专利名称：副溶血弧菌的链置换恒温扩增(sda)快速检测试剂盒及其检测方法
技术领域：
本发明属生物检测领域，具体涉及恒温扩增快速检测副溶血性弧菌的试剂盒及检测方法。
背景技术：
副溶血性弧菌(Vibrio parahemolyticus)是一种嗜盐性细菌。副溶血性弧菌食物中毒，是进食含有该菌的食物所致，主要来自海产品，如墨鱼、海鱼、海虾、海蟹、海蜇，以及含盐分较高的腌制食品，如咸菜、腌肉等。本菌存活能力强，在抹布和砧板上能生存1个月以上，海水中可存活47天。临床上以急性起病、腹痛、呕吐、腹泻及水样便为主要症状。本病多在夏秋季发生于沿海地区，常造成集体发病。近年来由于海鲜空运，内地城市病例也渐
J·日夕O副溶血性弧菌现有的检测方法主要有常规分离鉴定法、普通PCR检测法、荧光定量PCR检测法、胶体金免疫层析试验法等。目前尚未见用链置换(SDA)恒温扩增技术快速、 准确地检测上述菌株的试剂盒及其检测方法的报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种副溶血性弧菌的恒温扩增快速检测试剂盒及其检测方法。本发明的另一目的是提供一种副溶血性弧菌的快速检测方法，以克服现有技术的不足，从而为食品安全提供科学的依据和指导作用。本发明提供的副溶血性弧菌的恒温扩增快速检测试剂盒，包括(1)模板预处理反应液IXNEB buffer 2，1. 0 μ M上游内引物Sl、l. 0 μ M下游内引物S2、3% (V/V) 二甲基亚砜、和ddH20。所述IXNEB buffer 2 为50mM NaClUOmM Tris-HClUOmM MgCl2、ImM 二硫苏糖醇、和 ddH20，pH 7. 9。所述引物Sl和S2分别如SEQ ID NO :1和2所示。(2)链置换扩增反应液I :3% (V/V) 二甲基亚砜，0. lmg/mL牛血清白蛋白，浓度分别为 0. 2mM 的 dATP、dGTP 和 dTTP，1. OmM dCTP α S，1 XNEB buffer 2，和 ddH20。(3) BstDNA 聚合酶；(4)限制性内切酶BsoBI。使用上述试剂盒检测副溶血性弧菌的方法，包括步骤(1)待检样品或细菌DNA的提取提取待检样品核酸，其中提取的样品DNA 0D26Q/0D28Q在1.6-2.0范围内，浓度在 IO-IOOng/μ L 范围内。(2)模板预处理程序
取模板预处理反应液23 μ L，加入待检DNA 2 μ L，放入94°C水浴5min后迅速放入 590C的水浴中4 ；然后94°C水浴2 和59°C水浴4 过程反复进行6个以上循环；产物用作SDA模板。(3) SDA扩增将上述预处理的25 μ L模板溶液加入24. 2 μ L链置换扩增反应液 I中，95°C水浴加热5min，温度迅速冷却到0°C，然后加入0. 4yL Bst DNA Polymerase与 0. 4yL BsoBI，置于59 °C水浴反应Ih。(4)核酸凝胶电泳检测反应结束后，在反应管中加入6XLoading buffer (组分30mM EDTA ；36% (ν/ν) Glycerol ；0. 05% (w/v)Xylene Cyanol FF ；0. 05% (w/v)Bromophenol Blue),自然冷却至室温，用1. 5%琼脂糖凝胶电泳检测产物，IOOV电泳40分钟，电泳成像系统拍照。电泳板上出现SObp的核酸扩增条带，说明待检样品为阳性，否则为阴性。本发明的试剂盒根据目标菌株的保守基因序列设计引物，保证检测方法的特异性。本发明采用改进的链置换扩增技术(SDA)技术，特异性强，具有与PCR检测方法相似灵敏度，但不需要昂贵的PCR仪，只需普通的水浴锅即可，检测方法简单、快速，特别适用于基层医疗机构及食品公司与相关检测部门。
图1:其中，1阴性对照2副溶血性弧菌样品3副溶血性弧菌阳性对照4 DNA Marker
具体实施例方式SDA(Strand displacement amplification)反应是一种恒温、酶控的体外核酸扩增技术，主要依据限制性内切酶识别并切割半硫代磷酸化DNA的未修饰链以形成一个切口，在具有链置换能力的DNA聚合酶的作用下从切口处聚合延伸并取代下游DNA链。被置换下的单链DNA再与引物结合并由DNA聚合酶延伸成双链DNA。这种“切口一扩增一置换” 不断循环往复达到靶序列高效扩增的目的。基于上述原理，本发明提供的副溶血性弧菌的恒温扩增快速检测试剂盒，包括(1)模板预处理反应液(所列试剂均为在模板预处理反应液中的浓度)包括 IXNEB buffer 2，1.0μΜ 上游内引物(Si)、1. O μ M 下游内引物(S2)、体积比 3% DMSO(二甲基亚砜)、和ddH20。所述IXNEB buffer 2 反应缓冲液成分为50mM NaClUOmM Tris-HClUOmM MgCl2UmM Dithiothreitol (二硫苏糖醇)、和 ddH20、pH 7.9。副溶血性弧菌引物Sl 5' -CGACGAAGATGGTAGCTAC- CrCGGG-ATTGACGGCTACTGGTGG "3' (SEQ ID NO 1)S2 5，-GTTCGCGAAATCTAATGTT- CrCGGG-CAACGCTGACGGATAACG _3，(SEQ IDNO 2)(注其中黑体部分为与副溶血性弧菌tlh基因片段匹配的序列)(2)链置换扩增反应液I 体积比3. O % DMSO, 0. lmg/mL BSA (牛血清白蛋白)，浓度分别为 0. 2mM 的 dATP、dGTP 和 dTTP，1. OmM dCTP α S (购自 BIOLOG 公司(德国)、2，_de oxyeytidine-5' -0-(1-thiotriphosphate)), 1 XNEB buffer 2, ddH20o(3) Bst DNA Polymerase (购自 NewEnglandBiolabsLTD、链延伸 DNA 聚合酶、 8000U/mL)(4) BsoBI (购自 NewEnglandBiolabsLTD、限制性内切酶 BsoBI、10000U/mL)使用上述试剂盒检测副溶血性弧菌的方法，包括步骤(1)待检样品或细菌DNA的提取提取待检样品核酸，其中提取的样品DNA OD260/OD280在1. 6-2. O范围内，浓度在 IO-IOOng/μ L 范围内。(2)模板预处理程序取模板预处理反应液23 μ L，加入待检DNA 2 μ L，放入94°C水浴5min后迅速放入 590C的水浴中4 ；然后94°C水浴2 和59°C水浴4 过程反复进行6个以上循环；产物用作SDA模板。(3) SDA扩增将上述预处理的25 μ L模板溶液加入24. 2 μ L链置换扩增反应液 I中，95°C水浴加热5min，温度迅速冷却到0°C，然后加入0. 4yL Bst DNA Polymerase与 0. 4yL BsoBI，置于59 °C水浴反应Ih。(4)核酸凝胶电泳检测反应结束后，在反应管中加入6XLoading buffer (组分30mM EDTA ；36% (ν/ν) Glycerol ；0. 05% (w/v)Xylene Cyanol FF ；0. 05% (w/v)Bromophenol Blue),自然冷却至室温，用1. 5%琼脂糖凝胶电泳检测产物，IOOV电泳40分钟，电泳成像系统拍照。电泳板上出现SObp的核酸扩增条带，说明待检样品为阳性，否则为阴性。下列实施例进一步说明本发明，但不应当作为本发明的限制。实施例(副溶血性弧菌的检测)(1)待检样品或细菌DNA的提取提取待检样品核酸，其中提取的样品DNA OD260/OD280在1. 6-2. O范围内，浓度在 IO-IOOng/μ L 范围内。(2)模板预处理程序取模板预处理反应液23 μ L，加入待检样品DNA 2 μ L，放入94°C水浴5min后迅速放入59°C的水浴中4 ；然后94°C水浴2 和59°C水浴4 过程反复进行6个以上循环； 产物用作SDA模板。取2份23 μ L的模板预处理反应液，分别加入2 μ L ddH20和副溶血性弧菌DNA，重复上述步骤，产物用作SDA模板，作为阴性对照和阳性对照；(3) SDA扩增将上述预处理的25 μ L模板溶液加入24. 2 μ L链置换扩增反应液 I中，95°C水浴加热5min，温度迅速冷却到0°C，然后加入0. 4yL Bst DNA Polymerase与 0. 4yL BsoBI，置于59 °C水浴反应Ih。(4)核酸凝胶电泳检测反应结束后，在反应管中加入6XL0ading buffer，自然冷却至室温，用琼脂糖凝胶电泳检测产物，电泳40分钟，电泳成像系统拍照。结果如图1所示。说明此检测方法特异性强，快速可靠，具有简单快速的特点。
权利要求
1.一种副溶血性弧菌的恒温扩增快速检测试剂盒，其特征在于包括(1)模板预处理反应液1XNEBbuffer 2，1. 0 μ M上游内引物Sl、l. 0 μ M下游内引物 S2,3% (V/V) 二甲基亚砜、和 ddH20 ；所述 IXNEB buffer 2 为50mM NaClUOmM Tris-HClUOmM MgCl2、ImM二硫苏糖醇、和 ddH20, pH 7. 9 ；所述引物Sl和S2分别如SEQ ID NO :1和2所示；(2)链置换扩增反应液I:3% (V/V) 二甲基亚砜，0. lmg/mL牛血清白蛋白，浓度分别为 0. 2mM 的 dATP、dGTP 和 dTTP，1. OmM dCTP α S，1 XNEB buffer 2，和 ddH20 ；(3)Bst DNA 聚合酶；(4)限制性内切酶BsoBI。
2.使用权利要求1所述的试剂盒检测副溶血性弧菌的方法，其特征在于包括步骤(1)待检样品或细菌DNA的提取提取待检样品核酸，其中提取的样品DNA OD26tZOD28tl在1. 6-2. 0范围内，浓度在 IO-IOOng/μ L 范围内；(2)模板预处理程序取模板预处理反应液23 μ L，加入待检DNA 2 μ L，放入94°C水浴5min后迅速放入59°C 的水浴中4 ；然后94°C水浴2 和59°C水浴4 过程反复进行6个以上循环；产物用作 SDA模板；(3)SDA扩增将上述预处理的25μ L模板溶液加入Μ.2μ L链置换扩增反应液I中， 95°C水浴加热5min，温度迅速冷却到0°C，然后加入0.4yL Bst DNA聚合酶与0.4yL BsoBI，置于59°C水浴反应Ih ；(4)核酸凝胶电泳检测反应结束后，琼脂糖凝胶电泳检测；电泳板上出现80bp的核酸扩增条带，说明待检样品为阳性，否则为阴性。
全文摘要
本发明涉及一种用依赖于链置换扩增技术的副溶血弧菌恒温扩增快速检测试剂盒及其检测方法。该试剂盒内有模板预处理反应液、链置换扩增反应液Ⅰ、Bst DNA Polymerase，BsoBI。检测副溶血弧菌的方法包括细菌DNA的提取、模板预处理、SDA链置换恒温扩增、核酸检测。其优点是快速、特异性强、灵敏度高而且成本低。
文档编号C12Q1/04GK102382883SQ20111034509
公开日2012年3月21日 申请日期2011年11月4日 优先权日2011年11月4日
发明者宋涛, 尼秀媚, 布岩, 张京宣, 张成标, 彭青, 李伟涛, 毕建秀, 雷质文, 魏晓棠 申请人:山东出入境检验检疫局检验检疫技术中心