专利名称：球形棕囊藻培养液的除菌方法
技术领域：
本发明涉及一种微藻培养液，尤其是涉及一种球形棕囊藻培养液的除菌方法。
背景技术：
在赤潮的微生物防治研究领域中，藻液中细菌的存在对不可培养的溶藻微生物的纯化，以及溶藻微生物和杀藻物质的杀藻机制的研究带来了极大困难，因此希望能够通过对藻液进行除菌处理来排除藻际环境细菌的干扰。目前报道的藻液除菌方法主要有①显微镜下挑取单个藻细胞，用无菌的藻培养基进行反复洗涤，然后接种于藻培养基中，该法操作较为麻烦，需要一定的藻类分离经验， 同时单个藻细胞的培养难度较大；②利用化学物质杀灭细菌，包括十二烷基磺酸钠(SDS) 等去垢剂，但化学物质同时也会对藻造成伤害；③利用抗生素特异性的杀死细菌，这是最为简便且广泛使用的方法，其缺点是不同抗生素其作用的细菌不同，有些抗生素并不能完全杀死细菌，有些抗生素同时也会对藻造成伤害。为了测定SDS和抗生素对藻的抑制作用，需要一种快速而准确的藻细胞密度测定方法。目前藻细胞计数的方法主要有(1.胡先文，董元彦，张新萍，叶发兵，可见分光光度法测定水华鱼腥藻.华中农业大学学报，2002 (03) :295-297 ；2.侯建军，黄邦钦，戴相辉，赤潮藻细胞计数方法比较研究.中国公共卫生，2004 (08) ；3.董正臻，董振芳，丁德文，快速测定藻类生物量的方法探讨.海洋科学，2004 (11) =1-2,5 ；4. Imai, I.，Y. Ishida,K. Sakaguchi， Y. Hata, Algicidal marine bacteria isolated from northern Hiroshima Bay, Japan. Fisheries science. Tokyo, 1995. 61 (4) :628-636)光学显微镜直接计数法、可见光分光光度法、荧光分光光度法、叶绿素a测定法、流式细胞计数法、库尔特计数法和活体荧光检测技术等。显微计数法工作量大，人为误差也较大；叶绿素a含量测定法耗费时间长；流式细胞计数法样品需经过一定的前处理，摸索出适合的仪器参数，同时流式细胞仪价格也较昂贵；库尔特计数线性范围较小，适用于藻密度较小时；活体荧光检测技术一次只能对一个样品进行测定，多样品时更换样品的操作同样繁琐。利用酶标仪进行测定的荧光光度法和分光光度法一次可以测定96个样品，满足快速测定的要求。SDS裂解细胞后产生的白色沉淀对吸光值的影响较大，对荧光值影响较小，且用荧光光度法测定的SDS处理藻液的藻细胞密度结果与肉眼观察结果一致；抗生素处理藻液后不产生白色沉淀，不会干扰吸光值，且用分光光度法测定的抗生素处理藻液的藻细胞密度结果与肉眼观察结果一致；因此本发明分别选用荧光光度法和分光光度法测定 SDS和抗生素处理藻液的藻细胞密度。此外，在各种除菌方法中，最重要的一步是如何以有效、准确、可靠的手段来证实所获得的体系内是否真的无菌。报道的许多方法只是利用各种培养基进行细菌培养实验， 一旦发现没有细菌生长，就认为是无菌的，考虑到大多数的微生物都是未可培养的，这个检验结果并不可信；另外还有报道分别利用表面荧光显微镜观察以及对真细菌和古细菌16S rDNA进行特异性扩增来检验细菌是否存在(5. Su, J. Q.，X. R. Yang, Τ. L. Zheng, H. S. Hong,An efficient method to obtain axenic cultures of Alexandrium tamarense—a PSP-producing dinoflagellate. Journal of Microbiological Methods,2007. 69(3) 425-430.)。在前期实验中，我们发现真细菌16S rDNA保守性引物可以扩增出球形棕囊藻的线粒体DNA片段，因此不能用该方法来检测藻液中是否有菌存在。于是本发明同时利用微生物培养和表面荧光显微镜观察的方法来检测经除菌处理的藻液及其传代藻液中是否有菌存在，两种检测方法一起使用使检验结果更准确、可靠。
发明内容
本发明的目的是提供一种球形棕囊藻培养液的除菌方法。本发明的具体步骤是1)取生长至对数期的藻液，离心，去上清；2)用f/2培养基重悬藻细胞，离心，去上清，重复此步骤2次，然后用f/2培养基重悬藻细胞；3)加入SDS和8种抗生素，所述8种抗生素为克林霉素、阿奇霉素、庆大霉素、卡那
霉素、链霉素、头孢霉素、氨苄青霉素和利福霉素；4)光照培养，期间取处理藻液，离心，去上清，用f/2培养基重悬藻细胞，再离心， 去上清，除去残留的SDS和抗生素，然后转接到f/2培养基中，再光照培养；5)选取存活的、经SDS和抗生素处理的转接藻液，待其长到对数期后，利用微生物培养和表面荧光显微镜观察的方法检测其中是否有细菌存在。在步骤1)中，所述离心的条件可为2000rpm离心5min。在步骤2)中，所述离心的条件可为2000rpm离心5min。在步骤3)中，所述加入SDS和8种抗生素，最好是同时加入；所述SDS的终浓度可为0. 0025%，所述克林霉素的终浓度可为5mg/L，阿奇霉素的终浓度可为50mg/L，庆大霉素的终浓度可为100mg/L，卡那霉素的终浓度可为100mg/L，链霉素的终浓度可为1000mg/L， 头孢霉素的终浓度可为500mg/L，氨苄青霉素的终浓度可为1000mg/L，利福霉素的终浓度可为lmg/L。在步骤4)中，所述光照培养的温度可为20°C，光照培养的时间可为5天；所述离心和再离心的条件可为2000rpm离心5min。在步骤5)中，所述选取存活的、经SDS和抗生素处理的转接藻液，最好是选取存活的、经SDS和抗生素处理最长时间的转接藻液，所述处理最长时间可为5天。本发明利用无菌的f/2培养基对球形棕囊藻细胞进行反复洗涤，以去除部分细菌。本发明通过使蛋白质变性来裂解细菌，从而除去藻液中的细菌，但同时它对藻细胞也有杀灭作用。因此本发明对球形棕囊藻藻液进行除菌前，先测试其对SDS的耐受性，选择较高浓度但抑藻率又不高于50%的SDS浓度用于藻液除菌，以尽可能除去细菌，同时又对藻的伤害不会太大。本发明采用的8种抗生素中，克林霉素、阿奇霉素、庆大霉素、卡那霉素、链霉素和利福霉素通过抑制细菌蛋白质的合成达到杀菌作用，头孢霉素和氨苄青霉素通过抑制细菌细胞壁的合成达到杀菌作用。由于一些抗生素对藻也有杀灭作用，因此本发明对球形棕囊藻藻液进行除菌前，先测试其对各种抗生素的耐受性，选择较高浓度但抑藻率又不高于 50%的抗生素浓度用于藻液除菌，以尽可能除去细菌，同时又对藻的伤害不会太大。本发明提供了一种新的操作简单的藻液除菌方法，即通过重复洗涤、SDS和8种抗生素同时对藻液进行处理，以获得无菌的球形棕囊藻培养体系。有文献报道利用高浓度的SDS对藻液进行短时间除菌处理，但高浓度的SDS对藻的伤害很大；而本发明通过测试藻对SDS的耐受性，选择了低浓度的SDS对藻液进行长时间处理，对藻的伤害较小，亦能较好的除去藻液中的细菌。文献报道利用抗生素除菌的方法是先分离、纯化出藻液中的各种可培养细菌，测试几种抗生素对这些细菌的抑制效果，然后选择对这些细菌有抑制作用的抗生素对藻液进行除菌处理，但是这些抗生素不一定对藻液中的不可培养细菌也具有杀灭作用，且该方法操作较繁琐；而本发明选择了多种杀菌效果较强的广谱抗生素用于藻液除菌，通过测试藻对这些抗生素的耐受性，选择了对藻伤害不大的较高的抗生素浓度对藻液进行长时间处理，该方法操作简便，避免了细菌分离及测试对各种抗生素的敏感性等的繁琐操作，且高浓度抗生素的长时间处理具有很好的除菌效果。利用本发明的方法对藻液进行除菌，操作简便且效率高，从测试藻对SDS和抗生素的耐受性到除菌处理结束只需10天的时间，即可成功获得无菌的藻培养体系。
图1为除菌处理前的球形棕囊藻藻液经STOR green I染色后，在蓝色荧光激发下的荧光显微照片。在图1中，细菌(B)被染成亮绿色，藻细胞(A)则由于自身的红色荧光和染料的绿色荧光叠加成为橙色。图2为除菌处理后的球形棕囊藻藻液经STOR green I染色后，在蓝色荧光激发下的荧光显微照片。在图2中，只有藻细胞(A)而没有细菌，表明在除菌处理后的藻液中没有细菌。
具体实施例方式以下实施例是对本发明的进一步说明，但本发明不限于下述实施例。实施例1 测试球形棕囊藻对SDS的耐受性(1)在M孔细胞板中分装生长至对数期的球形棕囊藻藻液，每孔分装1. SmL ；(2)用f/2培养基将SDS(10%，m/v)稀释至一系列浓度梯度，取200 μ L加入1. 8mL 藻液中，使藻液中 SDS 终浓度分别为0. 01%,0. 005%,0. 0025 %,0. 001%,0. 0005% (m/ ν) ,200 μ L f/2培养基加入1. SmL藻液中作为对照，每个处理浓度设置3个重复；(3)20°C光照培养5天；(4) 5天后，每孔混勻，从中取200 μ L藻液于96孔酶标板中，200 μ L藻培养基作为空白对照，用酶标仪检测它们的荧光值(激发波长440nm，发射波长680nm)；(5)用下面的公式计算抑藻率
抑藻率=■组突光I处理组突光值χ100% ; 对照组荧光值(6)选择抑藻率低于50%的SDS浓度用于藻液的除菌；
(7) SDS对藻液的抑制效果见表1。用于球形棕囊藻藻液除菌的SDS终浓度为0. 0025%。表ISDS对球形棕囊藻的抑制效果
权利要求
1.球形棕囊藻培养液的除菌方法，其特征在于其具体步骤是1)取生长至对数期的藻液，离心，去上清；2)用m培养基重悬藻细胞，离心，去上清，重复此步骤2次，然后用m培养基重悬藻细胞；3)加入十二烷基磺酸钠和8种抗生素，所述8种抗生素为克林霉素、阿奇霉素、庆大霉素、卡那霉素、链霉素、头孢霉素、氨苄青霉素和利福霉素；4)光照培养，期间取处理藻液，离心，去上清，用f/2培养基重悬藻细胞，再离心，去上清，除去残留的十二烷基磺酸钠和抗生素，然后转接到f/2培养基中，再光照培养；5)选取存活的、经十二烷基磺酸钠和抗生素处理的转接藻液，待其长到对数期后，利用微生物培养和表面荧光显微镜观察的方法检测其中是否有细菌存在。
2.如权利要求1所述的球形棕囊藻培养液的除菌方法，其特征在于在步骤1)中，所述离心的条件为2000rpm离心5min。
3.如权利要求1所述的球形棕囊藻培养液的除菌方法，其特征在于在步骤幻中，所述离心的条件为2000rpm离心5min。
4.如权利要求1所述的球形棕囊藻培养液的除菌方法，其特征在于在步骤幻中，所述加入十二烷基磺酸钠和8种抗生素，是同时加入。
5.如权利要求1所述的球形棕囊藻培养液的除菌方法，其特征在于在步骤幻中，所述十二烷基磺酸钠的终浓度为0. 0025%，所述克林霉素的终浓度为5mg/L，阿奇霉素的终浓度为50mg/L，庆大霉素的终浓度为100mg/L，卡那霉素的终浓度为100mg/L，链霉素的终浓度为1000mg/L，头孢霉素的终浓度为500mg/L，氨苄青霉素的终浓度为1000mg/L，利福霉素的终浓度为lmg/L。
6.如权利要求1所述的球形棕囊藻培养液的除菌方法，其特征在于在步骤4)中，所述光照培养的温度为20°C，光照培养的时间为5天。
7.如权利要求1所述的球形棕囊藻培养液的除菌方法，其特征在于在步骤4)中，所述离心和再离心的条件为2000rpm离心5min。
8.如权利要求1所述的球形棕囊藻培养液的除菌方法，其特征在于在步骤幻中，所述选取存活的、经十二烷基磺酸钠和抗生素处理的转接藻液，是选取存活的、经十二烷基磺酸钠和抗生素处理最长时间的转接藻液。
9.如权利要求8所述的球形棕囊藻培养液的除菌方法，其特征在于所述处理最长时间为5天。
全文摘要
球形棕囊藻培养液的除菌方法，涉及一种微藻培养液。取生长至对数期的藻液，离心，去上清；用f/2培养基重悬藻细胞，离心，去上清，重复2次，用f/2培养基重悬藻细胞；加入SDS和抗生素，抗生素为克林霉素、阿奇霉素、庆大霉素、卡那霉素、链霉素、头孢霉素、氨苄青霉素和利福霉素；光照培养，期间取处理藻液离心去上清，用f/2培养基重悬藻细胞，再离心去上清，除去残留的SDS和抗生素，转接到f/2培养基中，再光照培养；选取存活的、经SDS和抗生素处理的转接藻液，待其长到对数期后，检测其中是否有细菌存在。操作简便，避免细菌分离及测试对抗生素的敏感性等的繁琐操作，且高浓度抗生素的长时间处理具有很好除菌效果。
文档编号C12N1/12GK102391954SQ20111032930
公开日2012年3月28日 申请日期2011年10月26日 优先权日2011年10月26日
发明者周艳艳, 苏建强, 郑天凌, 郑小伟, 黄丽萍 申请人:厦门大学