专利名称：多菌株固定化细胞组合物连续发酵制醋方法
技术领域：
本发明属于发酵工程技术领域，具体涉及采用细胞固定化技术连续制醋的方法。
背景技术：
食醋是我国传统的重要酿造调味品，大多数生产企业均采用传统固态发酵法酿造食醋，固态发酵工艺的产品风味、口感、品质较好，但存在卫生条件差、原料利用率较低、劳动强度大等缺点，生产工艺中淀粉转化率、糖酸转化率、产酸率均相对较低。与传统的发酵技术相比较，细胞固定化发酵具有以下特出优点
①方法简便，将细胞与单体或聚合物一起聚凝，细胞被包埋在形成的聚合物之中；② 条件温和，可选用不同的聚合物载体，不同的包埋系统和条件，以保持细胞的酶催化活性； ③细胞不易渗漏，稳定性好；④细胞密度高，有较高的细胞容量，聚合体中的细胞含量可达50% 70% ；⑤固定化的细胞可以多批次使用。现有的细胞固定化技术在理论方面研究的多、生产实践中用的少；很多研究也是局限于单一菌种的固定化。食醋酿造工艺涉及3种主要的微生物类群和相关技术过程黑曲霉将淀粉转化为糖类，酵母菌将糖转化为酒精，醋酸杆菌将酒精转化为醋酸。在食醋酿造行业只有零星的研究涉及醋酸杆菌细胞固定化，这不能改变传统食醋酿造的面貌。因为采用固定化醋酸杆菌进行醋酸发酵，还需要采用传统的工艺将粮食等淀粉类原材料转化为糖类，再采用酵母菌将糖类转化为酒精，只有获得酒精，才能进入固定化醋酸杆菌发酵阶段。 因此将食醋酿造相关微生物分别固定化，进而构建固定化细胞连续发酵技术，为酿造行业提供先进的发酵技术，将会改变食醋行业的生产面貌，提高企业生产效率，扩大生产规模， 增加企业的经济效益，促进酿造行业的技术进步。
发明内容
为改变传统食醋酿造的落后面貌，采用细胞固定化技术将食醋酿造相关微生物菌株固定，构建固定化细胞发酵器，将固定化细胞发酵器串联形成固定化细胞连续发酵技术。具体操作方法如下
1、二个菌株固定化细胞组合物连续发酵制醋方法，具体操作步骤如下 1.1、菌株培养
所用菌株为A菌株和B菌株；
A菌株为酿酒酵母feccAarofflj^^s cerevisiae 1001菌株，可将糖类转化为酒精； B 菌株为巴氏醋杆菌巴氏亚禾中Jcetobacter pasteurianus subsp. pasteurianus 7015菌株，可将酒精转化为醋酸；
1. 1. 1、A菌株的培养，将酿酒酵母斜面菌种接种至酿酒酵母培养基，温度30°C、转速 80 150转/分钟，培养M 48h，使酿酒酵母培养基中的酵母细胞浓度达到5. OX IO7/ mL 1. 0 X IOVmL,得到A菌株菌液；
酿酒酵母培养基配方5° Β 麦芽汁，121°C高压灭菌20分钟；1. 1.2、B菌株的培养，将巴氏醋杆菌巴氏亚种斜面菌种接种至醋杆菌培养基，温度 30°C、转速8(Γ150转/分钟，培养24、8h，使醋杆菌培养基中的巴氏醋杆菌细胞浓度达到 5. OX 107/mL 5. 0 X lOVmL,得到 B 菌株菌液；
醋杆菌培养基配方3° Β 麦芽汁，硫酸镁0. 2%，酵母膏0. 5%，磷酸二氢钾0. 3%，葡萄糖2%，121°C高压灭菌20分钟，灭菌后加95%酒精2 3%混勻；
1.2、菌株的固定化
1. 2. 1、细胞的离心洗涤取A菌株菌液50mL、B菌株菌液50mL，分别在转速为5000 10000转/分钟条件下，离心分离10 15分钟，倾去上清液，用0. 85%生理盐水悬浮细胞， 完成一次细胞的离心洗涤；再重复2次细胞的离心洗涤，制得A菌株细胞悬液和B菌株细胞悬液；
1. 2. 2、取A菌株细胞悬液50mL和B菌株细胞悬液50mL，与浓度 5%的固定化载体溶液按体积比1: 1 4的比例混合均勻，成型造粒，固定化细胞颗粒直径2 5mm，室温固化2 6小时，置于4°C冰箱中，12小时平衡，倾去上清液，加入无菌水洗涤3次；分别制得A菌株固定化细胞颗粒和B菌株固定化细胞颗粒，置于冰箱中备用；
所述固定化载体溶液中载体为琼脂或壳聚糖或角叉或聚乙烯醇，溶剂为水；
1.3、固定化细胞连续发酵制醋
1. 3. 1、取IOOg 500g的A菌株固定化细胞颗粒和IOOg 500g的B菌株固定化细胞颗粒，分别置于容器中，盛有A菌株固定化细胞颗粒的容器为A容器，盛有B菌株固定化细胞颗粒的容器为B容器；A容器的进口和B容器的进口均位于容器上部，A容器的出口和B 容器的出口均位于容器下部；
1.3. 2、A容器的出口连通着B容器的进口 ；常温下，通过进口向A容器中连续注入 2% 6%的蔗糖溶液，控制流速为10 IOOmL/小时，收集B容器出口流出的发酵液；1 3天平衡后即可由B容器出口连续得到醋酸溶液，醋酸溶液中醋酸含量为1. 0 4. 0%。
2、三个菌株固定化细胞组合物连续发酵制醋方法，具体操作步骤如下
2.1、菌株培养
所用菌株为A菌株、B菌株和C菌株；
A菌株为酿酒酵母feccAarofflj^M cerevisiae 1001菌株，可将糖类转化为酒精； B 菌株为巴氏醋杆菌巴氏亚禾中Jcetobacter pasteurianus subsp. pasteurianus 7015菌株，可将酒精转化为醋酸；
C菌株为黑曲霉变种Aspar识7ΛΛ5 niger var 2244菌株，可将淀粉转化为糖类； 2. 1. 1、A菌株的培养，将酿酒酵母斜面菌种接种至酿酒酵母培养基，温度30°C、转速 80 150转/分钟，培养24 48h，使酿酒酵母培养基中的酵母细胞浓度达到5. OX IO7/ mL 1. 0 X IOVmL,得到A菌株菌液；
酿酒酵母培养基配方5° Β 麦芽汁，121°C高压灭菌20分钟； 2. 1.2、B菌株的培养，将巴氏醋杆菌巴氏亚种斜面菌种接种至醋杆菌培养基，温度 30°C、转速80 150转/分钟，培养24 48h，使醋杆菌培养基中的巴氏醋杆菌细胞浓度达到5. 0 X 107/mL 5. 0 X lOVmL,得到B菌株菌液；
醋杆菌培养基配方3° Β 麦芽汁，硫酸镁0. 2%，酵母膏0. 5%，磷酸二氢钾0. 3%，葡萄糖2%，121°C高压灭菌20分钟，灭菌后加95%酒精2 3%混勻；2. 1.3、C菌株的培养，将黑曲霉变种接种至黑曲霉培养基，温度30°C、转速80 150 转/分钟培养24 48他，使黑曲霉培养基中黑曲霉变种孢子浓度达到5. OX IO7AiL 5. 0X108/mL，得到C菌株菌液；
黑曲霉培养基配方蔗糖3%，硝酸钠0. 2%，硫酸镁0. 05%,氯化钾0. 05%,磷酸氢二钾
0.1%，硫酸亚铁0. 001%, 121 °C高压灭菌20分钟；
2. 2、菌株的固定化
2. 2. 1、细胞的离心洗涤取A菌株菌液50mL、B菌株菌液50mL、C菌株菌液50mL，分别在转速为5000 10000转/分钟条件下，离心分离10 15分钟，倾去上清液，用0. 85%生理盐水悬浮细胞，完成一次细胞的离心洗涤；再重复2次细胞的离心洗涤，制得A菌株细胞悬液、B菌株细胞悬液和C菌株细胞悬液；
2. 2. 2、取A菌株细胞悬液50mL、B菌株细胞悬液50mL和C菌株细胞悬液50mL，与浓度 5%的固定化载体溶液按体积比1: 1 4的比例混合均勻后，成型造粒，固定化细胞颗粒直径2 5mm，室温固化2 6小时，置于4°C冰箱中，12小时平衡，倾去上清液，加入无菌水洗涤3次；分别制得A菌株固定化细胞颗粒、B菌株固定化细胞颗粒和C菌株固定化细胞颗粒，置于冰箱中备用；
所述的固定化载体溶液中载体为琼脂或壳聚糖或角叉或聚乙烯醇，溶剂为水； 2. 3、固定化细胞连续发酵制醋
2. 3. 1、取IOOg 500g的A菌株固定化细胞颗粒、IOOg 500g的B菌株固定化细胞颗粒和IOOg 500g的C菌株固定化细胞颗粒分别置于容器中，盛有A菌株固定化细胞颗粒的容器为A容器，盛有B菌株固定化细胞颗粒的容器为B容器，盛有C菌株固定化细胞颗粒的容器为C容器；A容器的进口、B容器的进口和C容器的进口均位于容器的上部，A容器的出口、B容器的出口和C容器的出口均位于容器的下部；
2.3.2、C容器的出口连通着A容器的进口 ；A容器的出口连通着B容器的进口 ；常温下，通过进口向C容器中连续注入2% 6%的淀粉溶液，控制流速为10 IOOmL/小时，收集B容器出口流出的发酵液；10 18小时平衡后即可由B容器出口连续得到醋酸溶液，醋酸溶液中醋酸含量为1.0 4.0%。在菌株的固定化步骤的第2步中取A菌株细胞悬液50mL和B菌株细胞悬液50mL， 与浓度1 % 5 %的海藻酸钠溶液按体积比1 1 4的比例混合均勻，滴入浓度0. 5 %
1.5%的氯化钙(CaCl2)溶液，自然成型造粒；所述海藻酸钠溶液为固定化载体溶液。在菌株的固定化步骤的第2步中取A菌株细胞悬液50mL、B菌株细胞悬液50mL和 C菌株细胞悬液50mL，与浓度1 % 5 %的海藻酸钠溶液按体积比1 1 4的比例混合均勻，滴入浓度0. 5% 1. 5%的氯化钙(CaCl2)溶液，自然成型造粒；所述海藻酸钠溶液为固定化载体溶液。本发明使用的菌种酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae 1001菌株、巴氏醋杆菌巴氏亚禾1IMeeic^aeier pasteurianus subsp. pasteurianus 7015 菌株禾口黑曲霄变种 Aspergillus niger var 2244菌株均自中国工业微生物菌种保藏中心获得。本发明的有益技术效果如下
1、采用现代生物工程技术进行食醋的生产，彻底改变传统食醋酿造工艺，实现精确调控生产工艺参数的目标；2、改变传统酿造工艺脏乱差的落后生产环境，降低工人劳动强度；
3、提高原材料的利用率，提高生产效率。
具体实施例方式下面对本发明作进一步地说明。实施例1 固定化细胞组合物连续发酵制醋
本例采用二个菌株固定化细胞组合物连续发酵制醋方法，具体操作步骤如下
1、菌株培养，所用菌株为A菌株和B菌株；
A菌株为酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae 1001菌株，可将糖类转化为酒精； B 菌株为巴氏醋杆菌巴氏亚禾中Jcetobacter pasteurianus subsp. pasteurianus 7015菌株，可将酒精转化为醋酸；
A菌株的培养，将酿酒酵母斜面菌种接种至酿酒酵母培养基，温度30°C、转速120转/ 分钟，培养Mh，使酿酒酵母培养基中的酵母细胞浓度达到5. OX 107mL，得到A菌株菌液； 酿酒酵母培养基配方5° Β 麦芽汁，121°C高压灭菌20分钟； B菌株的培养，将巴氏醋杆菌巴氏亚种斜面菌种接种至醋杆菌培养基，温度30°C、转速 150转/分钟，培养Mh，使醋杆菌培养基中的巴氏醋杆菌细胞浓度达到5. OX 108/mL，得到 B菌株菌液；
醋杆菌培养基配方3° Β 麦芽汁，硫酸镁0. 2%，酵母膏0. 5%，磷酸二氢钾0. 3%，葡萄糖2%，121°C高压灭菌20分钟，灭菌后加95%酒精2. 5%混勻；
2、菌株的固定化
细胞的离心洗涤取A菌株菌液50mL、B菌株菌液50mL，分别在转速为6000转/分钟条件下，离心分离12分钟，倾去上清液，用0. 85%生理盐水悬浮细胞，完成一次细胞的离心洗涤；再重复2次细胞的离心洗涤，制得A菌株细胞悬液和B菌株细胞悬液；
取A菌株细胞悬液50mL和B菌株细胞悬液50mL，与温度50°C、浓度2. 7%的琼脂IOOmL 混合均勻，冷却至25°C凝固，切割成直径4mm固定化细胞颗粒，室温固化4小时，置于4°C冰箱中，12小时平衡，倾去上清液，加入无菌水洗涤3次；分别制得A菌株固定化细胞颗粒和B 菌株固定化细胞颗粒，置于冰箱中备用； 1.3、固定化细胞连续发酵制醋
取500g的A菌株固定化细胞颗粒和500g的B菌株固定化细胞颗粒，分别置于容器中， 盛有A菌株固定化细胞颗粒的容器为A容器，盛有B菌株固定化细胞颗粒的容器为B容器； A容器的进口和B容器的进口均位于容器上部，A容器的出口和B容器的出口均位于容器下部；
A容器的出口连通着B容器的进口 ；25°C下，通过进口向A容器中连续注入3%的蔗糖溶液，控制流速为35mL/小时，收集B容器出口流出的发酵液小时平衡后即可由B容器出口连续得到醋酸溶液，醋酸溶液中醋酸含量为2. 5%。这套固定化细胞连续发酵装置连续运行性能稳定。实施例2
二个菌株固定化细胞组合物连续发酵制醋方法，具体操作步骤如下 1、菌株培养所用菌株为A菌株和B菌株；
A菌株为酿酒酵母feccAarofflj^M cerevisiae 1001菌株，可将糖类转化为酒精； B 菌株为巴氏醋杆菌巴氏亚禾中 Jce tobac ter pas teurianus sub sp. pas teurianus 7015菌株，可将酒精转化为醋酸；
A菌株的培养，将酿酒酵母斜面菌种接种至酿酒酵母培养基，温度30°C、转速100转/ 分钟，培养30h，使酿酒酵母培养基中的酵母细胞浓度达到1. 0 X IOVmL,得到A菌株菌液； 酿酒酵母培养基配方5° Β 麦芽汁，121°C高压灭菌20分钟； B菌株的培养，将巴氏醋杆菌巴氏亚种斜面菌种接种至醋杆菌培养基，温度30°C、转速 150转/分钟，培养24h，使醋杆菌培养基中的巴氏醋杆菌细胞浓度达到5. OX 108/mL，得到 B菌株菌液；
醋杆菌培养基配方3° Β 麦芽汁，硫酸镁0. 2%，酵母膏0. 5%，磷酸二氢钾0. 3%，葡萄糖2%，121°C高压灭菌20分钟，灭菌后加95%酒精2. 5%混勻；
2、菌株的固定化
细胞的离心洗涤取A菌株菌液50mL、B菌株菌液50mL，分别在转速为6000转/分钟条件下，离心分离15分钟，倾去上清液，用0. 85%生理盐水悬浮细胞，完成一次细胞的离心洗涤；再重复2次细胞的离心洗涤，制得A菌株细胞悬液和B菌株细胞悬液；
取A菌株细胞悬液50mL和B菌株细胞悬液50mL(分别取多少？)，与浓度2. 8%的海藻酸钠溶液按体积比1 4的比例混合均勻，移入玻璃注射器中，适度加力，滴入浓度1. 2 %的氯化钙(CaCl2)溶液，自然成型造粒，固定化细胞颗粒直径4. 5mm，室温固化3小时，置于4°C 冰箱中，12小时平衡，倾去溶液，加入无菌水洗涤3次；分别制得A菌株固定化细胞颗粒和B 菌株固定化细胞颗粒，置于冰箱中备用；
3、固定化细胞连续发酵制醋
3. 1、取500g的A菌株固定化细胞颗粒和B菌株固定化细胞颗粒，分别置于容器中，盛有A菌株固定化细胞颗粒的容器为A容器，盛有B菌株固定化细胞颗粒的容器为B容器；A 容器的进口和B容器的进口均位于容器上部，A容器的出口和B容器的出口均位于容器下部；
3. 2、A容器的出口连通着B容器的进口 ；25°C下，通过进口向A容器中连续注入3%的蔗糖溶液，控制流速为40mL/小时，收集B容器出口流出的发酵液；24小时平衡后即可由B 容器出口连续得到醋酸溶液，醋酸溶液中醋酸含量为2. 8%。固定化细胞连续发酵装置运行稳定。 实施例3:
三个菌株固定化细胞组合物连续发酵制醋方法，具体操作步骤如下 1、菌株培养
所用菌株为A菌株、B菌株和C菌株；
A菌株为酿酒酵母feccAarofflj^M cerevisiae 1001菌株，可将糖类转化为酒精； B 菌株为巴氏醋杆菌巴氏亚禾中 Jce tobac ter pas teurianus sub sp. pas teurianus 7015菌株，可将酒精转化为醋酸；
C菌株为黑曲霉变种Aspar识7ΛΛ5 niger var 2244菌株，可将淀粉转化为糖类； A菌株的培养，将酿酒酵母斜面菌种接种至酿酒酵母培养基，温度30°C、转速100转/分钟，培养30h，使酿酒酵母培养基中的酵母细胞浓度达到1. OX 108/mL，得到A菌株菌液； 酿酒酵母培养基配方5° Β 麦芽汁，121°C高压灭菌20分钟； B菌株的培养，将巴氏醋杆菌巴氏亚种斜面菌种接种至醋杆菌培养基，温度30°C、转速 150转/分钟，培养Mh，使醋杆菌培养基中的巴氏醋杆菌细胞浓度达到5. OX 108/mL，得到 B菌株菌液；
醋杆菌培养基配方3° Β 麦芽汁，硫酸镁0. 2%，酵母膏0. 5%，磷酸二氢钾0. 3%，葡萄糖m, 121°C高压灭菌20分钟，灭菌后加95%酒精2. 5%混勻；
C菌株的培养，将黑曲霉变种接种至黑曲霉培养基，温度30°C、转速140转/分钟培养 28h,使黑曲霉培养基中黑曲霉变种孢子浓度达到5. 0 X IOVmL,得到C菌株菌液；
黑曲霉培养基配方蔗糖3%，硝酸钠0. 2%，硫酸镁0. 05%,氯化钾0. 05%,磷酸氢二钾
0.1%，硫酸亚铁0. 001%, 121 °C高压灭菌20分钟；
2、菌株的固定化
细胞的离心洗涤取A菌株菌液50mL、B菌株菌液50mL、C菌株菌液50mL，分别在转速为6000转/分钟条件下，离心分离15分钟，倾去上清液，用0. 85%生理盐水悬浮细胞，完成一次细胞的离心洗涤；再重复2次细胞的离心洗涤，制得A菌株细胞悬液、B菌株细胞悬液和C菌株细胞悬液；
取A菌株细胞悬液50mL、B菌株细胞悬液50mL和C菌株细胞悬液50mL，与浓度2. 5% 的海藻酸钠溶液按体积比1:4的比例混合均勻，移入玻璃注射器中，适度加力，滴入浓度
1.2%的氯化钙(CaCl2)溶液，自然成型造粒，固定化细胞颗粒直径5mm，室温固化4小时，置于4°C冰箱中，12小时平衡，倾去溶液，加入无菌水洗涤3次；分别制得A菌株固定化细胞颗粒和B菌株固定化细胞颗粒，置于冰箱中备用；
3、固定化细胞连续发酵制醋
3. 1、取400g的A菌株固定化细胞颗粒、400g的B菌株固定化细胞颗粒和400g的C菌株固定化细胞颗粒，分别置于容器中，盛有A菌株固定化细胞颗粒的容器为A容器，盛有B 菌株固定化细胞颗粒的容器为B容器，盛有C菌株固定化细胞颗粒的容器为C容器；A容器的进口、B容器的进口和C容器的进口均位于容器上部，A容器的出口、B容器的出口和C容器的出口均位于容器下部；
3.2、C容器的出口连通着A容器的进口，A容器的出口连通着B容器的进口 ；25°C下， 通过进口向C容器中连续注入3%的淀粉溶液，控制流速为32mL/小时，收集B容器出口流出的发酵液J4小时平衡后即可由B容器出口连续得到醋酸溶液，醋酸溶液中醋酸含量为 3.4%。固定化细胞连续发酵装置运行性能仍稳定。
权利要求
1.多菌株固定化细胞组合物连续发酵制醋方法，其特征在于具体操作步骤如下1.1、菌株培养所用菌株为A菌株和B菌株；ASaccharomyces cerevisiae,BEiKStff lifEiKMft^ceio^acier pasteurianus subsp. pasteurianus ；1. 1. 1、A菌株的培养，将酿酒酵母斜面菌种接种至酿酒酵母培养基，温度30°C、转速 80^150转/分钟，培养24 48h，使酿酒酵母培养基中的酵母细胞浓度达到5. OX IO7AiL 1.0X109/mL，得到A菌株菌液；1. 1.2、B菌株的培养，将巴氏醋杆菌巴氏亚种斜面菌种接种至醋杆菌培养基，温度 30°C、转速8(Γ150转/分钟，培养24 48h，使醋杆菌培养基中的巴氏醋杆菌细胞浓度达到 5. OX 107/mL 5. 0 X lOVmL,得到 B 菌株菌液；1.2、菌株的固定化1. 2. 1、细胞的离心洗涤取A菌株菌液50mL、B菌株菌液50mL，分别在转速为5000 10000转/分钟条件下，离心分离10 15分钟，倾去上清液，用0. 85%生理盐水悬浮细胞， 完成一次细胞的离心洗涤；再重复2次细胞的离心洗涤，制得A菌株细胞悬液和B菌株细胞悬液；1. 2. 2、取A菌株细胞悬液50mL和B菌株细胞悬液50mL，与浓度 5%的固定化载体溶液按体积比1 1 4的比例混合均勻，成型造粒，固定化细胞颗粒直径2 5mm，室温固化2 6小时，温度4°C，12小时平衡，倾去上清液，加入无菌水洗涤3次；分别制得A菌株固定化细胞颗粒和B菌株固定化细胞颗粒；所述固定化载体溶液中载体为琼脂或壳聚糖或角叉或聚乙烯醇，溶剂为水；1.3、固定化细胞连续发酵制醋1. 3. 1、取IOOg 500g的A菌株固定化细胞颗粒和IOOg 500g的B菌株固定化细胞颗粒，分别置于容器中，盛有A菌株固定化细胞颗粒的容器为A容器，盛有B菌株固定化细胞颗粒的容器为B容器；A容器的进口和B容器的进口均位于容器上部，A容器的出口和B 容器的出口均位于容器下部；1.3. 2、A容器的出口连通着B容器的进口 ；常温下，通过进口向A容器中连续注入 2 % 6 %的蔗糖溶液，控制流速为10 IOOmL/小时，收集B容器出口流出的发酵液；1 3天平衡后即可由B容器出口连续得到醋酸溶液，醋酸溶液中醋酸含量为1. 0 4. 0%。2.多菌株固定化细胞组合物连续发酵制醋方法，其特征在于具体操作步骤如下 2. 1、菌株培养所用菌株为A菌株、B菌株和C菌株； ASaccharomyces cerevisiae,BEiKStff lifEiKMft^ceio^acier pasteurianus subsp. pasteurianus ；C菌株为黑曲霉变种As/^r^iVAAs niger var ；
2. l.UA菌株的培养，将酿酒酵母斜面菌种接种至酿酒酵母培养基，温度30°C、转速 80^150转/分钟，培养24 48h，使酿酒酵母培养基中的酵母细胞浓度达到5. OX IO7AiL 1.0X109/mL，得到A菌株菌液；2. 1.2、B菌株的培养，将巴氏醋杆菌巴氏亚种斜面菌种接种至醋杆菌培养基，温度30°C、转速8(Γ150转/分钟，培养24 48h，使醋杆菌培养基中的巴氏醋杆菌细胞浓度达到 5. OX 107/mL 5. 0 X lOVmL,得到 B 菌株菌液；·2. 1. 3、C菌株的培养，将黑曲霉变种接种至黑曲霉培养基，温度30°C、转速8(Γ150 转/分钟培养24 48h，使黑曲霉培养基中黑曲霉变种孢子浓度达到5. OX IO7AiL 5. O X108/mL，得到C菌株菌液； 2. 2、菌株的固定化·2. 2. 1、细胞的离心洗涤取A菌株菌液50mL、B菌株菌液50mL、C菌株菌液50mL，分别在转速为5000 10000转/分钟条件下，离心分离10 15分钟，倾去上清液，用0. 85%生理盐水悬浮细胞，完成一次细胞的离心洗涤；再重复2次细胞的离心洗涤，制得A菌株细胞悬液、B菌株细胞悬液和C菌株细胞悬液；·2. 2. 2、取A菌株细胞悬液50mL、B菌株细胞悬液50mL和C菌株细胞悬液50mL，与浓度 1 % 5 %的固定化载体溶液按体积比1 1 4的比例混合均勻后，成型造粒，固定化细胞颗粒直径2 5mm，室温固化2 6小时，温度4°C，12小时平衡，倾去上清液，加入无菌水洗涤 3次；分别制得A菌株固定化细胞颗粒、B菌株固定化细胞颗粒和C菌株固定化细胞颗粒； 所述的固定化载体溶液中载体为琼脂或壳聚糖或角叉或聚乙烯醇，溶剂为水； 2. 3、固定化细胞连续发酵制醋·2.3. 1、取IOOg 500g的A菌株固定化细胞颗粒、IOOg 500g的B菌株固定化细胞颗粒和IOOg 500g的C菌株固定化细胞颗粒分别置于容器中，盛有A菌株固定化细胞颗粒的容器为A容器，盛有B菌株固定化细胞颗粒的容器为B容器，盛有C菌株固定化细胞颗粒的容器为C容器；A容器的进口、B容器的进口和C容器的进口均位于容器的上部，A容器的出口、B容器的出口和C容器的出口均位于容器的下部；·2.3.2、C容器的出口连通着A容器的进口 ；A容器的出口连通着B容器的进口 ；常温下，通过进口向C容器中连续注入2% 6%的淀粉溶液，控制流速为10 IOOmL/小时，收集B容器出口流出的发酵液；1 3天平衡后即可由B容器出口连续得到醋酸溶液，醋酸溶液中醋酸含量为1.0 4.0%。
3.根据权利要求1所述的多菌株固定化细胞组合物连续发酵制醋方法，其特征在于 在菌株的固定化步骤的第2步中取A菌株细胞悬液50mL和B菌株细胞悬液50mL，与浓度 1 % 5 %的海藻酸钠溶液按体积比1 1 4的比例混合均勻，滴入浓度0. 5 % 1. 5 %的氯化钙(CaCl2)溶液，自然成型造粒；所述海藻酸钠溶液为固定化载体溶液。
4.根据权利要求2所述的多菌株固定化细胞组合物连续发酵制醋方法，其特征在于 在菌株的固定化步骤的第2步中取A菌株细胞悬液50mL、B菌株细胞悬液50mL和C菌株细胞悬液50mL，与浓度1 % 5 %的海藻酸钠溶液按体积比1 1 4的比例混合均勻，滴入浓度0.5% 1.5%的氯化钙(CaCl2)溶液，自然成型造粒；所述海藻酸钠溶液为固定化载体溶液。
全文摘要
本发明涉及多菌株固定化细胞组合物连续发酵制醋方法。该方法所用A菌株为酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae，B菌株为巴氏醋杆菌巴氏亚种Acetobacter pasteurianus subsp. pasteurianus；具体操作步骤如下1、菌株培养；2、菌株的固定化，分别制得A菌株固定化细胞颗粒和B菌株固定化细胞颗粒；3、固定化细胞连续发酵制醋。本发明采用现代生物工程技术进行食醋的生产，彻底改变传统食醋酿造工艺，实现精确调控生产工艺参数的目标；改变传统酿造工艺脏乱差的落后生产环境，降低工人劳动强度；提高原材料的利用率，提高生产效率。
文档编号C12N11/08GK102329718SQ20111032070
公开日2012年1月25日 申请日期2011年10月20日 优先权日2011年10月20日
发明者倪敬田, 唐欣昀, 孙乐妮, 常艳, 张建, 曹媛媛, 沈玲, 甘旭华, 章琦, 陈晓琳, 韩国民 申请人:安徽农业大学