低速(60r/min)条件下进行暗酶解，7小时后每隔一小时镜下观察酶解情况，酶液组成为2.0%纤维素酶Cellulase Onozuka R-10+1. 0 %果胶酶Pectolyase Y-23+0. 6mol/L 的甘露醇 +0. 1-0. 2% 2-(N-吗啡啉)乙磺酸 MES+0. 05mol/L 的 CaCl2 的组合，酶消化时间为11小时；4)将酶解完全的两种草莓叶肉原生质体悬浮液经200目尼龙纱网过滤后，600R/ min的转速离心5min，使原生质体沉淀、去上清液，将沉淀的原生质体悬浮在^iil 0. 2mol/L 的CaCl2中.用移液器向离心管底部缓缓注入20%蔗糖溶液后离心，取在两相溶液的界面之间纯化的原生质体带，用:3ml 0. 2mol/L的CaCl2悬浮；5)采用台盼蓝染色法鉴定原生质体的活性，重复三次取平均数，调整原生质体密度为 0. 5X105 个/mL ；6)将两种草莓的原生质体以1 1的比例混合，用移液器将混合好的原生质体滴在6孔板内，每滴为0. lmL，静置IOmin左右，使原生质体贴在6孔板底部，观察其形态；7)吸取45% PEG溶液，等体积滴加在每滴原生质体上，轻轻转动6孔板，使其混勻，静止IOmin左右，观察原生质体的聚集现象，并统计聚集体所占百分率.向其中依次间隔5min加入高Ca2+，高pH洗液洗涤，观察聚集的细胞团的融合过程；台盼蓝染色法鉴定原生质体的活性为89%，在倒置显微镜下观察并计算一对一的融合率为10.8%。实施例5草莓原生质体的提取及融合方法，步骤如下1)分别取绿叶东方草莓和卢比草莓试管苗移入降低了蔗糖浓度的MS培养基培养 10天，MS培养基含有6-苄基腺嘌呤(6-BA) 1. Omg/L，蔗糖1. 5%和琼脂0. 7% ；2)取步骤1)预处理的叶片用剪刀剪成2. OmmX 2. Omm大小细碎的小条并去除叶脉；3)将材料与酶液按照1 10比例混合，用Parafilm封口，锡箔纸密封，置于摇床上在^TC恒温低速(60r/min)条件下进行暗酶解，7小时后每隔一小时镜下观察酶解情况，酶液组成为1.0%纤维素酶Cellulase Onozuka R-10+1. 0 %果胶酶Pectolyase Y-23+0. 6mol/L 的甘露醇 +0. 1-0. 2% 2-(N-吗啡啉)乙磺酸 MES+0. 05mol/L 的 CaCl2 的组合，酶消化时间为13小时；4)将酶解完全的两种草莓叶肉原生质体悬浮液经200目尼龙纱网过滤后，600R/ min的转速离心5min，使原生质体沉淀、去上清液，将沉淀的原生质体悬浮在^iil 0. 2mol/L 的CaCl2中.用移液器向离心管底部缓缓注入20%蔗糖溶液后离心，取在两相溶液的界面之间纯化的原生质体带，用:3ml 0. 2mol/L的CaCl2悬浮；5)采用台盼蓝染色法鉴定原生质体的活性，重复三次取平均数，调整原生质体密度为 0. 5X105 个/mL ；6)将两种草莓的原生质体以1 1的比例混合，用移液器将混合好的原生质体滴在6孔板内，每滴为0. lmL，静置IOmin左右，使原生质体贴在6孔板底部，观察其形态；7)吸取30% PEG溶液，等体积滴加在每滴原生质体上，轻轻转动6孔板，使其混勻，静止IOmin左右，观察原生质体的聚集现象，并统计聚集体所占百分率.向其中依次间隔5min加入高Ca2+，高pH洗液洗涤，观察聚集的细胞团的融合过程；台盼蓝染色法鉴定原生质体的活性为88%，在倒置显微镜下观察并计算一对一的融合率为10. 1%0实施例6草莓原生质体的提取及融合方法，步骤如下1)分别取绿叶东方草莓和卢比草莓试管苗移入降低了蔗糖浓度的MS培养基培养 10天，MS培养基含有6-苄基腺嘌呤(6-BA) 1. Omg/L，蔗糖1. 5%和琼脂0. 7% ；2)取步骤1)预处理的叶片用剪刀剪成2. OmmX 2. Omm大小细碎的小条并去除叶脉；3)将材料与酶液按照1 10比例混合，用Parafilm封口，锡箔纸密封，置于摇床上在^TC恒温低速(60r/min)条件下进行暗酶解，7小时后每隔一小时镜下观察酶解情况，酶液组成为2.0%纤维素酶Cellulase Onozuka R-10+1. 0 %果胶酶Pectolyase Y-23+0. 6mol/L 的甘露醇 +0. 1-0. 2% 2-(N-吗啡啉)乙磺酸 MES+0. 05mol/L 的 CaCl2 的组合，酶消化时间为11小时；4)将酶解完全的两种草莓叶肉原生质体悬浮液经200目尼龙纱网过滤后，600R/ min的转速离心5min，使原生质体沉淀、去上清液，将沉淀的原生质体悬浮在^iil 0. 2mol/L 的CaCl2中.用移液器向离心管底部缓缓注入20%蔗糖溶液后离心，取在两相溶液的界面之间纯化的原生质体带，用:3ml 0. 2mol/L的CaCl2悬浮；5)采用台盼蓝染色法鉴定原生质体的活性，重复三次取平均数，调整原生质体密度为 0. 5X105 个/mL ；6)将两种草莓的原生质体以1 1的比例混合，用移液器将混合好的原生质体滴在6孔板内，每滴为0. lmL，静置IOmin左右，使原生质体贴在6孔板底部，观察其形态；7)吸取40% PEG溶液，等体积滴加在每滴原生质体上，轻轻转动6孔板，使其混勻，静止IOmin左右，观察原生质体的聚集现象，并统计聚集体所占百分率.向其中依次间隔5min加入高Ca2+，高pH洗液洗涤，观察聚集的细胞团的融合过程；台盼蓝染色法鉴定原生质体的活性为85%，在倒置显微镜下观察并计算一对一的融合率为10.9%。实施例7草莓原生质体的提取及融合方法，步骤如下1)分别取绿叶东方草莓和卢比草莓试管苗在条件下暗培养一周；2)取步骤1)预处理的叶片用剪刀剪成2. OmmX 2. Omm大小细碎的小条并去除叶脉；3)将材料与酶液按照1 10比例混合，用Parafilm封口，锡箔纸密封，置于摇床上在^TC恒温低速(60r/min)条件下进行暗酶解，7小时后每隔一小时镜下观察酶解情况，酶液组成为1.0%纤维素酶Cellulase Onozuka R-10+0. 5 %果胶酶Pectolyase Y-23+0. 6mol/L 的甘露醇 +0. 1-0. 2% 2-(N-吗啡啉)乙磺酸 MES+0. 05mol/L 的 CaCl2 的组合，酶消化时间为14小时；4)将酶解完全的两种草莓叶肉原生质体悬浮液经200目尼龙纱网过滤后，600R/ min的转速离心5min，使原生质体沉淀、去上清液，将沉淀的原生质体悬浮在^iil 0. 2mol/L 的CaCl2中.用移液器向离心管底部缓缓注入20%蔗糖溶液后离心，取在两相溶液的界面之间纯化的原生质体带，用:3ml 0. 2mol/L的CaCl2悬浮；5)采用台盼蓝染色法鉴定原生质体的活性，重复三次取平均数，调整原生质体密度为 0. 5X105 个/mL ；6)将两种草莓的原生质体以1 1的比例混合，用移液器将混合好的原生质体滴在6孔板内，每滴为0. lmL，静置IOmin左右，使原生质体贴在6孔板底部，观察其形态；7)吸取45% PEG溶液，等体积滴加在每滴原生质体上，轻轻转动6孔板，使其混勻，静止IOmin左右，观察原生质体的聚集现象，并统计聚集体所占百分率.向其中依次间隔5min加入高Ca2+，高pH洗液洗涤，观察聚集的细胞团的融合过程；台盼蓝染色法鉴定原生质体的活性为91%，在倒置显微镜下观察并计算一对一的融合率为10%。实施例8草莓原生质体的提取及融合方法，步骤如下1)分别取绿叶东方草莓和卢比草莓试管苗在条件下暗培养一周；2)取步骤1)预处理的叶片用剪刀剪成2. OmmX 2. Omm大小细碎的小条并去除叶脉；3)将材料与酶液按照1 10比例混合，用Parafilm封口，锡箔纸密封，置于摇床上在^TC恒温低速(60r/min)条件下进行暗酶解，7小时后每隔一小时镜下观察酶解情况，酶液组成为2.0%纤维素酶Cellulase Onozuka R-10+1. 0 %果胶酶Pectolyase Y-23+0. 6mol/L 的甘露醇 +0. 1-0. 2% 2-(N-吗啡啉)乙磺酸 MES+0. 05mol/L 的 CaCl2 的组合，酶消化时间为11小时；4)将酶解完全的两种草莓叶肉原生质体悬浮液经200目尼龙纱网过滤后，600R/ min的转速离心5min，使原生质体沉淀、去上清液，将沉淀的原生质体悬浮在^iil 0. 2mol/L 的CaCl2中.用移液器向离心管底部缓缓注入20%蔗糖溶液后离心，取在两相溶液的界面之间纯化的原生质体带，用:3ml 0. 2mol/L的CaCl2悬浮；5)采用台盼蓝染色法鉴定原生质体的活性，重复三次取平均数，调整原生质体密度为 0. 5X105 个/mL ；6)将两种草莓的原生质体以1 1的比例混合，用移液器将混合好的原生质体滴在6孔板内，每滴为0. lmL，静置IOmin左右，使原生质体贴在6孔板底部，观察其形态；7)吸取40% PEG溶液，等体积滴加在每滴原生质体上，轻轻转动6孔板，使其混勻，静止IOmin左右，观察原生质体的聚集现象，并统计聚集体所占百分率.向其中依次间隔5min加入高Ca2+，高pH洗液洗涤，观察聚集的细胞团的融合过程；台盼蓝染色法鉴定原生质体的活性为87%，在倒置显微镜下观察并计算一对一的融合率为11.2%。
权利要求
1.一种草莓原生质体的提取及融合方法，其特征在于步骤如下(1)分别取绿叶东方草莓和卢比草莓试管苗移入MS培养基培养10天，或者暗培养一周；MS培养基为6-苄基腺嘌呤(6-BA) 1. 0-1. 5mg/L，蔗糖1-1. 5%和琼脂0. 7% ；(2)取步骤(1)预处理的叶片剪成细条并去除叶脉；(3)将材料与酶液按照1 10体积比混合，用Parafilm封口，锡箔纸密封，置于摇床上在恒温、速度60r/min条件下进行暗酶解，时间ll_14h，并定时镜下观察酶解情况； 酶液组成为 1. 0-2. 0% 纤维素酶 Cellulase OnozukaR-lO+O. 5-1. 0 % 果胶酶 Pectolyase Y-23+0. 6mol/L 的甘露醇 +0. 1-0. 2% 2-(N-吗啡啉)乙磺酸 MES+0. 05mol/L 的 CaCl2 的组合；(4)分别将酶解完全的绿叶东方草莓和卢比草莓的叶肉原生质体悬浮液经200目尼龙纱网过滤后，离心、去上清液，将沉淀的原生质体悬浮在anl 0. 2mol/L的CaCl2中，用移液器向离心管底部缓缓注入质量浓度为20%蔗糖溶液后离心，取在两相溶液的界面之间纯化的原生质体带，用6ml 0. 2mol/L的CaCl2悬浮；(5)原生质体的活力测定采用台盼蓝染色法鉴定原生质体的活性，重复三次取平均数；(6)将两种草莓的原生质体以1 1体积比混合，用移液器将混合好的原生质体滴在6 孔板内，静置lOmin，使原生质体贴在6孔板底部，观察其形态；(7)吸取PEG溶液，等体积滴加在每滴原生质体上，轻轻转动6孔板，使其混勻，静止 lOmin，观察原生质体的聚集现象，并统计聚集体所占百分率，向其中依次间隔5min加入高 Ca2+，高pH洗液洗涤，观察聚集的细胞团的融合过程。
2.根据权利要求1所述的草莓原生质体的提取及融合方法，其特征是步骤( 所述细条为 2. OmmX 2. 0_。
3.根据权利要求1所述的草莓原生质体的提取及融合方法，其特征是步骤C3)所述定时镜下观察酶解情况为酶液消化7小时后，每隔一小时在倒置显微镜下观察。
4.根据权利要求1所述的草莓原生质体的提取及融合方法，其特征是步骤(4)所述取在两相溶液的界面之间纯化的原生质体，是用移液器吸出管底的沉淀和蔗糖溶液及上部的 CaCl2溶液。
5.根据权利要求1所述的草莓原生质体的提取及融合方法，其特征是步骤(6)所用原生质体浓度为0. 5 X IO5个/mL，六孔板滴加时每滴为0. lmL。
6.根据权利要求1所述的草莓原生质体的提取及融合方法，其特征是步骤(7)所述 PEG 溶液组成为 30-45% PEG 6000+0. 3mM 葡萄糖+8mM Cacl2+0. 7mMKH2P04，KOH调 pH 为 5. 8。
7.根据权利要求1所述的草莓原生质体的提取及融合方法，其特征是步骤(7)所述高 Ca2+，高 pH 洗液为 50mM CaCl2 · 2H20+0. 2M 甘氨酸，NaOH 调 pH 为 9-10。
8.根据权利要求1所述的草莓原生质体的提取及融合方法，其特征在于酶液组成为 1. O %纤维素酶 Cellulase Onozuka R-10+0. 5 %果胶酶 PectolyaseY-23+O. 6mol/L 的甘露醇 +0. 1-0. 2% 2-(N-吗啡啉)乙磺酸 MES+O. 05mol/L 的 CaCl2 的组合。
9.根据权利要求1-8任一所述的草莓原生质体的提取及融合方法，其特征步骤如下1)分别取绿叶东方草莓和卢比草莓试管苗移入降低了蔗糖浓度的MS培养基培养10天，MS培养基含有6-苄基腺嘌呤(6-BA) 1. Omg/L，蔗糖1. 5%和琼脂0. 7% ；2)取步骤1)预处理的叶片用剪刀剪成2.OmmX 2. Omm大小细碎的小条并去除叶脉；3)将材料与酶液按照体积比1 10混合，用Parafilm封口，锡箔纸密封，置于摇床上在恒温，速度60r/min条件下进行暗酶解，7小时后每隔一小时镜下观察酶解情况，酶液组成为1. 0%纤维素酶Cellulase Onozuka R-10+0. 5 %果胶酶Pectolyase Y-23+0. 6mol/L 的甘露醇 +0. 1-0. 2% 2-(N-吗啡啉)乙磺酸 MES+0. 05mol/L 的 CaCl2 的组合，酶消化时间为14小时；4)将酶解完全的两种草莓叶肉原生质体悬浮液经200目尼龙纱网过滤后，600R/min 的转速离心5min，使原生质体沉淀、去上清液，将沉淀的原生质体悬浮在aiil 0. 2mol/L的 CaCl2中.用移液器向离心管底部缓缓注入20%蔗糖溶液后离心，取在两相溶液的界面之间纯化的原生质体带，用3ml 0. 2mol/L的CaCl2悬浮；5)采用台盼蓝染色法鉴定原生质体的活性，重复三次取平均数，调整原生质体密度为 0. 5 X IO5 个/mL ；6)将两种草莓的原生质体以1 1体积比混合，用移液器将混合好的原生质体滴在6 孔板内，每滴为0. lmL，静置lOmin，使原生质体贴在6孔板底部，观察其形态；7)吸取30%PEG溶液，等体积滴加在每滴原生质体上，轻轻转动6孔板，使其混勻，静止lOmin，观察原生质体的聚集现象，并统计聚集体所占百分率；向其中依次间隔5min加入高Ca2+，高pH洗液洗涤，观察聚集的细胞团的融合过程；台盼蓝染色法鉴定原生质体的活性为90%，在倒置显微镜下观察并计算一对一的融合率为10. 4%。
全文摘要
本发明是以草莓的叶片为研究材料，提供一种草莓原生质体分离及融合的最佳方法，通过前处理和酶解相结合的方式获得高活力的原生质体，利用30-45％PEG 6000结合高Ca2+，高pH的方法诱导两者融合，提高了原生质体一对一相融合的概率，本方法作用温和，分离的原生质体活力在85％以上，一对一融合率最高可达到11.7％，操作简便，具备了形成杂种细胞的可能，适合于克服远源杂交障碍进行新品种的诱导及培育，在生物育种方面具有一定的意义。
文档编号C12N5/04GK102505004SQ201110315610
公开日2012年6月20日 申请日期2011年10月18日 优先权日2011年10月18日
发明者冯颖, 朱俊义, 杨丽娟, 顾地周 申请人:通化师范学院