专利名称：Mlpa长探针制备方法、转基因玉米mlpa长探针及检测方法
技术领域：
本发明涉及核酸分子检测领域，特别是涉及一种用于MLPA检测技术的长探针的制备方法，由此方法制备的用于转基因玉米MLPA检测的长探针，以及转基因玉米的MLPA检测。
背景技术：
目前基因检测以PCR技术为主，检测快速、灵敏度高、结果准确、可靠。然而，PCR 方法单管只分析一个基因，效率低。当前要对如众多转基因品种和品系逐一筛查，工作量太大，成本高。因此，基因检测急需一种高通量检测方法。常见的高通量基因检测技术有基因芯片、多通道毛细管电泳和DHPLC分离技术等。然而，这些方法一般只能进行“单对多”的检测(单样品对多项目)，“多对多”方式的检测(多样品对多项目)能力有限，其有限高通量的发挥还取决于上机样品所含被检目标基因数。为一次性获得多目标DNA片段，人们采用多重PCR法，但引物间相互干扰和引物多聚体使该技术检测基因数目很难超过10个。多重连接依赖探针扩增技术(Multiplex Ligation dependent Primers Amplification MLPA)由荷兰的Dr. Schouten JP于2002年报道，最初应用于医学检测目的。其原理是针对不同的感兴趣基因位点设计长度各不相同的探针对，探针对两序列的一端具基因特异性，它们与各自目标基因区域复性后仅留一缺口，于此同时所有探针对中与目的基因不杂交的一端都接有相同的碱基序列(既通用序列)用于PCR，这样当探针对与目标区复性并在连接酶的作用下相连而本身成为PCR模板DNA，并由一对公用引物扩增而以信号放大，由于针对不同的感兴趣基因位点设计的探针对长度各不相同，经分离PCR产物大小(不须测序)便可知道是否有目标基因的存在，在并能进行相对定量分析。MLPA技术包括探针的设计、探针和靶序列DNA进行杂交，之后通过连接、PCR扩增， 产物通过琼脂糖凝胶电泳或毛细管电泳分离及数据收集等过程。具有经济(不需昂贵设备)、特异性高(探针复性及连接酶识别)及高通量(单管可测多达40多个基因)的特点。 此外，该法检测所针对的基因目标区可短至40-50bp，特别适于DNA高度降解样品的检测。 至今，MLPA技术已应用于很多领域，如单核苷酸多态性和基因突变检测、基因片段缺失和重复、染色体数目异常、基因甲基化检测及mRNA分析等等。以上MLPA技术原理显示，多基因位点凭其最终PCR扩增片段长度的不同而相互区别。为了能清晰分辨不同基因位点PCR扩增片段DNA，特别是在采用低分辨率的琼脂糖凝胶电泳分析MLPA产物时，必须拉开各扩增片段的差距。因此，在单链探针设计和制备时必须将探针之间的大小拉开，随着被检测目的基因的增加，单链探针的长度也要增加，而单链长探针的制备则是难点。单链探针制备最简单的方法是采用化学合成法，但是，当单链探针超过IOObp时， 化学合成法则不合适，因为出现合成错误的概率大大增加，合成的产量也大大降低。为克服单链探针制备的困难，发明MLPA的荷兰公司MRC-Holland开发了基于一套M13载体的单链探针制备方法，其原理就是将各M13载体的大小不同的无关序列或无关的模板(Unrelated Template, UT)引入单链探针从而获得长度不同的单链探针。该单链探针生物方法非常繁琐，不仅需要基因克隆、病毒转染、质粒提取等过程，还必须购买一套昂贵的M13载体，此外，操作M13病毒极易发生污染。为垄断MLPA应用市场，现在荷兰公司MRC-Holland不再出售M13载体，因此，单链长探针的制备急待克服。
发明内容
本发明的目的是针对上述MLPA长探针生物制备方法繁琐的问题，提供一种简单、 无污染、高效的MLPA长探针制备方法。本发明的另一目的是提供一种用于转基因玉米MLPA检测的长探针、短探针以及转基因玉米的MLPA检测方法。为了实现上述目的，本发明采用了以下技术方案本发明公布了一种MLPA长探针的制备方法，包括采用引物对以模板进行不对称 PCR扩增，然后用限制性内切酶处理不对称PCR扩增产物，凝胶电泳经过酶切处理的不对称 PCR扩增产物，切胶回收不对称PCR扩增产物中的单链DNA，即得到MLPA长探针；所述模板为与检测靶标序列无关的序列，所述不对称PCR扩增产物的序列内包括有多克隆位点，所述限制性内切酶与多克隆位点对应；所述引物对的一条引物从5’端到3’端依次包括与检测靶标序列相匹配的区段和与所述模板相匹配的区段；所述引物对的另一条引物从5’端到3’端依次包括与MLPA通用引物相匹配的区段和与所述模板相匹配的区段。本发明中的MLPA是指多重连接探针扩增技术(multiplex ligation-dependent probe amplification, MLPA)，MLPA长探针是指现有技术中由M13噬菌体衍生法制备的那条探针。所述模板是需要通过不对称PCR插入或部分插入到长探针中的序列，因此，只要是与需要检测的靶标序列没有同源关系，或同源关系比较低，或序列差异性很大，并且不会对长探针用于MLPA检测造成不利影响的序列即可。所述检测靶标序列是指MLPA检测对象的核苷酸序列，即需要检测的制定样品的核苷酸序列。所述回收是指从不对称PCR中分离获得单链DNA的过程。所述MLPA通用引物是指在MLPA长探针和短探针的5’端都具有的一段与检测靶标序列无关的序列，用于在MLPA杂交连接成功后对链接起来的探针进行PCR扩增。所述多克隆位点为具有至少一个限制性内切酶酶切位点的DNA序列。所述限制性内切酶处理，即采用与该多克隆位点所含有的酶切位点对应的内切酶进行。本发明优选的实施方式中，所述引物对中从5’端到3’端依次包括与检测靶标序列相匹配的区段和与所述模板相匹配的区段的一条引物为不对称PCR中的非限定引物，另一条引物为限定引物；所述非限定引物的5’端具有磷酸化修饰。所述非限定引物是指不对称PCR中用量相对较多的那条引物，限定引物是指用量相对较少的那条引物。不对称PCR 产物中，所产生的单链DNA即是由非限定引物所引导的。本发明的优选实施方式中，所述模板为PUC18质粒，所述限制性内切酶包括 HindIII, EcoR I中的至少一种。本发明的优选实施方式中，所述非限定引物为不对称PCR中的上游引物，所述限定引物为下游引物；所述上游引物位于PUC18质粒多克隆位点的左侧，含有％(1 ID No. 2所示序列；
Seq ID No. 2 5' -CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC-3，。作为本发明的一种优选的实施方式，所述上游引物中与PUC18质粒结合的区段均相同，且位于质粒多克隆位点的左侧；而下游引物则在PUC18质粒多克隆位点的下游根据需要插入长探针的序列长度进行设计。本发明还公布了一种转基因玉米的MLPA长探针，所述MLPA长探针的5’端带有磷酸化修饰，从5’端到3’端依次包括T2、UT、P2区段，所述T2为与检测靶标序列匹配的检测区域，UT为与检测靶标序列无关的插入序列，P2为MLPA通用引物对的结合区域；所述P2 含有kq ID No. 11所示序列；所述T2含有Seq ID No. 3所示序列，所述UT含有Seq ID No. 12所示序列，或者所述T2含有kq ID No. 5所示序列，所述UT含有kq ID No. 13所示序列；Seq ID No. 3 5' -CTTTGCCATTGCCCAGCTATCTGTCACTTTATTGT-3’Seq ID No. 5 5' -AGTCGGGTTTGGATGGTCAACTCCGGCATACTG-3，Seq ID No. 11 :5’ -TCTAGATTGGATCTTGCTGGCGC-3’Seq ID No. 12 5， -CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC-|Seq ID No.2|GTTGTAAAACGACGG-CCAGTGCCAAGCTTGCATGCCTG-3’|Seq ID No.4的互4卜配对位点Seq ID No. 13 5， -CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC-|Seq ID No.2|GTTGTAAAACGACGGCCAGTGCCAAGCTTGCATGCCTGCAGGTCGACTCTAGAGGATCCCCGGGTACCG AGCTCGAATTCGTAATCATGG-TCATAGCTGTTTCCTGTGTGAAATTG-3，|Seq ID No.6 的互补配对^^本领域技术人员熟知，MLPA检测中长探针的5’端是保证其检测特异性的关键，因此，本领域技术人员可以理解，在上述公布的长探针序列的基础上，在所述T2的3’端或者在UT或P2的两端或中间替换、添加或删减数个碱基，仍可以实现本发明所述长探针的基本功能。本发明的优选实施方式中，上述MLPA长探针的制备方法包括，采用引物对以 PUC18质粒为模板进行不对称PCR扩增，回收扩增产物中的单链DNA，即MLPA长探针；所述引物对由非限定引物和限定引物组成，所述非限定引物的5’端带有磷酸化修饰；所述非限定引物从5’端到3’端依次包括T2和UTl区段，T2为与检测靶标序列匹配的检测区域，UTl为与不对称PCR模板相匹配的区域；所述限定引物从5’端到3’端依次包括P2’和UT2区段；P2’为MLPA通用引物相匹配的区域，UT2为与不对称PCR模板相匹配的区域；所述P2’含有kq ID No. 1所示序列，所述UTl含有kq ID No. 2所示序列；所述T2含有Seq ID No. 3所示序列，UT2含有Seq ID No. 4所示序列，或者T2含有Seq ID No. 5所示序列，UT2含有Seq ID No. 6所示序列；具体的，所述非限定引物含有^^ ID No. 7所示序列，所述限定引物含有％(1 IDNo. 8所示序列；或者所述非限定引物含有kq ID No. 9所示序列，所述限定引物含有％(1 ID No. 10所示序列；Seq ID No. 1 :5，-GCGCCAGCAAGATCCAATCTAGA-3，Seq ID No. 4 5' -CAGGCATGCAAGCTTGGCACTGG-3’Seq ID No. 6 5' -CAATTTCACACAGGAAACAGCTATGA-3’Seq ID No. 7 5， -CTTTGCCATTGCCCAGCTATCTGTCACTTTATTGT-|Seq ID No.3|CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC-3’|Seq ID No.2|Seq ID No. 8 5， -GCGCCAGCAAGATCCAATCTAGA-|Seq IDNo.llCAGGCATGCAAGCTTGGCACTGG-3’|Seq ID No.4|Seq ID No. 9 5， -AGTCGGGTTTGGATGGTCAACTCCGGCATACTG-|Seq IDNo.5|CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC-3’|Seq ID No.2|Seq ID No. 10 5， -GCGCCAGCAAGATCCAATCTAGA-|Seq IDNo.llCAATTTCACACAGGAAACAGCTATGA-3’。|Seq ID No.6本发明中，不对称PCR扩增出MLPA长探针的方式是，由T2和UTl区段构成的非限定引物，和由P2 ’和UT2区段构成的限定引物，在不对称PCR时，引物的UT1或UT2分别与不对称PCR的模板，即PUC18质粒匹配，然后进行扩增，随着扩增的进行，扩增产物中会具有两条引物各自5’端的T2和P2’。由于长探针5’端需要进行磷酸化修饰，因此，不对称PCR扩增获得单链DNA的非限定引物的5’端进行了磷酸化修饰。本领域技术人员可以理解，本发明上述公布的引物对序列，只要能够基本实现以PUC18质粒为模板进行不对称PCR，在UTl 或UT2或P2’两端或中间、T2中间、T2和UTl之间，或者P2’和UT2之间替换、添加或减少数个碱基同样能够实现本发明所要求的基本功能。本发明的优选实施方式中，所述的检测转基因玉米的MLPA长探针具有％(1 ID No. 14或者kq ID No. 15所示序列；Seq ID No. 14 5， -CTTTGCCATTGCCCAGCTATCTGTCACTTTATTGT-
|Seq ID No.3|CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGACGTTGTAAAACGACGGCCAG|Seq ID No. 12]TGCCAAGCTTGCATGCCTG-TCTAGATTGGATCTTGCTGGCGC-3’|Seq IDNo.ljSeq ID No. 11Seq ID No. 15 5， -AGTCGGGTTTGGATGGTCAACTCCGGCATACTG-|Seq IDNo.5|CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGACGTTGTAAAACGACGGCCAG|Seq ID No. 13]TGCCAAGCTTGCATGCCTGCAGGTCGACTCTAGAGGATCCCCG|Seq ID No. 13]GGTACCGAGCTCGAATTCGTAATCATGGTCATAGCTGTTTCCTGT|Seq ID No. 13]GTGAAATTG-TCTAGATTGGATCTTGCTGGCGC-3’。|Seq IDNo.l3l|Seq ID No. 11本发明的实施方式中，具体的，kq ID No. 14所示序列的MLPA长探针由kq ID No. 7所示序列的非限定引物以PUC18质粒为模板进行不对称PCR扩增获得；Seq ID No. 15 所示序列的MLPA长探针由％(1 ID No. 9所示序列的非限定引物以PUC18质粒为模板进行不对称PCR扩增获得。本发明还公布了一种检测转基因玉米的MLPA短探针，所述短探针从5’端到3’端依次包括Pl和Tl区段，所述Pl为MLPA通用引物对的结合区域，Tl为与检测靶标序列匹配的检测区域；所述Pl含有ID No. 16所示序列，所述Tl含有kq ID No. 17或者Seq ID No. 18所示序列；Seq ID No. 16 :5’ -GGGTTCCCTAAGGGTTGGA-3’Seq ID No. 17 :5’ -CGAAGGACGAAGGACTCTAACGTTTAACATC-3’Seq ID No. 18 :5’ -GGATCAGATTGTCGTTTCCGCCTTCAGTTTAAACAG-3，。本发明的实施方式中，所述的检测转基因玉米的MLPA短探针具有kq ID No. 19 或Seq ID No. 20所示序列；Seq ID No. 19 5， -GGGTTCCCTAAGGGTTGGA-|Seq ID No. 16]CGAAGGACGAAGGACTCTAACGTTTAACATC-3’|Seq ID No. 17]Seq ID No. 20 5， -GGGTTCCCTAAGGGTTGGA-|Seq ID No. 16]
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GGATCAGATTGTCGTTTCCCGCCTTCAGTTTAAACAG-3，。|Seq ID No. 18]本领域技术人员熟知，MLPA检测中短探针的3’端是保证其检测特异性的关键，因此，本领域技术人员可以理解，在上述公布的短探针序列的基础上，在所述Tl的5’端或者在Pl的两端或中间替换、添加或删减数个碱基，仍然可以实现本发明所述短探针的基本功能。本发明还公布了一种转基因玉米的MLPA检测方法，所述检测方法包括采用本发明提供的MLPA长探针和短探针以转基因玉米品系的DNA序列为模板进行杂交。所述转基因玉米品系的DNA序列，在本发明中的定义为该转基因玉米品系所特有的，可用于鉴定该转基因玉米品系的特殊序列；即在玉米或转基因玉米中检测到该DNA序列，就可以得出结论认为所检测的玉米或该转基因玉米样品为该品系的转基因玉米或者含有该品系的转基因玉米。本发明的实施方式中，kq ID No. 19所示序列的MLPA短探针与kq IDNo. 14所示序列的MLPA长探针配套使用，以转基因玉米M0N810品系的DNA序列为模板进行杂交，用于其MLPA检测；Seq ID No. 20所示序列的MLPA短探针与Seq ID No. 15所示序列的MLPA 长探针配套使用，以转基因玉米M0N88017品系的DNA序列为模板进行杂交，用于其MLPA检测。本发明优选的实施方式中，所述检测方法还包括采用一对通用弓I物对杂交后连接起来的长探针和短探针进行PCR扩增，所述通用引物的上游/下游引物分别含有％(1 ID No. ID No. 1所示序列。本领域技术人员可以理解，在本发明公布的通用引物序列的基础上，进行数个碱基的替换、添加或删减，都能够实现对MLPA杂交连接后的探针序列进行扩增的基本功能。本发明的优选实施方式中，所述检测方法还包括采用转基因玉米内源基因的MLPA 检测探针进行检测，所述检测探针分别含有^^ ID似.21和％(1 ID No. 22所示序列，Seq ID No. 22所示序列探针的5’端带有磷酸化修饰；Seq ID No. 21 5' -GGGTTCCCTAAGGGTTGGA-|P1 区段CGCGTGCGTTTGTGTGGATTGT-3’|τι 区段Seq ID No. 22 5 -AGGACAAGGCTCCCTATGTAGGCAAGG-|T2 区段TCTAGATTGGATCTTGCTGGCGC-3 。—2 区段本领域技术人员可以理解，在本发明公布的短探针序列的基础上，对其Pl区段或 Ρ2区段两端或中间、Tl区段5’端或中间、Τ2区段3’端或中间进行数个碱基的替换、添加或删减，仍然能够实现其作为短探针进行MLPA检测的基本功能。
由于采用以上技术方案，本发明的有益效果在于本发明的MLPA长探针制备方法采用简单的不对称PCR扩增、酶切、凝胶电泳以及切胶回收等实验室常规技术就可以获得符合试验要求的MLPA长探针。与现有的制备方法相比，操作简单、成本低廉，在一般的实验室均可进行；解决了由于长探针制备困难、成本高昂造成的MLPA检测方法应用受到限制的问题。为MLPA检测技术的推广应用奠定了基础。 本发明巧妙的在不对称PCR扩增产物序列内设置有限制性内切酶的酶切位点，对不对称 PCR产物进行酶切处理后，通过简单的凝胶电泳和切胶回收就可以将长探针分离出来，有效的简化了长探针的回收纯化，大大降低了生产成本，使整个操作过程更加简便。本发明提供的转基因玉米的MLPA长探针和MLPA短探针，可以用于转基因玉米的检测，为转基因玉米的高通量MLPA检测奠定了基础。本发明提供的转基因玉米MLPA检测方法，为转基因玉米的多靶标检测奠定了基础，该检测方法扩展性好、特异性强，为转基因玉米检测提供了一种简单、方便、有效、可靠的高通量检测方法，特别适合用于检验检疫等部门。
图1是本发明实施例中MLPA长探针制备示意图和制备的长探针示意图，其中引物扩增的模板为PUC18质粒，P为磷酸化修饰，T2为与检测靶标序列特异性配合的区域，UTl 和UT2为与PUC18质粒结合的区域，P2’为通用引物结合区域，UT为UTl和UT2扩增区间内的插入到长探针中的插入序列；图2是本发明实施例中MLPA检测示意图，其中杂交连接的模板为转基因玉米检测靶标序列，Pl为短探针的通用引物结合区域，Tl为短探针与靶标序列特异性结合区域，T2 为长探针与靶标序列特异性结合区域，UT为长探针的插入序列，P2为长探针中与通用引物结合区域；图3是本发明实施例中制备的长探针回收纯化后的电泳结果图，其中M0N810、 NK603、M0N863、89034、88017、MIR604、GA21、BT11、59122、3272、CBH351、LY038,为对应的检测转基因玉米品系 M0N810、NK603、M0N863、M0N89034、M0N88017、MIR604、GA21、BTlU M0N59122, M0N3272, CBH351, LY038 的长探针的电泳结果；图4是本发明实施例中转基因玉米M0N810和M0N88017的MLPA检测结果，其中 1为玉米内源基因kin的检测信号91bp，2为玉米品系M0N810的检测信号170bp，3为玉米品系M0N88017的检测信号25^p，4-12为分子量标准分别为7^p、lOObp、139bp、150bp、 160bp、200bp、250bp、300bp、340bp。
具体实施例方式本发明的基本构思就是，采用不对称PCR将一段不影响靶标序列的MLPA检测的序列插入到长探针中，以满足制备不同长度的长探针的需求。具体的本发明提供了 MLPA长探针制备方法，包括采用引物对以模板进行不对称PCR扩增，所述模板为与检测靶标序列无关的序列，回收不对称PCR扩增产物中的单链DNA，即得到MLPA长探针；所述引物对的一条引物从5’端到3’端依次包括与检测靶标序列相匹配的区段和与所述模板相匹配的区段； 所述引物对的另一条引物从5’端到3’端依次包括与MLPA通用引物相匹配的区段和与所述模板相匹配的区段。在本发明中，由于MLPA长探针在与检测靶标序列杂交时，位于靶标序列的下游， 因此需要对长探针5’端进行磷酸化修饰；并且，在不对称PCR中，最终扩增出的单链DNA产物是由非限定引物所引导的，所以，本发明的不对称PCR中非限定引物为引物对中从5’端到3’端依次包括与检测靶标序列相匹配的区段和与所述模板相匹配的区段的一条引物，并且其5’端进行了磷酸化修饰，而所述“另一条引物”则为限定引物；因此，制备出的长探针， 其5’端带有磷酸化修饰，从5’端到3’端依次包括T2、UT、P2区段(图1)，其中T2为与检测靶标序列匹配的检测区域，UT为与检测靶标序列无关的插入序列，P2为MLPA通用引物对的结合区域。本领域技术人员可以理解，如果长探针在与检测靶标序列杂交时，位于靶标序列的上游，则不需要对其5’端进行磷酸化修饰，那么，上述引物对中的非限定引物和限定引物的结构就会发生相应的变化。具体为，非限定引物为从5’端到3’端依次包括与MLPA通用引物相匹配的区段和与所述模板相匹配的区段的所述的“另一条引物”。那么，制备出的长探针从5’端到3’将依次包括PI、UT和Tl区段，其中UT为在所述模板上UTl区域和UT2 区域之间的插入到长探针的区域，Tl为与检测靶标相匹配的区域。同时，短探针的结构也会相应的变化，短探针在化学合成时需要在其5’端进行磷酸化修饰，并且其序列从5’端到 3’端依次包括T2和P2区段，T2为与检测靶标序列相匹配的区域，P2为与MLPA通用引物相匹配的区域。本发明中不对称PCR的模板是一段与检测靶标序列无关的序列。该模板的选择， 首要考虑的因素则是，在将该模板的序列插入或者部分插入长探针后，该插入序列不会与检测靶标序列产生影响MLPA检测的错配；其次还必须考虑的是，该插入序列不会对长探针造成不利于其与检测靶标序列杂交的二级结构或三级结构。综合各种因素，本发明优选的采用PUC18质粒为不对称PCR的模板。另外，在不对称PCR扩增中，除了扩增出预定的需要的单链长探针DNA以外，还会扩增出双链的DNA片段。为了便于单链DNA的回收，本发明的一个设计构思是，在不对称PCR扩增产物中设计了至少一个限制性内切酶的酶切位点，在扩增完成后，对扩增产物进行酶切处理，以切除其中的双链DNA，然后通过简单的凝胶电泳和凝胶回收就可以回收获得其中的单链DNA，即MLPA单链长探针。PUC18质粒中存在大量的单一的限制性内切酶酶切位点，将其选为模板，同样也是在上述发明构思下的一个最优选择。下面通过具体实施例并结合附图对本发明作进一步详细说明。以下实施例仅仅对本发明进行进一步的说明，不应理解为对本发明的限制。实施例1转基因玉米MLPA长探针的制备1.材料和设备(1)不对称PCR扩增反应试剂10X高保真PCR缓冲液、2. 5mmol/L的dNTP混合液、50mmol/L的MgS04溶液、10 μ mol/L的上游引物、1 μ mol/L的下游引物、5U/yL的 PlantinumTaq酶高保真DNA聚合酶、Ing/ μ L的PUC18质粒溶液、灭菌蒸馏水；(2)电泳检测试剂Takara DL 500 分子量标记、6XLoading Buffer、10mg/mL 的溴化乙锭(EB)、琼脂糖、IXTAE缓冲液；(3) PCR 产物纯化试剂盒QIAquick PCR Purification kit (QIAGEN)；
(4)凝胶回收试剂盒:QIAquick Gel Extraction kit (QIAGEN)；(5)材料转基因玉米品系M0N810和M0N88017 ；(6)主要仪器设备=PCR仪(Biometra T)、电泳仪(BioRad 300Χ 型)、紫外交联仪(Spectronics，XJ-1000)、凝胶图像分析仪(CEE，GAS7001X)、微量紫外光分光光度计 ND-3300 (NANOdrop)、ABI3100 测序仪。2.不对称PCR引物设计和合成根据转基因玉米品系的特异性序列和PUC18质粒设计制备长探针的上游引物，使得上游引物的5’端为带有磷酸化修饰的与转基因玉米品系特异性序列互补配对的序列， 3’端含有kq ID No. 1所示的与PUC18质粒互补的序列；并根据MLPA检测的通用引物和 PUC18质粒设计制备长探针的下游引物，使得下游引物的5’端含有MLPA通用引物结合的位点，3’端含有与PUC18质粒下游序列互补配合的序列。根据上述原理，本发明分别设计了用于不对称PCR扩增检测转基因玉米品系M0N810和M0N88017的MLPA长探针的引物对。其中检测转基因玉米品系M0N810的长探针1的扩增引物对1包括上游引物(I^rimerSlO-l) 和下游引物(Primer810-2)；测转基因玉米品系M0N88017的长探针2的扩增引物对2包括上游引物(Primer88017-1)和下游引物(Primer88017-2)(表1)。上述引物均在宝生生物工程有限公司合成。表1不对称PCR所用弓I物
_ 名称序列(5，—3，)Seq ID No.
5，-po4-ctttgccattgcccagctatctgtcacttta
ttgtcgccagggttttcccagtcacgac-3 ‘ 7 5，-gcgccagcaagatccaatctagacaggcatgc aagcttggcactgg-3 ‘ 8 5，-po4-agtcgggtttggatggtcaactccggcat a ctgcgccagggttttcccagtcacgac-3 ‘ 9 5 '-gcgccagcaagatccaatctagacaatttcaca caggaaacagctatga-3，_103.不对称PCR扩增反应(I)PCR反应液总体积50 μ L，其中包括10Χ高保真PCR缓冲液5 μ L、2. 5mmol/L 的 dNTP 混合液 4 μ L、50mmol/L 的 MgS045 μ LUOy mol/L 的上游引物 25 μ LU μ mol/L 的下游引物5 μ L、5U/ μ L的PlantinumTaq酶高保真DNA聚合酶0. 4 μ L、lng/ μ L的PUC18质粒 1 μ L，然后加灭菌蒸馏水至反应液总体积50 μ L0O) PCR反应条件为，先94°C预变性lmin，然后进入35个循环94°C变性20sec、 65°C退火30sec、72°C延伸20sec，循环完成后最后72°C延伸lOmin。(3) PCR产物的纯化PCR产物的纯化采用QIAGEN公司的QIAquick PCRPurification kit，参考试剂盒说明书，纯化步骤如下A)在PCR产物中加入PCR产物5倍体积的Buffer PBI，混合均勻；B)将 QIAquick column 放入一个 2mL 的收集管；C)将步骤A)的混合样品加入到QIAquick column中，离心30 60sec,弃滤液；D)在经过步骤 C)的 QIAquick column 中加入 0. 75mL Buffer PE，离心 30_60sec， 弃滤液，离心Imin ；
Primer810-1 Pnmer810"2 Primer88017-1
Primer88017-2
E)将QIAquick column转移到一个新的1. 5mL的离心管上；F)加入50 μ L Buffer AE洗脱，室温下放置lmin，离心lmin，收集滤液，即纯化的 PCR产物。4. MLPA长探针的获得(1)酶切反应采用HindIII限制性内切酶消化经过纯化的不对称PCR扩增产物，酶切反应液的总体积为50μ L，其中包括上述纯化的不对称PCR扩增产物44. 75μ LUOXHindIII缓冲液5 μ L、9U/ μ L的HindIII酶0. 25 μ L。将上述酶切反应液混勻后，37°C恒温处理lh。(2)电泳及切胶回收采用3-4%的琼脂糖凝胶进行琼脂糖凝胶电泳约20 60min后，割取预期片段大小的DNA带，用QIAGEN公司提供的琼脂糖凝胶电泳回收试剂盒^jIAquick Gel Extraction kit)回收DNA，参考试剂盒说明书，具体回收步骤如下A)切取含DNA片段的胶带，按1 6加入溶液QG (Img凝胶加入300 μ L溶液)；B) 50°C水浴 10_20min，涡旋 2-3 次；C)力口 10 μ L 3mol/L 的 NaAC，混勻；D)按胶带(mg)异戊醇(mL)比例1 1的量加入异戊醇；E)将步骤 D)的溶液转入 QIAquick spin column 中，13000rpm 离心 60sec ；F)弃滤液，再力口 500 μ L 溶液 QG 至Ij QIAquick spin column 中，13000rpm 离心 60sec ；G)弃滤液，力口 750μ L 溶液 PE 至 QIAquick spin column 中，13000rpm 离心 30_60sec ；H)弃滤液，再 13000rpm 离心 60sec ；I)将QIAquick spin column置于一个新的1. 5mL的离心管中，加入50 μ L溶液 EB或水，室温静置lmin，8000rpm离心lmin，即制备的MLPA长探针。实施例2MLPA长探针检测1. MLPA长探针凝胶电泳检测采用上述相同的方法，本发明还制备了检测转基因玉米品系NK603、M0N863、 M0N89034、MIR604、GA21、BT11、M0N59122、M0N3272、CBH351、LY038 的长探针，将所有制备的 MLPA长探针进行琼脂糖凝胶电泳，定性检测各探针的长度是否与预期的相符合。琼脂糖凝胶电泳具体为，采用3%的凝胶，在电泳仪上电泳20-60min。结果显示，本发明制备的MLPA 单链长探针的长度全部合乎预期，探针的长度呈约20bp的梯度递增，见图3。2. MLPA长探针浓度测定为了便于确定制备的MLPA长探针在MLPA检测中的使用量，本发明采用微量紫外光分光光度计ND-3300对制备的MLPA长探针的浓度进行检测。其检测原理是， Quant-iTTM ds BR DNA Assay kit中的荧光染料能与DNA结合，并能在523 士 20nm的蓝光下被ND-3300检测到光吸收值，通过标准曲线的比对，即可得出DNA样品的浓度，检测的范围是10-5000ng/y L。根据测得的MLPA长探针的质量浓度，可以推导出MLPA长探针的摩尔浓度，计算公式为，摩尔浓度=质量浓度/分子质量，其中分子质量=碱基个数X324. 5g/ mol。本发明制备的MLPA长探针的浓度见表2。
实施例3转基因玉米MLPA检测选取上述制备的用于检测转基因玉米品系M0N810和M0N88017的MLPA长探针，Probe810-2和ftx)be88017-2，同时化学合成内源基因kin的MLPA检测探针 Zein-U Zein-2,并合成检测M0N810的短探针I^robeSlO-l、检测M0N88017的短探针 Probe88017-1 (表3)，应用于转基因玉米的MLPA检测。MLPA反应产物采用ABI3100测序仪进行片段分析，结果显示，M0N810、M0N88017以及内源基因kin都有扩增信号。其中M0N810 有170bp的扩增信号、M0N88017有252bp的扩增信号、内源基因kin有91bp的扩增信号 (图4)，与理论长度相符合，证明制备的MLPA长探针达到设计要求，可用于MLPA检测。表3MLPA检测探针和通用弓丨物
_ 名称序列(5，—3，)Seq ID No.
5，-P04-CTTTGCCATTGCCCAGCTATCTGTCACTTTAT TGTCGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGACGTTGTAAA
14
ACGACGGCCAGTGCCAAGCTTGCATGCCTGTCTAG ATTGGATCTTGCTGGCGC-3 ‘ 5，-GGGTTCCCTAAGGGTTGGACGAAGGACGAAGG ACTCTAACGTTTAACATC-3 ‘19
5，-PO4-AGTCGGGTTTGGATGGTCAACTCCGGCATA CTGCGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGACGTTGTAAA ACGACGGCCAGTGCCAAGCTTGCATGCCTGCAGG TCGACTCTAGAGGATCCCCGGGTACCGAGCTCGAA15
TTCGTAATCATGGTCATAGCTGTTTCCTGTGTGAAA TTGTCTAGATTGGATCTTGCTGGCGC-3 ‘ 5，-GGGTTCCCTAAGGGTTGGAGGATCAGATTGTCG
20
TTTCCCGCCTTCAGTTTAAACAG-3 ‘ 5'-GGGTTCCCTAAGGGTTGGACGCGTGCGTTTGTG TGGATTGT-3'
5，-PO4-AGGACAAGGCTCCCTATGTAGGCAAGGTCT AGATTGGATCTTGCTGGCGC-3 ‘ 22 5 '-GGGTTCCCTAAGGGTTGGA-3 ‘ 16 5，-GCGCCAGCAAGATCCAATCTAGA-3，_1MLPA的具体检测步骤如下(1)模板与探针复性将检测转基因玉米M0N810品系的长探针1、短探针1、检测转基因玉米M0N88017 品系的长探针2、短探针2以及检测内源基因的kin-Ι和kin-2混合作为混合探针，各探针的最终浓度为lOfmol/μ L。将转基因玉米M0N810品系和M0N88017品系的DNA进行等量混合作为模板DNA，并将模板DNA预先进行变性处理。反应液的总体积为4 μ L，其中包括 50ng/ μ L的预变性的模板DNA 2 μ L、各探针浓度IOfmol/ μ L的混合探针0. 75 μ L、MLPA 缓冲液0.75 μ L、灭菌蒸馏水0.5 μ L。反应液混勻后，95°C变性lmin，60°C恒温过夜(约
Probe810-2
Probe810-1
Probe88017-2
Probe88017-1 Zein-I
Zein-2
上游通用引物下游通用引物
1410-12h)。(2)连接反应在模板与探针复性后，采用连接酶将短探针和长探针连接起来。反应液总体积为 20 μ L，其中包括，1. 5 μ L 的 Ligase-65bufferA> 1. 5 μ L 的 Ligase_65bufTerB、0· 5 μ L 的 Ligase-65连接酶、12. 5μ L的灭菌蒸馏水，最后加入步骤(1)模板与探针复性的产物4 μ L。 混勻反应液，在下恒温反应15min，然后98°C处理5min灭活连接酶。(3) PCR扩增反应将上述步骤O)的连接反应产物进行PCR扩增。反应液总体积为25 μ L，其中包括=SALSA PCR buffer 2 μ L，步骤(2)连接反应的产物5 μ L，灭菌蒸馏水13 μ L，IOpmol/ μ L的MLPA通用引物1 μ L，DNA聚合酶稀释缓冲液1 μ L，5U/ μ L的DNA聚合酶0. 25 μ L，灭菌蒸馏水2. 75 μ L0PCR反应条件为，直接进入35次循环95°C变性30s、60 V复性30s、72°C延伸60s， 循环完成后72°C延伸20min。(4) PCR 产物采用ABI 3100测序仪的片段分析功能对步骤(3)中的PCR产物进行分析。以上内容是结合具体的实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。
权利要求
1.一种MLPA长探针的制备方法，所述制备方法包括，采用引物对以模板进行不对称PCR扩增，然后用限制性内切酶处理不对称PCR扩增产物，凝胶电泳经过酶切处理的不对称PCR扩增产物，切胶回收不对称PCR扩增产物中的单链 DNA，即得到MLPA长探针；所述模板为与检测靶标序列无关的序列，所述不对称PCR扩增产物的序列内包括有多克隆位点，所述限制性内切酶与多克隆位点对应；所述引物对的一条引物从5’端到3’端依次包括与检测靶标序列相匹配的区段和与所述模板相匹配的区段；所述引物对的另一条引物从5’端到3’端依次包括与MLPA通用引物相匹配的区段和与所述模板相匹配的区段。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于所述引物对中从5’端到3’端依次包括与检测靶标序列相匹配的区段和与所述模板相匹配的区段的一条引物为不对称PCR中的非限定引物，另一条引物为限定引物；所述非限定引物的5’端具有磷酸化修饰。
3.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于所述模板为PUC18质粒，所述限制性内切酶包括HindIII、EcoR I中的至少一种。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于所述非限定引物为不对称PCR中的上游引物，所述限定引物为下游引物；所述上游引物位于PUC18质粒多克隆位点的左侧，含有kq ID No. 2所示序列。
5.一种检测转基因玉米的MLPA长探针，其特征在于所述长探针的5’端带有磷酸化修饰，从5’端到3’端依次包括T2、UT、P2区段，所述P2含有kqlD No. 11所示序列；所述T2含有kq ID No. 3所示序列，所述UT含有kq ID No. 12所示序列，或者所述T2含有kq ID No. 5所示序列，所述UT含有kq ID No. 13所示序列。
6.根据权利要求5所述的MLPA长探针，其特征在于所述MLPA长探针的制备方法包括，采用引物对以PUC18质粒为模板进行不对称PCR扩增，回收扩增产物中的单链DNA，即 MLPA长探针；所述引物对由非限定引物和限定引物组成，所述非限定引物的5’端带有磷酸化修饰；所述非限定引物含有kq ID No. 7所示序列，所述限定引物含有％(1 ID No. 8所示序列；或者所述非限定引物含有kq ID No. 9所示序列，所述限定引物含有％(1 IDNo. 10所示序列。
7.一种检测转基因玉米的MLPA短探针，其特征在于所述短探针从5’端到3’端依次包括Pl和Tl区段；所述Pl含有kq ID No. 16所示序列，所述Tl含有kq ID No. 17或者 Seq ID No. 18所示序列。
8.一种转基因玉米的MLPA检测方法，其特征在于所述检测方法包括采用权利要求5 或6的MLPA长探针与权利要求7的短探针以转基因玉米品系的DNA序列为模板进行杂交。
9.根据权利要求8所述的检测方法，其特征在于还包括采用一对通用引物对杂交后连接起来的长探针和短探针进行PCR扩增，所述通用引物的上游/下游引物分别含有Seq ID No. 16 和 kq ID No. 1 所示序列。
10.根据权利要求8或9所述的检测方法，其特征在于还包括采用对转基因玉米内源基因进行MLPA检测的两条探针，所述两条探针分别含有kq IDNo. 21和kq ID No. 22所示序列，Seq ID No. 22所示序列探针的5’端带有磷酸化修饰。
全文摘要
本发明涉及核酸分子检测领域，具体公开了一种MLPA长探针的制备方法、转基因玉米MLPA长探针和短探针以及转基因玉米的MLPA检测方法。本发明的MLPA长探针制备方法采用不对称PCR扩增、酶切、凝胶电泳及切胶回收等实验室常规技术就可以进行。与现有的制备方法相比，操作简单、成本低廉，在一般的实验室均可操作；解决了由于长探针制备困难、成本高昂造成的MLPA检测方法应用受限的问题。本发明的转基因玉米MLPA长探针和短探针可以用于转基因玉米的检测，为转基因玉米的高通量MLPA检测提供了基础。在此基础上进行的转基因玉米MLPA检测方法，其扩展性能好、特异性强，为转基因玉米检测提供了一种简单、方便、有效、可靠的高通量检测方法，特别适合用于检验检疫等部门。
文档编号C12N15/10GK102399873SQ20111033107
公开日2012年4月4日 申请日期2011年10月27日 优先权日2011年10月27日
发明者凌杏园, 向才玉, 康林, 潘广, 章桂明, 陈枝楠, 陈菲 申请人:深圳出入境检验检疫局动植物检验检疫技术中心