蛋白酶的制作方法

专利名称：蛋白酶的制作方法
技术领域：
本发明涉及具有蛋白酶活性的与拟诺卡氏菌属(Nocardiopsis)蛋白酶同源的分离多肽，还涉及编码该多肽的分离的核酸序列。此外，本发明涉及核酸构建体，载体，以及包含这些核酸序列的包括转基因植物和非人动物的宿主细胞，还涉及生产及使用此蛋白酶的方法，尤其在动物饲料中。本发明的蛋白酶具有高度的特异活性。公开了与蛋白酶的高特异活性有关的特有结构特征，该蛋白酶属于肽酶家族S2A或S1E。
背景技术：
W088/03947 中公开了源于拟诺卡氏菌(Nocardiopsis sp.) NRRL 18262 和达松维尔拟诺卡氏菌(Nocardiopsis dassonvi llei) NRRL 18133的蛋白酶。DK申请 no. 1996 00013中公开了源于拟诺卡氏菌NRRL 18262的蛋白酶的DNA和氨基酸序列。WO 01/58276公开了与源于拟诺卡氏菌NRRL 18262的蛋白酶有关的酸稳定性蛋白酶，以及源于Nocardiopsis alba DSM 14010的蛋白酶在动物饲料中的应用。然而，这些蛋白酶具有低的特异活性。JP 2-255081-A公开了源于拟诺卡氏菌株系0PC-210(FERM P-10508)的蛋白酶， 但没有序列信息。该株系(strain)已不能获得，因为其保藏已撤消。DD20043218 公开了源于Nocardiopsis dassonvillei 株系 ZIMET 43647 的蛋白水解制剂，然而没有序列信息。该株系看起来已无法获得。公布于本发明首次申请日之后的JP 2003284571-A公开了源于拟诺卡氏菌 T0A-1(FERM P-18676)的蛋白酶的氨基酸序列和相应的DNA序列。该序列已登录到 GENESEQP,条目号为 no. ADF43564。最为同源的已有非拟诺卡氏菌蛋白酶是SapII_Str印tomyces_sp_sptrembl_ q55353，其成熟部分与SEQ ID NO :2和6的成熟部分分别具有61. 5%和63. 5%的氨基酸同一性。相应的DNA与SEQ ID NO :1和5分别具有70. 3%和72. 7%的同一性。相关的链霉菌(Streptomyces)蛋白酶的成熟部分艮口 SapII_Str印tomyces_sp_sptrembl_q55352 与 SEQ ID NO 1的成熟部分具有稍高的同一性百分率，即70. 8%。本发明的目的是提供具有高特异活性的与拟诺卡氏菌蛋白酶同源的蛋白酶，尤其是具有用于动物饲料和/或洗涤剂潜力的蛋白酶。发明概述已分离并鉴定了具有高特异活性的蛋白酶，即源于Nocardiopsis alba DSM 15647(见 SEQ ID N0:1 和 2)的蛋白酶，和源于 Nocardiopsis dassonvillei subsp. dassonvillei DSM 43235 (见 SEQ ID NO :5 和 6)的蛋白酶。笛二土方面，本发明涉及具有蛋白酶活性的分离的多肽，且在pH 7.5和251下具有至少39AU/g的针对血红蛋白的特异活性，其中多肽选自下组(a)具有与SEQ ID N0:2的 1至188位氨基酸，和/或SEQ ID NO :6的1-192位氨基酸具有至少65%同一性的氨基酸序列的多肽；(b)由在低严谨条件下与SEQ ID NO 1的502-1065位核苷，和/或SEQ ID NO 5的568-1143位核苷酸杂交的核酸序列所编码的多肽；(c)由与SEQ ID NO 1的502-1065 位核苷，和/或SEQ ID NO 5的568-1143位核苷具有至少74%同一性的核酸序列所编码的多肽。本发明还涉及编码这样的蛋白酶的分离的核酸序列；核酸构建体，载体，和包含此核酸序列的宿主细胞；还涉及生产此蛋白酶的方法，以及在尤其是动物饲料方面使用此蛋白酶。第二个方面,本发明渉及A.肽酶家族S2A和/或肽酶家族SlE具有蛋白酶活性的分离的多肽，且在指定位置具有包含至少一个下述氨基酸的氨基酸序列25S，38T，42P，44S，49Q，54R, 62S，89S，91S， 92S，95A，99Q，1001，114V，120T,125Q,129Q,131L,135N,147F,151S,165S,166F,171Y,176N, 179L,180S,184L,和 / 或 185T ；优选 25S,38T,42P,44S,54R,62S,125Q,131L,165S,171Y, 176N, 179L, 180S, 184L，和 / 或 185T ；更优选同时具有至少一个 24A，51V，53E，86A，87T，961， 和/或186L ；和/或同时具有(H35+D61+S143)；其中每个位置对应于SEQ ID NO :2的位置。B.包含在指定位置具有至少一个下述氨基酸的A所述的多肽38T，92S，120T， 125Q, 131L, 135N, 147F, 151S, 165S，和 / 或 171Y。C.包含在指定位置具有至少一个下述氨基酸的々所述的多肽255，42 ，445，490， 54R，62S，89S，91S，95A，99Q，1001，114V,129Q,166F,176N,179L,180S,184L，和 / 或 185T。D.A、B、或C中任何一个多肽，其具有用DSC在IOmM磷酸钠、50mM氯化钠、pH 7.0 测定时至少78°C的Tm ；在pH 9及80°C时至少0. 40的相对活性；和/或在pH 7. 5及25°C 时对血红蛋白至少39AU/g的特异活性。E.A、B、C或D中任何一个多肽，其与SEQ ID NO :2的-167至188位氨基酸，优选 1至188位氨基酸，和/或SEQ ID NO 6的-160至192位氨基酸，优选1-192位氨基酸具有至少65%的同一性百分数，更优选与SEQ ID NO :2的1-188位氨基酸，或-167 (167)至 188位氨基酸具有至少50%的同一性百分数。F. A、B、C、D或E中任何一个多肽，其是i)细菌蛋白酶；ii)放线菌 (Actinobacteria) Π WSS Bl ；iii) M^M^M^] (the class Actinobacteria) ；iv)放线菌(Actinomycetales)目的；ν)拟诺卡氏菌科(Nocardiopsaceae)的；vi)拟诺卡氏菌属(Nocardiopsis)的；和/或源于vii)拟诺卡氏菌种如Nocardiopsis alba，南极拟诺卡氏菌(Nocardiopsis antarctica), Nocardiopsis prasina, Nocardiopsis composta, Nocardiopsis exhalans, Nocardiopsis haloph ila, Nocardiopsis halotolerans、 Nocardiopsis kunsanensis、 Nocardiopsis listeria Nocardiopsis lucentensis、 Nocardiopsis metallicus、Nocardiopsis synnemataformans、Nocardiopsis trehalosi、 热带拟诺卡氏菌(Nocardiopsis tropica)、Nocardiopsis umidischolae、新疆拟诺卡氏菌(Nocardiopsis xinjiangensis)、或 Nocardiopsis dassonvillei ；禾口任选地也源于 Nocardiopsis alkaliphila,例如源于 Nocardiopsis alba 的蛋白 ,例如，Nocardiopsis alba DSM 15647、或源于 Nocardiopsis dassonvillei 的蛋白醇、例如 Nocardiopsis dassonvillei subsp. dassonvillei DSM 43235，例如具有 SEQ ID NO :2 的-167 至 188，优选1-188位氨基酸序列的多肽，和/或具有SEQ ID NO :6的-160至192，优选1-192位氨
基酸序列的多肽。G.包含编码A、B、C、D、E或F中任何一个多肽的核酸序列的分离的核酸序列。H.包含与一个或多个控制序列可操作相连的G的核酸序列的核酸构建体，控制序列引导多肽在适当的表达宿主中生产。I.包含H的核酸构建体的重组表达载体。J.包含H的核酸构建体或I的载体的重组宿主细胞。K.生产A、B、C、D、E或F中任一多肽的方法，该方法包括(a)培养J的重组宿主细胞以生产包含该多肽的上清；和(b)回收该多肽。L.能够表达A、B、C、D、E或F中任一多肽的转基因植物、或植物部分。M.能够表达A、B、C、D、E或F中任一多肽的转基因非人动物、或产物、或其部分 (element)0N.A、B、C、D、E或F任一个所定义的至少一种多肽(i)在动物饲料中；(ii)在制备用于动物饲料的组合物中；(iii)用于提高动物饲料的营养价值；(iv)用于增加动物食物中的可消化和/或可溶性蛋白；(V)用于提高动物食物中蛋白质的水解程度；和/或(Vi) 用于处理蛋白质的用途。0.包含A、B、C、D、E或F中任一个所定义的至少一种多肽；和(a)至少一种脂溶性维生素，和/或(b)至少一种水溶性维生素，和/或(c)至少一种微量矿质元素(mineral) 的动物饲料添加剂。P.粗蛋白含量为50至800g/kg的动物饲料组合物，其包含A、B、C、D、E或F任一个所定义的至少一种多肽，或包含至少一种0的饲料添加剂。Q.包含A、B、C、D、E或F中任一个所定义的至少一种多肽的组合物，其还同时包含至少一种选自α -淀粉酶(EC 3. 2. 1. 1)、肌醇六磷酸酶(EC 3. 1. 3. 8or 3. 1. 3. 26)；木聚糖酶(EC 3. 2. 1.8)；半乳聚糖酶(galactanase) (EC 3. 2. 1. 89) ； α -半乳糖苷酶(EC 3. 2. 1. 22)；蛋白酶(EC 3. 4.-.-)，磷脂酶 Al (EC 3.1.1.32)；磷脂酶 A2 (EC 3.1.1.4)；溶血磷脂酶(EC 3. 1. 1. 5)；磷脂酶C (3. 1. 4. 3)；磷脂酶D (EC 3. 1. 4. 4)；和/或β -葡聚糖酶 (EC 3. 2. 1. 4或EC 3. 2. 1. 6)中的至少一种其他酶。R. A、B、C、D、E或F中任一个所定义的至少一种多肽在洗涤剂中的用途。第三个方面，本发明涉及:a.具有蛋白酶活性的分离的多肽，选自下组(a)具有与SEQ ID NO :2的1至188 位氨基酸有至少86%同一性，和/或与SEQ ID NO :6的1-192位氨基酸有至少72%同一性的氨基酸序列的多肽；(b)由在中等-高严谨条件下与(i)SEQ ID NO 1的502-1065位核苷，和/或SEQ ID NO 5的568-1143位核苷中任意一个，(ii)至少100个核苷的序列(i) 的子序列；和/或(iii) (i)-(ii)任意一个的互补链杂交的核酸序列所编码的多肽；(c)具有SEQ ID NO :2的1至188位氨基酸，或SEQ ID NO 6的1-192位氨基酸的多肽的变异体， 包含一个或多个氨基酸的取代，删除，延伸，和/或插入；(d) (a)、(b)、或(c)的等位变异体； 和(e)具有蛋白酶活性的(a)、(b)、(C)、或(d)的片段；b.分离的核酸序列，其为包含(a)编码a的多肽的核酸序列；(b)编码具有蛋白酶活性的多肽，且其在中等-高严谨条件下与(i)SEQ ID NO :1的502-1065位核苷，和/或SEQID NO 5的568-1143位核苷中任意一个，(ii)序列(i)的至少100个核苷；和/或(iii) (i)-(ii)任意一个的互补链杂交的核酸序列；和/或(c)编码具有蛋白酶活性的多肽，且其与(i)SEQ ID NO 1的502-1065位核苷具有至少86%的同一性，和/或与SEQ ID NO 5 的568-1143位核苷具有至少82%的同一性的核酸序列的分离的核酸序列。c.分离的核酸序列，其为通过(a)在中等-高严谨条件下将DNA与(i)SEQ ID NO 1的502-1065位核苷，和/或SEQ ID NO 5的568-1143位核苷中的任意一个；(ii)序列 ⑴的至少100个核苷；和/或(iii) (i)-(ii)中任一个的互补链杂交；和(b)分离核酸序列，来生产分离的核酸序列；d.包含与一个或多个控制序列可操作相连的b或c的核酸序列的核酸构建体，控制序列引导多肽在适当的表达宿主中生产；e.包含d的核酸构建体的重组表达载体；f.包含d的核酸构建体或e的载体的重组宿主细胞；g.生产a的多肽的方法，该方法包括(a)培养f的重组宿主细胞以生产包含该多肽的上清(supernatant)；和(b)回收该多肽；h.能够表达a的多肽的转基因植物、或植物部分；i.能够表达a的多肽的转基因非人动物、或产物、或其部分；j.生产a的多肽的方法，该方法包含(a)培养下述株系中的任一个(i) Nocardiopsis dassonvillei subsp. dassonvillei DSM 43235,或Nocardiopsis alba DSM 15647 ；和(b)回收多肽；k. a中定义的至少一种多肽(i)在动物饲料中；(ii)在制备用于动物饲料的组合物中；(iii)用于提高动物饲料的营养价值；(iv)用于增加动物食物中的可消化和/或可溶性蛋白；(ν)用于提高动物食物中蛋白质的水解程度；和/或(vi)用于处理蛋白质的用途；1.包含a中定义的至少一种多肽；和(a)至少一种脂溶维生素，和/或(b)至少一种水溶维生素，和/或(c)至少一种微量矿质元素的动物饲料添加剂；m.粗蛋白含量为50至800g/kg的动物饲料组合物，其包含a中定义的至少一种多肽，或包含至少一种1的饲料添加剂；η.包含a中定义的至少一种多肽的组合物，其还同时包含至少一种选自α-淀粉酶(EC 3. 2. 1. 1)、肌醇六磷酸酶(EC 3. 1. 3. 8 or 3. 1. 3. 26)；木聚糖酶(EC 3. 2. 1. 8)； 半乳聚糖酶(EC 3. 2. 1.89) ； α-半乳糖苷酶(EC 3. 2. 1. 2 ；蛋白酶(EC3. 4.-.-)，磷脂酶Al (EC 3. 1. 1.3 ；磷脂酶A2(EC 3. 1. 1. 4)；溶血磷脂酶(EC 3. 1.1. ;磷脂酶 C (3. 1. 4. 3)；磷脂酶 D (EC 3. 1. 4. 4)；禾口 / 或 β -葡聚糖酶(EC 3. 2. 1. 4 或 EC 3. 2. 1. 6)中的至少一种其他酶；以及ο. a中定义的至少一种多肽在洗涤剂中的用途。方面，本发明涉及具有蛋白酶活性的分离的多肽，选自下组(a)具有与 SEQ ID NO :2的1至188位氨基酸有至少84%同一性的氨基酸序列的多肽；(b)具有与 SEQ ID NO 2的-167至188位氨基酸有至少78%同一性的氨基酸序列的多肽；(c)由在中等-高严谨条件下与(i)可使用引物SEQ ID NO. 3和4由Nocardiopsis alba DSM 15647 基因组DNA获得的编码蛋白酶的DNA ;(ii) SEQ ID NO 1的502-1065位核苷；(iii) SEQ IDNO :1的1-1065位核苷；(iv)至少100个核苷的⑴或(ii)或(iii)的子序列；和/或(ν) (i)、(ii)、(iii)或(iv)的互补链杂交的核酸序列所编码的多肽；(d)具有SEQ ID NO 2的 1至188，或-167至188位氨基酸序列的多肽的变异体，其包含一个或多个氨基酸的取代、 删除、延伸、和/或插入；(e) (a)、(b)或(c)的等位变异体；和(f)具有蛋白酶活性的(a)、 (b)、(c)、(d)或(e)的片段。具有蛋白酶活性的分离的多肽，其在用差示扫描量热法(Differential Scanning Calorimetry, DSC)在IOmM磷酸钠、50mM氯化钠缓冲液、pH 7. 0、扫描速率常数1. 5°C /min 的条件下测定时，具有至少78°C的解链温度(Tm)，其中多肽选自下组(a)具有与SEQ ID NO :2的1至188位氨基酸有至少50%同一性的氨基酸序列的多肽；(b)具有与SEQ ID NO 2的-167至188位氨基酸有所述同一性的氨基酸序列的多肽；(c)由在低严谨条件下与⑴ 可使用引物SEQ ID NO. 3和4由Nocardiopsis alba DSM 15647基因组DNA获得的编码蛋白酶的 DNA ； (ii)SEQ ID NO 1 的 502-1065 位核苷；(iii) SEQ ID NO 1 的 1-1065 位核苷； (iv)至少100个核苷的⑴或(ii)或(iii)的子序列；和/或(v) (i)、(ii)、(iii)或(iv) 的互补链杂交的核酸序列所编码的多肽；(d)具有SEQ ID NO :2的1至188，或-167至188 位氨基酸序列的多肽的变异体，其包含一个或多个氨基酸的取代、删除、延伸、和/或插入； (e) (a)、(b)或(c)的等位变异体；和(f)具有蛋白酶活性的(a)、(b)、(c)、(d)或(e)的片段。包含(a)编码以上定义的多肽的核酸序列；(b)编码具有蛋白酶活性的多肽，且在中等-高严谨条件下与(i)可使用引物SEQ ID NO. 3和4由Nocardiopsis alba DSM 15647 基因组DNA获得的编码蛋白酶的DNA ； (ii)SEQ ID NO 1的502-1065位或1-1065位核苷； (iii)至少100个核苷的(i)或(ii)的子序列；和/或(iv) (i)、(ii)或(iii)的互补链杂交的核酸序列；(c)编码具有蛋白酶活性的多肽，且与SEQ ID NO :1的502-1065位核苷有至少86%同一性的核酸序列；(d)编码具有蛋白酶活性的多肽，且与SEQ ID NO 1的1-1065 位核苷有至少82%同一性的核酸序列的分离的核酸序列。包含编码具有蛋白酶活性的多肽的核酸序列的分离的核酸序列，其在用差示扫描量热法(DSC)在IOmM磷酸钠、50mM氯化钠缓冲液、pH 7. 0、扫描速率常数1. 5°C /min的条件下测定时，具有至少78°C的解链温度(Tm)，其中所述核酸序列(a)编码如上定义的Tm至少为78°C的多肽；(b)在低严谨条件下与(i)可使用引物SEQ ID NO. 3和4由Nocardiopsis alba DSM 15647基因组DNA获得的编码蛋白酶的DNA ； (ii) SEQ ID NO :1的502-1065位或 1-1065位核苷；(iii)至少100个核苷的⑴或(ii)的子序列；和/或(iv)⑴、(ii)或 (iii)的互补链杂交；(c)与SEQ ID NO=I的502-1065位核苷具有至少50%的同一性；和 /或(d)与SEQ ID NO 1的1-1065位核苷具有至少50%的同一性。分离的核酸序列，其通过(a)在中等-高严谨条件下将DNA与⑴可使用引物SEQ ID N0. 3和4由Nocardiopsis alba DSM 15647基因组DNA获得的编码蛋白酶的DNA ； (ii) SEQ ID NO :1的502-1065位核苷；(iii)至少100个核苷的⑴或(ii)的子序列；或(iv) (i)、(ii)或(iii)的互补链杂交；和(b)分离核酸序列而生产。核酸构建体，其包含紧接本段的上面三段中任何一段所定义的三条核酸序列之一，其中所述核酸序列与一个或多个引导多肽在适当的表达宿主中生产的控制序列可操作相连。
包含所述核酸构建体的重组表达载体。包含所述核酸构建体或载体的重组宿主细胞。生产上述定义的多肽的方法，该方法包含(a)培养权利要求8的重组宿主细胞以生产包含所述多肽的上清；和(b)回收所述多肽。能够表达上述定义的多肽的转基因植物，或植物部分。能够表达如上定义的多肽的转基因非人动物，或产物，或其部分。上述定义的至少一种多肽(i)在动物饲料中；(ii)在制备用于动物饲料的组合物中；(iii)用于改善动物饲料的营养价值；(iv)用于增加动物食物(diet)中的可消化和/ 或可溶性蛋白；(ν)用于提高动物食物中蛋白质的水解程度；和/或(vi)用于处理蔬菜蛋白质的用途。包含如上定义的至少一种多肽；和(a)至少一种脂溶维生素，和/或(b)至少一种水溶维生素，和/或(c)至少一种微量矿质元素的动物饲料添加剂。粗蛋白含量为50至800g/kg的动物饲料组合物，其包含如上定义的至少一种多肽，或包含如上定义的至少一种饲料添加剂。包含如上定义的至少一种多肽的组合物，其同时还包含至少一种选自α-淀粉酶(EC 3. 2. 1. 1)、肌醇六磷酸酶(EC 3. 1. 3. 8 or 3. 1. 3. 26)；木聚糖酶(EC 3. 2. 1. 8)； 半乳聚糖酶(EC 3. 2. 1.89) ； α-半乳糖苷酶(EC 3. 2. 1. 22)；蛋白酶(EC 3.4·-·-)， 磷脂酶Al (EC 3. 1. 1.32)；磷脂酶A2 (EC 3.1.1.4)；溶血磷脂酶(EC 3. 1. 1.5)；磷脂酶 C (3. 1. 4. 3)；磷脂酶 D (EC 3. 1. 4. 4)；禾口 / 或 β -葡聚糖酶(EC 3. 2. 1. 4 或 EC 3. 2. 1. 6)中的至少一种其他酶。如上定义的至少一种多肽在洗涤剂中的用途。上述第二、第三、和第四个方面的实施方案相互独立，也是本发明第一个方面的优选亚方面，同时也互为优选的亚方面。本发明还涉及如下方面1.具有蛋白酶活性，且在pH 7. 5及25°C时对血红蛋白具有至少39AU/g特异活性的分离的多肽，其中多肽选自下组(a)具有与SEQ ID NO :2的1至188位氨基酸，和/或SEQ ID NO 6的1-192位氨基酸有至少65%同一性的氨基酸序列的多肽；(b)由在低严谨条件下与SEQ ID NO 1的502-1065位核苷酸，和/或SEQ ID NO 5的568-1143位核苷酸杂交的核酸序列所编码的多肽；(c)由与 SEQ ID NO :1 的 502-1065 位核苷酸，和 / 或 SEQ ID NO :5 的 568-1143 位核苷酸具有至少74%同一性的核酸序列所编码的多肽。2.包含编码项1的多肽的核酸序列的分离的核酸序列。3.分离的核酸序列，其包含编码具有蛋白酶活性，且在pH 7. 5及25°C时对血红蛋白具有至少39AU/g特异活性的多肽的核酸序列的，其中该核酸序列(a)在低严谨条件下与SEQ ID NO 1的502-1065位核苷酸，和/或SEQ ID NO 5 的568-1143位核苷酸中任何一个杂交；(b)与 SEQ ID NO 1 的 502-1065 位核苷酸，和 / 或 SEQ ID NO 5 的 568-1143 位核苷酸中任何一个具有至少74%的同一性；和/或
(c)编码与SEQ ID NO :2的1至188位氨基酸，和/或SEQ ID NO 6的1-192位氨基酸有至少65%同一性的多肽。4.包含可操作地连接至一个或多个控制序列的项2-3中任一个的核酸序列的核酸构建体，控制序列引导多肽在适当表达宿主中的生产。5.包含项4的核酸构建体的重组表达载体。6.包含项4的核酸构建体或项5的载体的重组宿主细胞。7.生产项1的多肽的方法，该方法包含(a)培养项6的重组宿主细胞以生产包含所述多肽的上清；和(b)回收该多肽。8.转基因植物，或植物部分，其能够表达项1所述的多肽。9.转基因非人动物，或者产品，或其部分，其可以表达项1的多肽。10.生产项1的多肽的方法，该方法包含(a)培养下述株系中任何一个(i)Nocardiopsis dassonvillei Mft dassonvillei DSM 43235,(ii)Nocardiopsis alba DSM 15647 ；和(b)回收所述多肽。11.项1中定义的至少一种多肽⑴在动物饲料中；(ii)在制备用于动物饲料的组合物中；(iii)用于改善动物饲料的营养价值；(iv)用于增加动物食物中的可消化和/ 或可溶性蛋白；(V)用于提高动物食物中蛋白质的水解程度；和/或(Vi)用于蛋白质处理的用途。12.动物饲料添加剂，其包含项1定义的至少一种多肽；和(a)至少一种脂溶性维生素，和/或(b)至少一种水溶性维生素，和/或(c)至少一种微量矿质。13.粗蛋白含量为50至800g/kg的动物饲料组合物，其包含至少一种项1定义的多肽，或者至少一种项12的饲料添加剂。14.包含项1定义的至少一种多肽的组合物，其还同时包含至少一种选自淀粉酶、 肌醇六磷酸酶、木聚糖酶、半乳聚糖酶、α -半乳糖苷酶、蛋白酶、磷脂酶、和/或β -葡聚糖酶的其他酶。15.项1所定义的至少一种多肽在洗涤剂中的用途。16. Nocardiopsis alba DSM 15647。发明详述具有蛋白酶(protease)活性的多肽，或蛋白酶，有时候也称肽酶、蛋白酶 (proteinases)、肽水解酶、或蛋白水解酶。蛋白酶可以是从肽的任何一端开始水解肽的外切型，或者是在多肽链内部起作用的内切型(肽内切酶)。肽内切酶在N和C端阻断的肽底物上显示活性，肽底物与所述蛋白酶的特异性相关。此处术语“蛋白酶”定义为水解肽键的酶。其包括属于EC 3.4的酶组酶(包括其13个亚类中的任何一类)中的任何酶。EC编号参考NC-IUBMB，Academic Press, San Diego, California 的酶命名法(Enzyme Nomenclature) 1992，包括分别发表于 Eur. J. Biochem. 1994,223, 1-5 ；Eur.J.Biochem. 1995,232, 1-6 ；Eur.J.Biochem. 1996,237,1-5 ；Eur. J. Biochem. 1997，250，1-6 ；和 Eur. J. Biochem. 1999，264，610-650 的增刊 1-5。该命名法定期补充更新；参见如 World Wide Web(WWW)网址 http://www. chem. qmw. ac. uk/ iubmb/enzyme/index, html。以其催化机制为基础将蛋白酶分为下述的组丝氨酸蛋白酶(S)、半胱氨酸蛋白酶(C)、天冬氨酸蛋白酶(A)、金属蛋白酶(M)和未知的或未分类的蛋白酶(U)，参见 Handbook of Proteolytic Enzymes, A. J. Barrett, N. D. Rawlings, J. F. Woessner (编)， Academic I^ress (1998)，尤其是一般介绍部分。在特定实施方案中，本发明的蛋白酶和根据本发明的用途选自下组(a)属于EC 3. 4. -·-酶组的蛋白酶；(b)属于上述手册中S组的丝氨酸蛋白酶；(c)肽酶家族S2A的丝氨酸蛋白酶；和/或(d)Biochem. J. 290 :205-218(1993)和 MEROPS 蛋白酶数据库，版本 6. 20，March 24,2003, (www.merops.ac.uk)中描述的肽酶家族SlE的丝氨酸蛋白酶。Rawlings，N. D.， 0' Brien, A. & Barrett， A. J. (2002)MEROPS :the protease database. Nucleic Acids Res. 30,343-346描述了该数据库。为了测定给定的蛋白酶是否丝氨酸蛋白酶，及S2A家族蛋白酶，将上述的手册及其指定的原则作为参考。这样的测定可用于所有类型的蛋白酶，无论其是天然的还是野生型的蛋白酶；或者是基因工程化或合成的蛋白酶。可以采用任何的测试方法来测量蛋白酶活性，所述测试方法中使用底物，该底物包括与所讨论的蛋白酶的特异性有关的肽键。PH-测试和温度-测试同样适合于所讨论的蛋白酶。口11值-测试的例子为？!12，3，4，5，6，7，8，9，10，11，或12。温度-测试的例子为30， 35，37，40，45，50，55，60，65，70，80，90，或 95°C。非限制性的蛋白酶底物的例子为酪蛋白，例如Murine-交联酪蛋白 (AZCL-Casein)，和血红蛋白。用于测定本发明蛋白酶的特异活性目的的底物是血红蛋白， 实施方案3公开了适合的测试方法。实施方案2描述了两个其他的蛋白酶，其中任何一个都可以用于测定大致的蛋白酶活性。所谓的PNA测试是用于除特异活性测定之外的目的的优选测试方法。pH 7. 5，25°C下，本发明的蛋白酶显示了针对血红蛋白的至少39AU/g的特异活性。可按实施方案3所述测定此特异活性。本发明的蛋白酶可以显示出至少40，41，42，43， 44，45，46，47，48，49，50，51，52，53，或至少 54AU/g 的特异活性。特异性测定，包括纯化蛋白酶的蛋白质含量及蛋白酶活性的测定是大家熟知的。在特定实施方案中，通过氨基酸分析，例如通过蛋白酶的酸水解，之后分离并量化释放的氨基酸来测定蛋白质含量，优选在Biochrom 20 Plus氨基酸分析仪上测定。以下是蛋白酶活性测定中特定的、任选的技术特征(i)将血红蛋白底物变性； (ii)以0. 65 % w/w的量使用血红蛋白底物；(ii)测试缓冲液是KH2P04/Na0H缓冲液，pH 7. 50 ;(ii)蛋白酶的反应时间为10分钟；(iii)酶反应后，用三氯乙酸(TCA)沉淀未消化的血红蛋白并将其去除，优选通过过滤去除；(iv)测定滤液中的TCA-可溶性血红蛋白降解产物，优选用I7Qlin & Ciocalteu' s苯酚试剂测定；(ν)参考ALCALASE 酶标准测量并确定活性单位(AU) ； (vi)用EB-SM-0349测试，优选EB-SM-0349 02/01测量活性单位(AU)；和/或(vii)所用的测试为实施方案3所公开的“蛋白酶活性测试(AU/ml) ”。ALCALASE 标准和 EM-SM-0349 测试可从 Novozymes A/S, Krogshoejvej 36，DK_2880 Bagsvaerd，Denmark (分别提供〃 your ref. Patent 10476〃 和〃 EB-SM-0349"，或〃 EB-SM-034902/01，“)获得。与SEQ ID NO :2和6的蛋白酶相关的高特异活性蛋白酶的筛选可按如下方法进行第一步，用SEQ ID NO :3，4，7，或8的引物，或者优选用SEQ ID NO :1和5的成熟肽编码部分筛选DNA文库；在合适的株系例如芽孢杆菌(Bacillus)或大肠杆菌(E. coli.)中表达杂交克隆。下一步，纯化所表达的与SEQ ID NO :2和/或6相关的蛋白酶，优选在微-纯化方法中纯化(参见，如WO 03/037914)，在下面的步骤，用酶的强抑制剂，以熟知的活性定点滴定方法(active site titration,AST)测定每个候选蛋白酶的活性蛋白酶的量。这样做是考虑到在接下来的最后步骤中能够比较同样摩尔量的每个蛋白酶，所述最后步骤是使用任何适当的测试方法测定目前已知量的蛋白酶的蛋白酶活性，例如实施方案2所用的pNA 测试。该程序的大部分可以是自动化的，如果需要的话可以在机器人的协助下进行。按照此处实验部分的描述，通过例如纯化蛋白酶及确定特异活性，完成高度特异活性的鉴定。本发明蛋白酶的来源和/或其根据本发明的用途没有限制。如此，术语蛋白酶不仅包括由任何种类的微生物获得的天然的或野生型的蛋白酶，还包括其显示蛋白酶活性的任何突变体、变异体、片段等等，还包括合成的蛋白酶，例如改组蛋白酶(shuffled proteases)，共有蛋白酶(consensus proteases)。这样的基因工程蛋白酶可以按照本领域熟知的方法制备，例如通过定点突变，通过PCR(在PCR反应中将包含所需突变的PCR片段用作其中一个引物)，或者通过随机突变。例如EP 897985中描述了共有蛋白酶的制备。 例如W095/2^25和WO 96/00343中简要描述了基因改组(gene shuffling)。可以通过如 Ness, J. Ε.等在 Nature Biotechnology, Vol. 20(12), pp. 1251-1255，2002 中所述的合成改组，由亲本的特定序列独立地完成蛋白酶基因的重组。按照参考文献所述，设计在其DNA 序列中简并的合成寡核苷酸并组装基因，在其DNA序列中简并的合成寡核苷酸提供了在该组亲本蛋白酶中发现所有氨基酸的可能性。可以对全长序列进行改组，也可以只对该序列的一部分进行改组，然后再与基因的剩余部分组合而得到全长序列。具有包含SEQ ID N0 2和6任一个的成熟部分的氨基酸序列的蛋白酶是这种可用于上述改组的亲本蛋白酶的特定例子，如果需要，还可同时加上源于如拟诺卡氏菌NRRL 18262的蛋白酶以提供本发明额
外的蛋白酶。此处与给定来源连用的术语“由......获得的”(obtained from)意思应为，
核酸序列所编码的多肽由该来源生产，或者由其中存在该来源的核酸序列的细胞生产。在一个优选实施方案中，该多肽是胞外分泌的。在特定实施方案中，此蛋白酶为低致敏性变异体，其被设计用于在接触动物包括人时激发降低的免疫反应。术语免疫反应应理解为由接触该蛋白酶的动物的免疫系统引起的任何反应。免疫反应的一种类型为导致被接触(exposed)动物的IgE水平升高的过敏反应。可以使用本领域已知的技术制备低致敏性变异体。例如，可以将蛋白酶与涉及免疫反应的蛋白酶的多聚体部分(moiety)屏蔽部分或者抗原决定簇结合。与多聚体的结合可能涉及如 WO 96/17929, WO 98/30682，WO 98/35(^6，和 / 或 WO 99/00489 中所描述的多聚体与蛋白酶的体外化学连接。结合可以额外地或可选地设计体内多聚体与蛋白酶结合。 这样的结合可以通过对编码该蛋白酶的核苷序列实施基因工程，插入编码蛋白酶中额外的糖基化位点的共有序列，以及在能够使蛋白酶糖基化的宿主中表达该蛋白酶，参见，例如WO 00/26354o另外一种提供低致敏性变异体的方法是对编码该蛋白酶的核苷序列实施基因工程，以使该蛋白酶自我寡聚化，使蛋白酶单体能够屏蔽其他蛋白酶单体的抗原决定簇，并因此降低寡聚体的抗原性。例如WO 96/16177中描述了这样的产物及其制备。可以通过多种方法例如WO 00/26230和WO 01/83559中描述的噬菌体展示方法，或者EP 561907中描述的随机方法来鉴定免疫反应中涉及的抗原决定簇。一旦鉴定了抗原决定簇(印itope)， 可以通过已知的基因操作技术如定点突变(参见，如WO 00/26230, WO 00/263M和/或WO 00/22103)来改变其氨基酸序列，以生产免疫特性被改变的蛋白酶，或者可以使多聚体与抗原决定簇足够近地结合以使多聚体屏蔽该抗原决定簇。根据本发明任一方面的多肽，可以包含与SEQ ID NO :2或6中任一个的成熟肽部分，例如SEQ ID NO :2的1至188位氨基酸，和/或SEQ ID NO :6的1至192位氨基酸(成熟肽部分)具有例如约65%同一性的氨基酸序列，且其具有蛋白酶活性(以下称“同源多肽”)。在特定实施方案中，与SEQ ID NO :2或6中任一个的成熟肽部分的同一性至少为约 66%，67%，68%，69%，70%，71%，72%，73%，74%，75%，76%，77%，78%，79%，80%， 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96%，97%，98%，或者99%。在可选实施方案中，同一性至少为约50%，51 %，52%，53%， 54%，55%，56%，57%，58%，59%，60%，61%，62%，63%，或者 64%。本发明也涉及包含与SEQ ID NO :2的-167至188位氨基酸，和/或与SEQ ID NO: 6的-160至192位氨基酸具有例如至少约78%同一性的氨基酸序列的分离的多肽，且其具有蛋白酶活性。在特定实施方案中，与SEQ ID NO :2的-167至188位氨基酸具有至少约 80 %，85 %，86 %，87 %，88 %，89 %，90 %，91 %，92 %，93 %，94 %，95 %，96 %，97 %，98 %，或者99 %的同一性。在可选实施方案中，同一性至少为约50 %，51 %，52 %，53 %，54 %，55 %， 56 %, 57 %, 58 %, 59 %, 60 %, 61 %, 62 %, 63 %, 64 %, 65 %, 66 %, 67 %, 68 %, 69 %, 70 %, 71%，72%，73%，74%，75%，76%，77%，78%，79%，80%，81%，82%，83%，或者 84%。在特定实施方案中，本发明的多肽i)具有上述提到的任何同一性的氨基酸序列； 或者ii)由具有上述提到的任何同一性的氨基酸序列组成。为达到本发明的目的，使用Needleman-Wunsch(例如整体比对)“比对”程序测定两个氨基酸序列之间以及两个核酸序列之间的同一性。该程序用于多肽的比对，也同时用于核苷序列比对。用默认的计分阵列BL0SUM50进行多肽比对，默认的一致性阵列用于核苷比对。对多肽来说，空位(gap)的第一个残基的罚分(penalty)为-12，对核苷来说为-16。 空位的其他残基的罚分，多肽为_2，核苷为_4。“比对”是版本号为v20u6的FASTA软件包(参见W.R.Pearson和 D.J. Lipman(1988), “ Improved Tools for Biological Sequence Analysis " , PNAS 85 :2444-2448,禾口 W. R. Pearson(1990) “ Rapid and Sensitive Sequence Comparison with FASTP and FASTA, “ Methods in Enzymology 183 :63-98)的一部分。FASTA 蛋白质比对使用Smith-Waterman运算法则，对空位大小没有限制(参见〃 Smith-Waterman algorithm"，Τ. F. Smith 和 Μ· S. Waterman (1981) J. Mol. Biol. 147 :195-197)。在特定实施方案中，将两个氨基酸序列的成熟肽部分、或者预期或所希望的成熟肽部分用于比对。可选地，选择正在测定其与SEQ ID NO :2的成熟肽部分的同一性的序列，依据按照下述方法所作的多序列比对结果，其与SEQ ID NO :2的成熟肽部分，如通过多序列比对所鉴定的相应氨基酸残基最为相似。在此上下文中，为氨基酸残基编号(或者指定位置号，参考本发明的第二个方面) 的基础是SEQ ID N0:2，起始于Al结束于T188。可选地，该基础是源于拟诺卡氏菌NRRL 18262的蛋白酶的1-188位氨基酸(W0 01/58276中公开的SEQ ID N0:1，优选WO 01/58276 中公开的A87被T87取代的SEQ ID NO :1)。蛋白酶可包含相对于成熟肽部分延伸，即在其N端和/或C端的延伸。如果要给任一延伸的氨基酸编号的话，将依据本领域的惯例对其编号，例如，对于C端延伸189，190， 191等等，对于N端延伸-1，-2，-3等。对于与参照序列，例如SEQ ID NO :2比对的每一个蛋白酶中的每一个氨基酸残基，如上面解释的那样(用于测定同一性目的)，直接无疑义地指定其在参照序列如SEQ ID NO :2中对应的氨基酸残基是可能的。参照例如SEQ ID NO :2，将相应的残基指定为相同的位置或编号。对于另一蛋白酶中的每一氨基酸残基，可以找出参照序列如SEQ ID NO :2的相应位置，如下将其他蛋白酶的氨基酸序列指定为SEQ X。按如下方法找出相应于SEQ ID NO 2 的位置N的位置如上所述，将SEQ X与SEQ ID NO 2比对。使用下述的原则，可由比对结果直接无疑义地得出SEQ X中相应于SEQ ID NO 2的位置N的位置。SEQ X可以是所讨论的蛋白酶的成熟部分，或者也可以包括信号肽部分，或者是具有蛋白酶活性的成熟蛋白酶的片段，例如与SEQ ID NO :2长度相同的片段，和/或可以是与此处描述的SEQ ID NO 2比对时从Al延伸至T188的片段。下面插入了三个比对即表I、II和III。通过如上描述的将另一蛋白酶(分别为 SEQX1, SEQ X2和SEQ X3)与SEQ ID NO 2比对得到这些比对结果。其显示了每个蛋白酶的大约50个氨基酸残基。首先看表I的比对，很明显，SEQ ID NO 2的P42对应于SEQ Xl的Q42，因为在此比对中这些残基上下对齐。均为其指定编号42，即SEQ ID NO :2中相应残基的编号。由此比对，同样很明显，例如SEQ Xl不包含25S，38T，42P，44S，或49Q的任何一个。表I
权利要求
1.具有蛋白酶活性，且在PH7.5及25°〇时对血红蛋白具有至少39六^8特异活性的分离的多肽，其中多肽选自下组(a)由氨基酸序列为SEQID NO 2的氨基酸1至188的多肽组成；(b)由核酸序列为SEQID NO 1的502-1065位核苷酸编码的多肽；和(c)由a)或b)所述多肽中经过取代、插入和/或缺失一个或多个氨基酸而获得的氨基酸序列的多肽。
2.具有蛋白酶活性，且在pH7.5及25°〇时对血红蛋白具有至少39六^8特异活性的分离的多肽，其中多肽选自下组(a)由氨基酸序列为SEQID NO 6的氨基酸1-192的多肽组成；(b)由核酸序列为SEQID NO 5的568-1143位核苷酸编码的多肽；和(c)由a)或b)所述多肽中经过取代、插入和/或缺失一个或多个氨基酸而获得的氨基酸序列的多肽。
3.分离的核酸序列，其由编码权利要求1-2中任一项的多肽的核酸序列组成。
4.权利要求3的核酸序列，其(a)为SEQ ID NO 5 的 568-1143 位核苷酸；(b)编码SEQID NO 6的1-192位氨基酸的多肽；和(c)编码一种多肽，该多肽由SEQID NO :6的1-192位氨基酸经过取代、插入和/或缺失一个或多个氨基酸而获得的氨基酸序列的多肽。
5.包含可操作地连接至一个或多个控制序列的权利要求3-4中任一个的核酸序列的核酸构建体，控制序列引导多肽在适当表达宿主中的生产。
6.包含权利要求5的核酸构建体的重组表达载体。
7.包含权利要求5的核酸构建体或权利要求6的载体的重组宿主细胞。
8.生产权利要求1-2中任一项的多肽的方法，该方法包括(a)培养权利要求7的重组宿主细胞以生产包含所述多肽的上清；和(b)回收该多肽。
9.转基因植物部分，其包含权利要求5的核酸构建体或权利要求6的载体，并能够表达权利要求1-2中任一项所述的多肽，其中所述植物部分不是繁殖材料。
10.转基因非人动物产品，或其部分，其包含权利要求5所述的核酸构建体或权利要求 6所述的表达载体，并且所述转基因非人动物产品、或其部分不是繁殖材料。
11.生产权利要求1的多肽的方法，该方法包括(a)培养下述株系中任何一个⑴Nocardiopsis dassonvillei 亚禾中 dassonvillei DSM 43235(ii)Nocardiopsis alba DSM 15647 ；和(b)回收所述多肽。
12.权利要求1-2中任一项中定义的至少一种多肽(i)在动物饲料中；(ii)在制备用于动物饲料的组合物中；(iii)用于改善动物饲料的营养价值；(iv)用于增加动物食物中的可消化和/或可溶性蛋白；(ν)用于提高动物食物中蛋白质的水解程度；或(vi)用于蛋白质处理的用途。
13.动物饲料添加剂，其包含权利要求1-2中任一项定义的至少一种多肽；和(a)至少一种脂溶性维生素，和/或(b)至少一种水溶性维生素，和/或 (C)至少一种微量矿质。
14.粗蛋白含量为50至800g/kg的动物饲料组合物，其包含至少一种权利要求1-2中任一项定义的多肽，或者至少一种权利要求13的饲料添加剂。
15.包含权利要求1-2中任一项定义的至少一种多肽的组合物，其还同时包含至少一种选自淀粉酶、肌醇六磷酸酶、木聚糖酶、半乳聚糖酶、α-半乳糖苷酶、蛋白酶、磷脂酶、和 β-葡聚糖酶的其他酶。
16.权利要求1-2中任一项所定义的至少一种多肽在洗涤剂中的用途。
17.Nocardiopsis alba DSM 15647。
全文摘要
本发明涉及蛋白酶，具体的涉及与来自拟诺卡氏菌的蛋白酶同源的高特异活性蛋白酶，及其在野生型，和包括转基因植物和非人转基因动物的重组宿主细胞中的生产。蛋白酶在动物饲料和洗涤剂中是有效的。公开了与蛋白酶的高特异活性有关的特有结构特征，该蛋白酶属于肽酶家族S2A或S1E。
文档编号C12N9/58GK102505007SQ20111034442
公开日2012年6月20日 申请日期2004年6月21日 优先权日2003年6月19日
发明者卡斯滕.肖霍姆, 彼得.R.奥斯特加德, 索伦.F.拉森 申请人:诺维信公司