专利名称：Pik3ca基因驱动突变的检测探针、引物及试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，具体地涉及一种PIK3CA基因驱动突变的检测探针、弓丨物及试剂盒。
背景技术：
PIK3CA(Phosphatidylinositol-3-Kinases,磷脂酰肌醇 _3_ 激酶)是一种胞内磷脂酰肌醇激酶，由一个相对分子质量为IlOX IO3的催化亚基PllO和一个相对分子质量 85X IO3的调节亚基p85构成。PIK3CA参与多种信号通路，调节细胞的生长和增值等主要生理功能。由PIK3CA活化而产生的类脂产物，3. 4- 二磷酸磷脂酰肌醇和3. 4. 5-三磷酸磷脂酰肌醇，可作为第二信使激活下游细胞内的多种靶蛋白分子，形成一个信号级联放大复合体，最终调节细胞的增殖、分化和迁移。PIK3CA激活的Akt (Protein Kinase B)可以通过磷酸化作用激活或抑制其下游靶蛋白Bad、Caspase9和mTOR等。PIK3CA/Akt信号通路与人类恶性肿瘤的发生密切相关，通过磷酸化不同类型的底物，可激活下游主要效应靶基因，其持续活化会使正常的细胞转化为肿瘤细胞。多项研究证实，由PIK3CA介导的信号通路与肿瘤发生转移密切相关。PIK3CA介导的AKT信号通路通过细胞内信号转导途径活化，获得不同的转录因子，使上皮细胞表型发生不同程度的转化，降低细胞间黏附力，增强运动能力，从而促进肿瘤细胞运动转移。其次PIK3CA参与调控肿瘤的血管生成，PIK3CA通过与E-Cadherin、β -Catenin和血管内皮生长因子受体(VEGFR)形成复合物，激活其下游通路，参与血管内皮生长因子介导的内表皮信号传递(Katso R，et al. Cellular function of phosphoinositide 3-kinases implications for development, homeostasis，and cancer. Annu Rev Cell Dev Biol 2001 ；17 :615-675)。PIK3CA介导的信号通路异常激活，会刺激肿瘤细胞恶性增殖和血管形成，增强肿瘤细胞的侵袭转移能力。PIK3CA参与了多种因子介导的肿瘤细胞的转移，针对其突变靶点设计的药物是防止癌细胞转移，提高癌症化疗效果的关键靶点蛋白。研究显示，PIK3CA基因驱动性突变在可发生在多种癌症中，包括肺癌、乳腺癌、结直肠癌、肝癌和胃癌，其中在乳腺癌的突变率可高达40% (Campbell IG, et al. Mutation of the PIK3CA gene in ovarian and breast cancer. Cancer Res 2004 ;64),在月干癌
35 % (Lee Jff, et al. PIK3CA gene is frequency mutated in breast carcinomas and hepatocellular carcinomas. Oncogene 2005;24:1477-80)。PIK3CA 基因的点突变常发生于外显子9和外显子20，通过高灵敏的检测方法对上述突变位点检测， 对于肿瘤患者的早期筛查、诊断及预后具有重要意义。临床药物 GDC-0941 (Genentech)，BEZ235 (Novartis)为 PIK3CA 的突变抑制剂类药物，其主要通过与PIK3CA的催化亚单位pllO结合，非竞争性和不可逆地抑制PIK3CA激酶活性，阻断PIK3CA介导的信号通路，从而导致癌细胞凋亡。通过抑制PIK3CA信号转导通路，抑制癌细胞生长，已经成为癌症化疗的一个重要靶点。研究表明，PIK3CA的突变会导致肿瘤患者对EGFR的靶向药物治疗产生耐药性(Jhawer M，et al. PIK3CA Mutation/ PTEN Expression Status Predicts Response of Colon Cancer Cells to the Epidermal Growth Factor Receptor Inhibitor Cetuximab. Cancer Res 2008 ;68，1953)。因此，在实施化疗之前，通过高灵敏的方法对PIK3CA基因驱动突变的检测对于延长患者生存期，避免过度化疗，指导临床科学用药有重要意义。目前，包括PIK3CA基因在内的基因驱动突变的检测方法主要为DNA直接测序法。 然而，直接测序的灵敏度低，检测灵敏度只有20-30% ；检测操作复杂，效率低，通常要1-2 天才可出检测结果。特别是对于小样本的病理组织的检测，直接测序的方法几乎无法实现其准确检测，会导致大量的漏检和假阴性的发生。包括PIK3CA基因在内的驱动性基因突变属体细胞稀有突变，具有稀少性、异质性、不稳定性等特点，而且多数驱动性突变的检测为小样本组织。因此，直接测序等技术远不能达到其实际应用的需求，迫切需要开发一种高灵敏度与高特异性的PIK3CA驱动性突变基因检测技术，以实现采用高灵敏度检测方法对 PIK3CA基因驱动性突变的检测，从而为临床个体化用药方案提供科学参考依据。针对上述问题，本发明开发一种高灵敏，快速、操作简便的PIK3CA基因驱动突变检测方法和检测试剂盒。该方法的检测灵敏度可达到0. 1%，检测时间只需90分钟即可完成，同时具备了灵敏度高，特异性好，快速准确等优点。
发明内容
本发明的目的在于提供一种用于PIK3CA基因突变检测的引物和双环探针，通过对其驱动性突变的检测实现癌症的化疗预后，其特异引物与双环探针包括如下序列
权利要求
1.用于检测PIK3CA基因突变的引物及探针，包括下列6组18条引物和探针 (1)PIK3CA驱动突变特异性引物和双环探针核苷酸序列其序列为SEQ ID NO :1至SEQID NO 18。
2.一种检测PIK3CA基因突变的检测试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述的6组 18条引物和探针。
3.如权利要求2所述的检测PIK3CA基因突变的检测试剂盒，包括如下的荧光PCR的反应体系，PIK3CA驱动突变荧光PCR反应体系IXPCR缓冲液模板DNA5 mLPIK3CA特异引物1-10 μΜPIK3CA双环探针1-10 μΜTaq 酶1-3 UMTHFR-F 引物1-10 μΜMTHFR-R 探针1-10 μΜdNTP1-50. 0 mMMgCL210-100. 0 mM甲酰胺1%-5%
4.如权利要求2所述的PIK3CA基因突变检测试剂盒的检测方法，包括以下步骤(1)提供权利要求1所述的6组18条引物和探针；(2)待测样品的处理和模板DNA的提取；(3)配制荧光PCR扩增反应体系；(4)用步骤(1)的引物和探针扩增待测驱动性基因突变靶序列；(5)利用双环探针与特异性引物的杂交，检测反应体系的FAM和HEX荧光强度，以HEX 信号达到设定阈值(Ct> 18)是表明上样DNA的量在允许范围内，FAM信号结果可信；以FAM 达到设定的阈值时所需要的循环次数Ct值作为阴阳性判定标准，Ct值为0或31 阴性；Ct 值小于31 阳性。
5.如权利要求4所述的一种PIK3CA基因突变检测试剂盒的检测方法，其特征在于步骤(2)所述的待检测样品包括手术切除的新鲜病理组织，石蜡包埋病理组织，石蜡切片，全血，血浆，血清和胸腔积液。
6.一种用于检测PIK3CA基因突变的引物及探针，其特征在于，其由SEQ ID NO :1 SEQ ID NO 18的寡核苷酸引物和探针或与其有至少70%同一性的寡核苷酸引物序列组成。
全文摘要
本发明公开了用于检测人类PIK3CA基因驱动突变的引物、探针及试剂盒，涉及到基因突变的检测。本发明的方法包括(1)提供6组18条引物和探针；(2)检测样品DNA模板的提取；(3)配制检测PI3KCA基因驱动突变的荧光PCR反应体系；(4)利用双环探针与特异性引物的杂交，检测反应体系的FAM和HEX荧光强度，根据FAM和HEX荧光强度判定结果。本发明的方法可以同时检测PIK3CA基因5种驱动性突变，该检测方法具有灵敏度高、特异性强、检测快速准确等特点。
文档编号C12N15/11GK102453765SQ20111034434
公开日2012年5月16日 申请日期2011年11月3日 优先权日2011年11月3日
发明者张海龙, 江风阁, 郑立谋, 阮力 申请人:厦门艾德生物医药科技有限公司