一种表达BDNF-HA₂TAT的重组腺相关病毒及其构建方法

专利名称：一种表达BDNF-HA₂TAT的重组腺相关病毒及其构建方法
技术领域：
本发明涉及ー种重组载体，具体地说，是ー种表达BDNf-HA2TAT的重组腺相关病毒及其构建方法。
背景技术：
抑郁障碍存在海马神经元萎縮、细胞凋亡加速、神经元再生障碍等神经病理学改变。如何有效的保护海马神经元一直是抑郁障碍研究的热点和难点。脑源性神经营养因子(brain derived neurotrophi·c factor,BDNF)是神经营养因子家族中的重要成员，BDNF表达下调可能參与慢性应激所致抑郁症海马结构和功能的改变。将外源性BDNF注入强迫游泳和学习无助的抑郁大鼠模型的海马齿状回可以产生抗抑郁样活性，这说明BDNF中枢给药对于抑郁症来说是有效的。然而BDNF抗抑郁作用的发挥一方面有赖于其有效的中枢血药浓度，另ー方面中枢多次给药以及输注设备持久存在会引起神经组织的额外损伤。尽管外周静脉内给药简便、无损伤，但由于BDNF在血液循环中存在降解和血脑屏障的通透性问题，以致很难到达中枢神经的保护效应。腺相关病毒(adeno-associated virus, AAV)是目前发现的卩隹一无致病性的单链DNA病毒，也是已知的唯一能与人基因组特异染色体定点整合的天然复制缺陷病毒。它无明显的致病性，无免疫源性及炎症反应；不能独立复制，在无辅助病毒(如腺病毒、疱疹病毒)感染吋，AAV只能整合在宿主细胞的DNA中，呈潜伏感染状态，插入的外源基因表达时间长，转移外源基因时不伴随任何病毒基因的表达。AAV以点特异方式固定地整合在人19号染色体上，不存在致癌及插入突变；宿主范围广，不仅可感染分裂期细胞，对非分裂期细胞(如神经元、肌细胞等)也较敏感。基于以上特点而开发的腺相关病毒载体是继腺病毒和逆转录病毒后出现的新型基因治疗工具。如果将BDNF基因序列导入AAV载体，可以持续分泌表达BDNF。近年来，经鼻入脑的给药方式为国内外中枢神经系统给药方式研究的热点，这种给药方式既可以避免腹腔或静脉注射途径中需经血液循环入脑而引起的全身副作用，又可以避免在血液循环中降解过快，并且有着脑内药物浓度高的优点。以往的研究发现脂溶性好的小分子物质(小于IOkD)可以沿“鼻-脑”通路入脑，但大分子蛋白难以沿此通路入脑。由于在基因治疗中对神经系统有治疗作用的基因产物多为大分子蛋白，因此，寻求将大分子蛋白经“鼻-脑”通路导入脑内的方法，将为解决基因治疗的难题提供一种新的思路和方法。穿膜肽为近年来新发现的ー种具有蛋白转导功能的短肽，研究发现它的蛋白转导机制为新的非能量、非受体、非温度依赖的转导方法，常用的穿膜肽有果蝇的Ant蛋白、TAT蛋白人工合成的多聚精氨酸等。Murriel等通过腹腔注射穿膜肽2B2半乳糖苷酶，发现穿膜肽能携带该蛋白通过血脑屏障到达脑组织，同时能保持酶的活性，且在该过程中对神经细胞及血脑屏障的免疫反应很弱。上述实验均显示穿膜肽能够携帯蛋白质透过血脑屏障并保持蛋白的活性，同时对神经细胞、血脑屏障的免疫性很弱。中国专利文献CN1124343C公开了ー种由脑组织获得的神经营养因子，涉及编码了脑源神经营养因子(BDNF)的核酸序列以及用这些核酸顺序大量制得的BDNF蛋白及其片段和衍生物，还涉及BDNF蛋白质在制造治疗神经系统疾病或失调的药物中的用途。中国专利文献CN101078013A公开了神经营养因子BDNF、NT-3信号通路新成员Dok5的鉴定和应用，克隆了人dok5的基因为治疗多种神经系统疾病提供了新的作用靶点，因此可用于开发神经系统疾病的药物。中国专利文献CN101302529A公开了共表达⑶NF和BDNF的转基因神经干细胞，描述了ー种构建共表达⑶NF和BDNF的转基因神经干细胞的方法及其用途和意义，为临床治疗神经退行性疾病-帕金森氏病和/或其他中枢神经系统疾病提供了ー种转基因神经干细胞治疗新途径。王海珍等通过克隆人BDNF基因，构建含有TAT-BDNF的重组表达载体，为进ー步表达融合蛋白及探讨TAT携帯BDNF穿透血脑屏障治疗中枢神经系统疾病奠定了基础(详见:王海珍等.BDNF的克隆及pTAT/HA-BDNF重组表达载体的构建[J].神经损伤与功能重建，2008，3(5):304-306.)。李惠明等采用PCR和体外连接的方法构建了带有信号肽的脑源性神经营养因子(BDNF)的融合基因，将此基因插入到腺相关病毒载体穿梭质粒PSNAV，然后用重组质粒pSNAV-1g-BDNF转染包装细胞，筛选出永久细胞株后，用携帯腺相关病毒rep及cap基因的单纯疱疹病毒超感染包装细胞，成功包装出含有目的基因的一型血清型腺相关病·毒(详见:李惠明等.表达分泌型脑源性神经营养因子的腺相关病毒载体的构建及其表达的检测[J].生物工程学报，2008，24(2):328-332.)。但是关于ー种表达BDNf-HA2TAT的重组腺相关病毒及其构建方法目前还未见报道。

发明内容
本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种表达BDNf-HA2TAT的重组腺相
关病毒。本发明的另ー的目的是，提供一种表达BDNf-HA2TAT的重组腺相关病毒的构建方法。为实现上述目的，本发明采取的技术方案是:一种表达BDNf-HA2TAT的重组腺相关病毒，所述的表达BDNf-HA2TAT的重组腺相关病毒是由下列方法构建得到的:
a、克隆BDNFcDNA融合基因，将PCR产物连接入pGEM_T Easy载体，获得的pGEM_TEasy/BDNF转化受体菌^: Coli DH5 a，碱裂解法提取重组质粒DNA ；
b、酶切获取带有粘性末端的BDNF基因，将BDNF基因插入携帯穿膜肽TAT的载体质粒pSSCMV-HA2TAT，构建重组载体质粒 pSSCMV-BDNF_HA2TAT ；
C、在磷酸钙作用下，重组载体质粒pSSCMV-BDNF-HA2TAT、包装质粒pAAV/Ad和辅助质粒PFG140三质粒共转染HEK293细胞，转染的包装细胞继续培养，收获病毒上清，即表达BDNF-HA2TAT的重组腺相关病毒。所述的BDNF cDNA具有SEQ ID N0.1所述的核苷酸序列。所述的步骤a中BDNF基因扩增的上游引物和下游引物分别具有SEQ ID N0.2和SEQ ID N0.3所述的核苷酸序列。为实现上述第二个目的，本发明采取的技术方案是:一种表达BDNf-HA2TAT的重组腺相关病毒的构建方法，所述的构建方法包括以下步骤:
a、克隆BDNF cDNA融合基因，将PCR产物连接入pGEM_T Easy载体，获得的pGEM_TEasy/BDNF转化受体菌^: Cb7iDH5 a，碱裂解法提取重组质粒DNA ；b、酶切获取带有粘性末端的BDNF基因，将BDNF基因插入携帯穿膜肽TAT的载体质粒pSSCMV-HA2TAT，构建重组载体质粒 pSSCMV-BDNF_HA2TAT ；
C、在磷酸钙作用下，重组载体质粒pSSCMV-BDNF-HA2TAT、包装质粒pAAV/Ad和辅助质粒PFG140三质粒共转染HEK293细胞，转染的包装细胞继续培养，收获病毒上清，即表达BDNF-HA2TAT的重组腺相关病毒。所述的BDNF cDNA具有SEQ ID N0.1所述的核苷酸序列。所述的步骤a中B·DNF基因扩增的上游引物和下游引物分别具有SEQ ID N0.2和SEQ ID N0.3所述的核苷酸序列。本发明优点在于:
1、本发明构建了携带融合基因BDNf-HA2TAT的腺相关病毒载体bdnf-ha2tat/aav，表达BDNf-HA2TAT的重组腺相关病毒即可以分泌表达大分子蛋白BDNF，表达的BDNF又有穿过血脑屏障作用，同时将BDNF基因序列导入AAV载体，可以持续分泌表达BDNF，解决了 BDNF需反复给药的难题；
2、通过抗抑郁效カ筛选实验证明了可分泌表达BDNf-HA2TAT的重组腺相关病毒具有抗抑郁的作用，建立了一种有效预防和治疗抑郁障碍和应激障碍等精神疾病的手段和方法。


附图1是目的基因BDNF克隆结果:1，DNA Marker ;2，PCR产物。附图2是重组质粒pGEM-T Easy/BDNF酶切鉴定结果:1，重组质粒；2，重组质粒酶切；3, DNA Marker。附图3是重组质粒pSSCMV-BDNF-HA2TAT酶切鉴定结果:1，重组质粒；2，重组质粒酶切;3，DNA Marker。附图4是重组质粒PUC19-BDNF-HA2TAT酶切鉴定结果:1，DNA Marker ;2，重组质粒酶切；3，重组质粒。附图5是BDNf-HA2TAT测序结果。附图6是Hela细胞免疫组织化学染色結果。附图7是BDNF-HA2TAT/AAV连续经鼻给5d的FST結果。数据为mean土SEM，* p
<0.05 ;*** p < 0.0Ol0附图8是BDNF-HA2TAT/AAV连续经鼻给5d的OPF结果。数据为mean 土 SEM，** p
<0.01。附图9是BDNF_HA2TAT/AAV连续经鼻给IOd的FST結果。数据为mean土SEM，* p
<0.05 ;** p く 0.01 ;*** p く 0.0Ol0附图10是BDNF-HA2TAT/AAV连续经鼻给IOd的OPF结果。数据为mean土 SEM，* p
<0.05。
具体实施例方式下面结合附图对本发明提供的具体实施方式
作详细说明。实施例1构建包装表达BDNF的重组腺相关病毒
克隆BDNF cDNA融合基因，将PCR产物连接入pGEM_T Easy载体，获得的pGEM_TEasy/BDNF转化受体菌^: Colimb a，碱裂解法提取重组质粒DNA，酶切鉴定；酶切获取带有粘·性末端的BDNF基因，将BDNF基因插入携带穿膜肽TAT的载体质粒，构建重组载体质粒 pSSCMV-BDNF-HA2TAT，重组质粒 pSSCMV-BDNF-HA2TAT 经 EcoRI 和 BamHI 酶切制备BDNf-HA2TAT片段并连接到TOC19质粒中测序；在磷酸钙作用下，重组载体质粒Psscmv-BDNF-HA2TAT、包装质粒pAAV/Ad和辅助质粒PFG140三质粒共转染HEK293细胞，制备表达BDNf-HA2TAT的重组腺相关病毒，纯化病毒，滴定效价。一、重组载体的构建 (一)实验材料:
1.主要试剂 dNTPs IOmM
Tap DNA聚合酶天根公司
T4 DNA连接酶promaga公司
限制性内切酶EcoR IMBI公司
KpnIMBI 公司
BamHIMBI 公司
琼脂糖
胰蛋白胨
酵母提取物
SYPR Green Kit
2.重要试剂配制
(I)TE缓冲液
IM Tirs-HCl Iml (PH8.0),0.5M EDTA 0.2ml (PH8.0)，ddH20 定容至 100ml。(2) 2.5M CaCl2
称取无水CaCl2 55.5g, ddH20定容至200ml,高压灭菌,4°C保存。(3)制备固体含氨苄青霉素(Amp)的LB平板培养基
IOg胰蛋白胨；5g酵母提取物；1Og NaCl ； 12g琼脂或琼脂糖；加蒸懼水定容至1000ml，使其充分溶解，1 mo 1/L NaOH调PH至7.0，高压灭菌25min，常温保存备用。制备LB固体平板时，取无抗菌素固体LB，在微波炉内加热融化，自然冷却至约50°C时，加入Amp IOml (1:200)，混均后倒入无菌平皿中，每个平板导入32_40ml，常温凝固，4°C保存。(4)喊裂解法提取质粒所需液体
溶液 I: IM Tris-HCl 12.5ml,0.5M EDTA (PH 8.0) 10ml，葡萄糖 4.730g，加 ddH20至500ml。115°C高压灭菌15min后,4°C保存。溶液II:10% SDS 10ml, IOM NaOH 2ml，加 ddH20 至 100ml。使用时临时配制。溶液II1:5M 醋酸钾 300ml，冰醋酸 57.5ml，ddH20 定容至 500ml。4°C保存。(5) 0.25%胰酶
称取胰酶2.5g，D-Hank’ s液定容至1000ml，振荡溶解，滤菌后-20°C保存。3.质粒和菌株
F BDNF质粒，pGEM-T Easy 质粒(50 y g/y l，promaga 公司)，pSSCMV_HA2TAT质粒，PUC19质粒，pAAV/Ad质粒，pFG140质粒，大肠杆菌Top 10，HEK293细胞。4.实验仪器:
PCR仪，低压电泳仪，·水平电泳槽，紫外线透射仪，数码相机，高压灭菌锅，电热恒温水浴箱，摇床，低温高速离心机，水平式离心机，超净工作台，显微镜(ニ)实验方法:
1.目的基因BDNF的克隆 (I)设计合成引物
以F BDNF质粒为模板，应用PCR方法扩增获得删除了终止序列的BDNF片段，目的基因BDNF的cDNA核苷酸序列见SEQ ID N0.1。在其上游和下游分别加入限制性内切酶EcoRI和KpnI位点。所需引物如下:
上游引物 F (50pmol/u I): 5，-CG GAA TTC ATG ACC ATC CTT TTC CTT AC-3，(SEQID N0.2)；
下游引物 R (50pmol/u I): 5，-C GGT ACC TCT TCC CCT TTT AAT GGT C_3’ (SEQ IDN0.3)。(2) BDNF基因的扩增
1)建立PCR反应体系(0.5ml离心管):
IOXPCR bufferIOu 1 dNTPmix2u 1 上游引物F1ul
下游引物R1 u 1 模版1 U 1 Taq DNA聚合酶1 U 1 MgCl2 (25mM)6u 1 加 ddH20 至100 ii 1 011石蜡油50 ill覆盖表面；
2)PCR反应:
94°C 5min,
94°C lmin，48°C lmin，72°C 90s，共 30 个循环，
72 °C 5min ；
3)制备琼脂糖凝胶，待PCR反应结束后，取5u I反应产物加样、电泳，紫外灯下观察电泳凝胶；
4)收集从电泳凝胶下切下的含DNA片段的琼脂糖凝胶至1.5ml离心管内，称重确定体积(姆IOOmg琼脂糖凝胶相当于100 u I体积)；
5)加入等体积的酹/氯仿抽提，轻轻混勻，离心12000r/minX5min,取上清；
6)加入1/10体积的3M醋酸钠，2.5倍体积预冷的无水こ醇，混匀；
7)-20°C放置30min，4°C离心 12000r/minX lOmin，弃上清；
8)70%こ醇洗离心物沉淀一次，离心12000r/minX5min，弃上清；
9)37°C干燥后，加50iUTE溶解沉淀，定量，4°C备用。(3)将PCR扩增产物与pGEM-T Easy载体连接建立连接反应体系(0.5ml离心管): pGEM-T Easy 质粒1 ii 1 PCR 反应产物 0.1 ii g/ ill2 ill
T4DNA连接酶1 y 1 10 X T4DNA连接酶缓冲液2.5 ill
加 ddH20 至25 ii 1 混匀，23°C过夜。(4)受体菌制备:
1)取一单菌落ToplO菌种于5mlLB培养液的试管中，37°C振荡培养4h ；
2)取1.5ml入离心管中，离心10000r/minX IOmin,弃上清；
3)沉淀用冰冷的1OOmMCaCl2洗一次,离心12000r/minX IOmin,弃上清；
4)再用冰冷的1OOmMCaCl2将细菌悬起，4°C备用。(5) pGEM-T Easy/BDNF 转化 ToplO 菌
1)取连接产物pGEM-TEasy/BDNF 10 u I加入含100 u I ToplO菌的离心管中，混匀；
2)冰上放置30min，42°C热休克90s，冰上放置2min；
3)加入0.4ml LB培养液，37°C水浴2h ；
4)将LB(含1.2%琼脂)用微波炉融化后，自然放冷致50°C左右，加入Amp，倒入无菌培养皿中，4°C备用；
5)水浴2h后的转化菌离心8000r/minX 1Omin,将上清弃到仅余100 U I,全部涂于上一步制备的LB培养皿中；
6)平皿在室温下正向放置15min后，37°C倒置过夜；
7)第二天可见平皿中有百个菌落生成，挑取其中6个菌落种于5ml含Amp的LB中，37°C振荡培养过夜。(6)小量提取重组质粒DNA——碱裂解法
1)姆个样本取1.5ml菌液，离心12000r/minX 5min,将液体倒尽；
2)将细菌重悬于预冷的100ill溶液I，剧烈震荡；
3)加入200新鮮配制的溶液II悬浮，颠倒混匀；
4)加入150预冷的溶液III，颠倒混匀；
5)加入450ii I酹/氯仿抽提一次,离心12000r/minX IOmin ；
6)将上清移入新离心管中，用2.5倍体积预冷的无水こ醇沉淀，4°C离心12000r/minX IOmin,弃上清；
7)沉淀用Iml70%こ醇洗一次,离心12000r/minX 5min,弃上清；
8)37°C干燥30min后，用含RNase的TE 50 U I溶解沉淀，4°C备用。(7)提取的重组质粒DNA酶切鉴定 1)建立酶切体系:
质粒6个(0.2iig/个)
EcoRIIul
Buffer6 u 1 カロ ddH20 至60 ii 1先将ddH20，Buffer, EcoRI混匀后分装6管，再加入样本。37°C温浴Ih ;
2) 1%琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下观察电泳凝胶。(8)大量提取重组质粒DNA——碱裂解法
1)大摇酶切鉴定阳性的细菌，4°C离心5000r/minX10min，弃上清；
2)用预冷的STE洗一次·细菌，4°C离心5000r/minXlOmin，弃上清；
3)将细菌沉淀物重悬于3ml溶液I中；
4)加溶液新鮮配制的II6ml;
5)加预冷的溶液III4.5ml，摇匀，4°C离心5000r/minX10min，上清移入新管内；
6)用等体积的异丙醇沉淀，离心7000r/minXIOmin,弃上清；
7)37°C 干燥 30min 后，用 2ml TE 和 20 yl RNase 溶解，37 °C 温浴 2h ;
8)等体积的酚/氯仿抽提后，无水こ醇沉淀，_20°C过夜；
9)离心12000r/minX10min，沉淀干燥后，用750U I TE溶解；
10)加入750 u 1 14% 的 PEG8000,1.6M NaCl 沉淀 DNA,离心 12000r/minX IOmin,弃除液相RNA，干燥后，用400 u 1 TE溶解；
11)重复一次步骤8;
12)沉淀用70%こ醇洗一次，离心12000r/minX10min，弃上清，干燥后，用200TE溶解，-20°C备用。2.融合基因BDNf-HA2TAT的克隆 (I)制备 BDNF 和 psscmv-ha2tat 载体
此处应用EcoRI和KpnI酶切，因为KpnI的缓冲液是无盐的Buffer，所以要分两次消化，先消化KpnI，再补齐NaCl后消化EcoRI。第一步:消化KpnI:
DT-BDNF 大提质粒 liig/yl 5u g (5u I)
KpnI1ul
KpnI缓冲液2 u 1 加 ddH20 至20 ii 1 充分混匀，37 °C 2h。1%琼脂糖凝胶电泳鉴定。2)psscmv-ha2tat iu g/u I 2u 1KpnI0.5 u 1 KpnI缓冲液2 u 1 加 ddH20 至20 ii 1 充分混匀，37 °C 2h。1%琼脂糖凝胶电泳鉴定。第二步:消化EcoRI
I) T-BDNF/ KpnI19U 1 EcoRI4 u 1 EcoRI缓冲液5 u 1 加 ddH20 至50 ii 1 充分混匀，37°C 2h。制备1%琼脂糖凝胶，电泳，胶回收片段，-20°C备用。2) pSSCMV_HA2TAT/ KpnI19 U 1EcoRI0.5 u 1 EcoRI缓冲液3 u 1 加 ddH20 至30 ii 1 充分混匀，37°C 2h。制备1%琼脂糖凝胶，电泳，胶回收片段，-20°C备用。(2)目的基因片段与psscmv-ha2tat载体连接 建立连接反应体系
T-BDNF0.1 u g/ u 11 u 1 psscmv-ha2tat 0.05u g/u 1i u 1 IOXbuffer2.5 u 1 T4DNA连接酶I y 1 加 ddH20 至25 ii 1 充分混匀，23°C过夜。(3) pSSCMV-BDNF-HA2TAT 转化 ToplO 菌
方法同步骤I中(5) pGEM-T Easy/BDNF转化ToplO菌。(4)小提重组质粒以及酶切鉴定
方法同步骤I中(6) pGEM-T Easy/BDNF重组质粒的小提以及(7)酶切鉴定。酶切鉴定时用EcoRI和BamHI:
Psscmv-BDNF-HA2TAT4 个
EcoRI0.2 Ii 1 BamHI0.2 U 1 IOXbufferI4 U 1 加 ddH20 至40 ill
37°C温浴lh。1%琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下观察电泳凝胶。(5)大提质粒
方法同步骤I中(8) pGEM-T Easy/BDNF重组质粒的大提。定量，-20°C备用。(6)制备BDNf-HA2TAT片段并连接到PUC19质粒中测序
I)BDNf-HA2TAT片段和PUC19载体的制备 Psscmv-BDNF-HA2TAT5 U 1 EcoRI0.5 Ii 1 BamHI0.5 U 1 2 XbufferTIOu 1 加 ddH20 至50 ii 1 充分混匀，37°C 2h。1%琼脂糖凝胶电泳鉴定，胶回收片段。PUC192u 1 EcoRI 0.75 u 1 BamHI 0.75 U 1 2 XbufferTIOu 1 加 ddH20 至50 ii 1充分混匀，37°C 2h。1%琼脂糖凝胶电泳鉴定，胶回收片段。定量。2) BDNf-HA2TAT 片段连接到 PUC19 质粒 BDNf-HA2TAT1 U 1 PUC191 u 1 T4DNA连接酶1 U 1 IOXbuffer2.5 U 1 加 ddH20 至25 ii 1 充分混匀，23°C过夜。(7)基因重组产物的筛选、鉴定
1)应用步骤I(4)中的CaCl2法制备ToplO感受菌；
2)应用步骤I(5)中pGEM-T Easy/BDNF转化ToplO菌的方法转化细菌；
3)应用步骤1(6)中的方法小提重组质粒；
4)应用步骤I(7)中的方法对小提重组质粒进行鉴定；
PUC19- BDNf-HA2TAT5 U 1 EcoRI0.3 u1 BamHI0.3 U 1 2XbufferTIOu 1 加 ddH20 至50 ii 1 37°C温浴lh。1%琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下观察电泳凝胶；
5)选电泳结果正确者进行测序。ニ、病毒包装
1.病毒包装 (I)转染前准备
I)复苏HEK293细胞:取出冻存的HEK293细胞，37°C温浴约Imin融化。吸出细胞悬液，离心1200rpmX5min，留取细胞沉淀。用19%胎牛血清，DMEM高糖培养基培养，扩增细胞至直径15cm的平皿中，待细胞70-80%成片时开始转染。2)准备辅助质粒:
pAAV/Ad 质粒(1 yg/yl) 375 ill ;
pAAV/Ad 质粒辅助子(pFG140) (1 u g/U I) 375 u I ；
psscmv-bdnf-ha2tat (i y g/ y I) 375 y I。3)准备转染试剂
阳离子转染试剂PEL 9ml (8u 1/u g DNA)；
质粒稀释液45ml ；
转染试剂稀释液36ml。(2)转染和收获重组腺相关病毒AAV/BDNF_HA2TAT
1)将质粒3种依次加入45ml质粒稀释液中；
2)将转染试剂9ml加入36ml转染试剂稀释液中；
3)将稀释后的转染试剂加入质粒稀释液中，室温IOmin；
4)每个平皿的293细胞中加入3ml质粒和转染试剂混合液；5)72h后取细胞，将细胞悬存于30ml HEPES buffer中，冻容3次；
6)超声粉碎细胞，离心10000r/minX20min，留上清，加等体积上的饱和(NH4)2SO4M
淀；
7)4°C过夜，离心12000r/minX20min，取沉淀，容在含Ca、Mg的PBS中，透析三天；
8)离心，除残渣，·过膜除菌，加保护液分装，_20°C保存。2.病毒定量——荧光定量PCR
1)取病毒液0.1ml,加入 DNasel 100iU，37°C温浴 Ih ；
2)加等体积的蛋白酶K 消化液(20mM Tris HCl PH8.0, 20mMEDTA, 0.1%SDS)，37°C温浴
Ih ；
3)酚/氯仿抽堤，こ醇沉淀，纯化核酸备用；
4)建立PCR反应体系:
2 X SYPR Green Mix IOu 1 F引物1yl
R引物1ul
模板1 U 1 加 ddH20 至20 ii 1 PCR 反应引物为:上游引物 F:5’-AAGTCCCGTTGITGAnTTGGTG-3’ (SEQ ID N0.4);下游引物 R:5，-CAAGTACGCCCCCTATTGAC-3，(SEQ ID N0.5)。5) PCR 反应 预变性940C 3min ；
变性94°C lmin,退火54°C lmin,延伸68°C lmin,共40个循环；
再延伸68 0C 5min。3.免疫组织化学证实BDNF的表达
DHela细胞复苏后用5%的牛血清，DMEM高糖培养基；
2)用6孔板，细胞计数1X 105/ml ；
3)过夜后，换成无血清培养液，加病毒液0.1ml，2h后换成完全培养基，72 h后固定做免疫组化。三、结果
1.BDNf-HA2TAT融合基因的构建和鉴定
(I)目的基因BDNF的克隆
采用PCR的方法，以F BDNF质粒为模版，克隆出两端分别带有EcoRI和KpnI限制性内切酶序列；PCR产物与pGEM-T Easy载体相连，应用EcoRI限制性内切酶消化，琼脂糖凝胶电泳鉴定重组质粒，阳性质粒可见760bp的目的片段(见图1和图2)。(2)构建重组质粒 pSSCMV-BDNF-HA2TAT
重组质粒pGEM-T Easy/BDNF和pSSCMV_HA2TAT载体分别应用EcoRI和KpnI酶切后，将目的基因片段与psscmv-ha2tat载体连接，重组质粒psscmv/bdnf-ha2tat经EcoRi和BamHI酶切后，琼脂糖凝胶电泳可见865bp的目的片段(见图3和图4)，证实融合基因成功插入载体质粒的多克隆位点。(3)融合基因 BDNf-HA2TAT 测序重组质粒pSSCMV-BDNF-HA2TAT经EcoRl和BamHI酶切制备BDNf-HA2TAT片段并连接到PUC19质粒中测序。采用Sanger单链末端终止法测出全部的核苷酸序列，应用DNASIS软件分析比较该序列与设计的序列完全一致(见图5)
2.重组腺相关病毒的包装和滴定
包装分泌表达BDNf-HA2TAT的重组腺相关病毒
用3质粒(pAAV/Ad质粒、pAAV/Ad质粒辅助子、pSSCMV -BDNF-HA2TAT)磷酸钙共沉淀法转染293细胞系，转染的包装细胞·，继续培养72h后，收获病毒上清。应用荧光定量PCR测定病毒滴度为8.32X 109/ml，应用免疫组织化学证实BDNF的表达(见图6)。实施例2表达BDNf-HA2TAT的重组腺相关病毒的动物实验
表达脑源性神经营养因子的重组腺相关病毒经鼻脑通路进入大脑产生抗抑郁样作用:C57 BL/6雌性和雄性成年小鼠各分为经鼻滴入生理盐水和BDNF-HA2TAT/AAV两处理组，两处理又各分为Id给药组，连续5天给药组和连续10天给药组；ld给药组分别在给药后1，2,3天进行行为学测试(强迫游泳实验(forced swimming test, FST)和旷场探究实验(open-field exploration test, 0PF),连续5天给药组和连续10天给药组分别在给药后1,3,7天进行行为学测试(FST和OPF)。C57 BL/6 小鼠经鼻给予 BDNF_HA2TAT/AAV:BDNF-HA2TAT/AAV 连续经鼻给药 5d 和10d，各组小鼠分别在ld，3d，7d进行行为学测试:早上为0PF，晚上为FST。(1)BDNF-HA2TAT/AAV连续经鼻给5d，各组小鼠分别在ld，3d，7d后进行行为学测试:雌性和雄性C57 BL/6小鼠Id后测试组，经鼻给予BDNF-HA2TAT/AAV会显著减少FST6min的不动时间，同时均不会影响OPF的Ih总的活动距离(见图7和图8)。(2)BDNF_HA2TAT/AAV连续经鼻给10d，各组小鼠分别在ld，3d，7d后行为学测试:雌性和雄性C57 BL/6小鼠Id后测试组，经鼻给予BDNF-HA2TAT/AAV会显著减少FST 6min的不动时间，同时均不会影响OPF的Ih总的活动距离；雌性C57 BL/6小鼠7d后测试组，经鼻给予BDNF-HA2TAT/AAV会显著减少FST 6min的不动时间，同时均不会影响OPF的Ih总的活动距离，但是雄性C57 BL/6小鼠7d后测试组，经鼻给予BDNF-HA2TAT/AAV在显著减少FST 6min的不动时间的同时会增加OPF Ih总的活动距离(见图9和图10)。结论:分泌表达BDNf-HA2TAT的重组腺相关病毒可感染鼻粘膜细胞，经鼻给药达到一定剂量时在正常C57BL/6小鼠产生抗抑郁样作用，其中雌鼠对这种给药方式更敏感，效果也更持久。以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。
权利要求
1.一种表达BDNf-HA2TAT的重组腺相关病毒，其特征在于，所述的表达BDNf-HA2TAT的重组腺相关病毒是由下列方法构建得到的: a、克隆BDNFcDNA融合基因，将PCR产物连接入pGEM_T Easy载体，获得的pGEM_TEasy/BDNF转化受体菌^: Coli DH5 a，碱裂解法提取重组质粒DNA ； b、酶切获取带有粘性末端的BDNF基因，将BDNF基因插入携帯穿膜肽TAT的载体质粒pSSCMV-HA2TAT，构建重组载体质粒 pSSCMV-BDNF_HA2TAT ； C、在磷酸钙作用下，重组载体质粒pSSCMV-BDNF-HA2TAT、包装质粒pAAV/Ad和辅助质粒PFG140三质粒共转染HEK293细胞，转染的包装细胞继续培养，收获病毒上清，即表达BDNF-HA2TAT的重组腺相关病毒。
2.根据权利要求1所述的表达BDNf-HA2TAT的重组腺相关病毒，其特征在于，所述的BDNF cDNA具有SEQ ID N0.1所述的核苷酸序列。
3.根据权利要求1所述的表达BDNf-HA2TAT的重组腺相关病毒，其特征在于，所述的步骤a中BDNF基因扩增的上游引物和下游引物分别具有SEQ ID N0.2和SEQ ID N0.3所述的核苷酸序列。
4.一种表达BDNf-HA2TAT的重组腺相关病毒的构建方法，其特征在于，所述的构建方法包括以下步骤: a、克隆BDNFcDNA融合基因，将PCR产物连接入pGEM_T Easy载体，获得的pGEM_TEasy/BDNF转化受体菌^: Coli DH5 a，碱裂解法提取重组质粒DNA ； b、酶切获取带有粘性末端的BDNF基因，将BDNF基因插入携帯穿膜肽TAT的载体质粒pSSCMV-HA2TAT，构建重组载体质粒 pSSCMV-BDNF_HA2TAT ； C、在磷酸钙作用下，重组载体质粒pSSCMV-BDNF-HA2TAT、包装质粒pAAV/Ad和辅助质粒PFG140三质粒共转染HEK293细胞，转染的包装细胞继续培养，收获病毒上清，即表达BDNF-HA2TAT的重组腺相关病毒。
5.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于，所述的BDNFcDNA具有SEQ ID N0.1所述的核苷酸序列。
6.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于，所述的步骤a中BDNF基因扩增的上游引物和下游引物分别具有SEQ ID N0.2和SEQ ID N0.3所述的核苷酸序列。
全文摘要
本发明涉及一种表达BDNF-HA2TAT的重组腺相关病毒及其构建方法。本发明优点在于本发明构建了携带融合基因BDNF-HA2TAT的腺相关病毒载体BDNF-HA2TAT/AAV，表达BDNF-HA2TAT的重组腺相关病毒即可以分泌表达大分子蛋白BDNF，表达的BDNF又有穿过血脑屏障作用，同时将BDNF基因序列导入AAV载体，可以持续分泌表达BDNF，解决了BDNF需反复给药的难题；通过抗抑郁效力筛选实验证明了可分泌表达BDNF-HA2TAT的重组腺相关病毒具有抗抑郁的作用，建立了一种有效预防和治疗抑郁障碍和应激障碍等精神疾病的手段和方法。
文档编号C12N15/63GK103087997SQ20111033223
公开日2013年5月8日 申请日期2011年10月28日 优先权日2011年10月28日
发明者高成阁, 马现仓, 党永辉, 杨广笑, 李强, 陈策, 杨小波, 郭丽阳 申请人:西安交通大学医学院第一附属医院