专利名称：胚胎肾脏的体外器官培养方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，涉及哺乳动物的胚胎肾脏的体外器官培养方法，特别是小鼠胚胎期肾脏的离体器官培养。
背景技术：
体外器官培养属于组织培养的一种高级形式，它能再现器官的发育过程，模拟器官在不同状态及条件下的功能状态，是是了解器官发育过程，研究疾病致病机制及药物筛选的重要技术手段。目前肾脏体外器官培养目前有由Mxen L等于1966年发表于杂志 InternationalJournal of Cancer _t Cell contact and cell adhesion during tissue organization 1966May 15 ； 1 (3) :271-90. —文中，他们利用 3. 5cm 培养皿，放入 2ml 培养基，将孔径5um左右的聚碳酸脂滤膜漂在培养基上或者用不锈钢网做支架支撑。然后将小鼠胚胎肾脏放置于滤膜上，置于气液交界处培养(参见附图1、图幻。最新的是2010 年，Jamie A. Davies 在杂志 PLoSOne 中发表的 A novel, low-volume method for organ culture of embryonic kidneys thatallows development of cortico-medullary anatomical organization 2010Mayl0 ；5 (5) :el0550. 一文提出了小体积培养方法。同样是利用3. 5cm培养皿，改进之处在于利用孔底面积1平方厘米的硅胶圈和22mmX22mm的玻璃片组装培养孔，将胚胎肾脏直接培养在玻璃片上，加入85ul体积培养基培养，硅胶圈和培养皿之间的空隙用带抗生素的磷酸盐缓冲液填充维持培养皿湿度(参见附图3、图4)。但是上述两种方法均受到使用需要使用特殊材料和占用较大空间限制，另外也未考虑到培养基体积和成分变化对肾脏培养产生的影响，阻碍了胚胎肾脏的体外器官培养技术的大规模应用以及其在药物筛选中的运用。
发明内容
本发明要解决的技术问题主要是现有培养方法需要特殊材料和占用空间大的缺陷。本发明解决技术问题提供的技术方案是提供一种哺乳动物胚胎肾脏的体外器官培养方法。该方法包括以下步骤a、在多孔培养板的培养孔中放入尺寸与之适配的承载片，在培养孔底部构建出培养空间；b、将取得的哺乳动物胚胎肾脏放置于承载片上，加入培养基，使肾脏处于培养基和空气的液-气交界处；c、37°C培养箱中培养，然后每1到2天进行培养基换液。其中，上述方法步骤a所述的多孔培养板为M孔培养板。其中，上述方法中在在使用的多孔培养板的各孔间隙加入湿度平衡液，以减缓培养基挥发。
其中，上述方法步骤b中加入培养基后调整承载片于培养孔的底部的中心，哺乳动物胚胎肾脏或胚胎肾脏原基位于承载片的中部。其中，上述方法c步骤中所述的培养基采用半量递增的方式换液，即每次换液时保留上次培养基体积的一半在原培养孔中，然后将比上次培养基体积的一半按体积分数还多增加6% -12%的新鲜培养基加入培养孔。进行10天培养时，第1-2天按上次培养基体积的一半加入，第9-10天按上次培养基体积的一半加入最佳。其中，上述方法步骤a中所述的承载片为透明玻璃圆片。其中，上述方法中所述湿度平衡液为无菌的磷酸盐缓冲液或蒸馏水。其中，上述方法中所述胚胎肾脏为分离的胚胎期10 13天的小鼠肾脏原基。其中，上述方法中所述的肾脏放置方式为将肾脏平放。即输尿管走向面与承载片平面平行的方式放置于承载片上。本发明方法的有益效果在于使用本发明方法进行胚胎肾脏的体外器官培养无需昂贵进口滤膜或者硅胶圈等进口材料，成本大大降低；克服了目前所有方法的占用空间大缺点，使用本发明放在运用利用M孔培养板可以将每个肾脏培养时的占用面积由38. 5平方厘米减少到1. 5平方厘米左右，大大提高了空间利用率；具有培养基用量少的优点，利用 M孔培养板时每孔只需150ul左右的培养基培养即可；体系组装简单，操作便捷，只需将处理好的承载片放入培养孔，放置胚胎肾脏，加入培养基培养即可，简单易行且污染环节大大减少，有利于培养成功率的提高；培养结果良好，胚胎肾脏的培养时间能到10天以上，可提高到12天，并可见输尿管平滑肌自主性收缩；使用承载片培养导致后续操作方便，可进行原位杂交，免疫荧光等后继实验操作操作。本发明方法还另外提供了一种优选的培养基后继换液方案，使培养效果更好，体外器官发育更加稳定。本发明方法能大量低成本地获得稳定发育且便于后继操作的体外培养肾脏器官，还能满足大规模药物筛选的需求。
图1、传统的胚胎肾脏体外器官培养两种方法的体系示意图之一。1、培养基；2、聚碳酸脂滤膜；3、.胚胎肾脏原基；4、不锈钢网支架。图2、传统的胚胎肾脏体外器官培养两种方法的体系示意图之二。1、培养基；2、聚碳酸脂滤膜；3、.胚胎肾脏原基；4、不锈钢网支架。图3、已报导的小体积胚胎肾脏体外器官培养体系(培养皿)示意图，示纵剖面。
1、培养基；2、硅胶圈；3、胚胎肾脏原基；4、22mmX22mm玻璃片；5、1XPBS。图4、已报导的小体积胚胎肾脏体外器官培养体系(培养皿)示意图，俯视。1、培养基；2、硅胶圈；3、胚胎肾脏原基；4、22mmX22mm玻璃片；5、1X PBS。图5、本发明的培养方法采用的胚胎肾脏体外器官体系示意图。1、培养基；2、承载片；3、胚胎肾脏；4、培养孔；5、湿度平衡液，6M孔培养板。图6.本发明的承载片-多孔平板法的胚胎肾脏体外器官培养装置1.培养基；
2.承载片；3.胚胎肾脏；图7.本发明的承载片-多孔平板法的胚胎肾脏体外器官培养装置1.培养基； 2.承载片；3.胚胎肾脏；
图8、本发明的培养方法使用M孔板时，优化的培养基换液体积方案。图9、本发明方法胚胎肾体外培养效果及原位杂交和免疫荧光检测。图中第一、二排显示的是小鼠胚胎期12. 5天的肾脏进行培养十天的效果图，能看得见明显的输尿管分支及肾单位各阶段前体结果的形成。培养效果良好，并可见输尿管自主性收缩。第三排为分别用原位杂交(in situ)和免疫荧光检测肾单位标志物PAX8和输尿管及远端小管标志物E-cadherin 型钙粘附蛋白)的表达，黑色和白色分别显示阳性信号，实验结果证明了本发明方法培养的肾脏发育良好，可应用于多种方式检测。图10、用现有方法培养了 10天后免疫荧光检测的结果，示输尿管(来源于Jamie A. Davies 在杂志 PLoS One 中发表的 A novel, low-volume method for organ culture of embryonickidneys that allows development of cortico—medullary anatomical organization 20IOMay 10 ；5 (5) :el0550.)，本发明方法6天培养的结果就和其10天的培
养结果基本一致。图11、用本发明方法培养得到的体外培养胚胎肾脏的SiRNA转染效果图。该图显示用EGFP绿色荧光转基因小鼠胚胎期10. 5和11. 5天取出的肾脏转染CY5红色荧光标记的siRNA效果图，第一列为镜下肾脏形态图，第二列为绿色荧光表达图，第三列为红色荧光图，两张图显示了绝大部分细胞转染进了 siRNA。
具体实施例方式以下结合附图通过具体实施方式
，对本发明进行详细说明。本发明提供了一种胚胎肾脏的体外器官培养方法，包括以下步骤a、在多孔培养板的培养孔中放入尺寸与之适配的承载片，在培养孔底部构建出培养空间；b、将取得的哺乳动物胚胎肾脏或胚胎肾脏原基放置于承载片上，加入培养基，使肾脏处于培养基和空气的气液交界面，仅有一层薄液膜覆盖在上面，这与现有技术的常规方法一致；即使肾脏上表面有一层液膜，不是完全裸露于空气中。c、37°C培养箱中培养，然后每天进行培养基换液。本发明方法步骤a所述的多孔培养板为M孔培养板。本发明方法在使用的多孔培养板的各孔间隙加入湿度平衡液，以减缓培养基挥发。本发明方法步骤b中加入培养基后调整承载片于培养孔的底部的中心，哺乳动物胚胎肾脏或胚胎肾脏原基位于承载片的中部。本发明方法c步骤中所述的培养基采用半量递增的方式换液，即每次换液时保留上次培养基体积的一半在原培养孔中，然后将比上次培养基体积的一半还按体积分数多增加6% -12%的新鲜培养基加入培养孔。优选的，第1-2天按上次培养基体积的一半加入；进行10天培养时，第9-10天按上次培养基体积的一半加入最佳。本发明方法步骤a中所述的承载片可为透明玻璃片。承载片尺寸应小于孔径大小，大小为培养孔的50-80%大小，形状匹配。最好与培养孔一样为圆形的透明玻璃圆片。 承载片一般应贴在底部。
本发明方法中所述湿度平衡液为无菌的磷酸盐缓冲液或蒸馏水。本发明方法中所述胚胎肾脏为分离的胚胎期10 13天的小鼠肾脏原基。本发明方法中所述的肾脏放置方式为将肾脏原基平放，即横切面放置于承载片上。当然，在本领域中，本发明方法中使用的各种试剂和材料，都应为无菌的，操作也应在无菌条件下进行。本发明方法使用的承载片可以是各种材质的适于组织细胞培养的薄片，最常用和最优的是透明玻璃圆片。承载片使用前应进行充分的清洗和灭菌处理，在需要的情况下，可以用合适的基质预处理，如多聚赖氨酸，明胶或者胶原等。本发明方法中使用的多孔培养板可以是常规的能应用于细胞组织培养的普通M 孔板，其孔最好是底面积在1 3平方厘米的平底圆孔。最常见的是标准的M孔平底细胞培养板，材质是玻璃或者塑料均可。本发明方法中使用的湿度平衡液必须无菌，无毒。最好用无菌的磷酸盐缓冲液或蒸馏水，根据使用多孔培养板确定用量，一般的标准M孔平底细胞培养板使用的湿度平衡液体积应大于200ul，最好是500ul。本发明方法中使用的胚胎肾脏一般为实验用的小鼠的胚胎。实验小鼠胚胎肾脏可以为胚胎期10 13天的肾脏原基(肾脏原基是本领域就发育早期的胚胎肾脏的一种通用叫法)。而每个承载片上可放置1 4个胚胎肾脏，即1个孔中最多可培养4个小鼠胚胎肾脏。胚胎肾脏最好平放，即按横切面水平放置于承载片上以便肾脏原基能发育成形态良好的肾脏。在实际操作过程中，只要输尿管还在，放下去就是平放的。本发明方法中使用培养基可为本领域通用的各种细胞培养基，比如dulbecco’ s modifiedeagle，s medium (DMEM，通用的培养基，如商家hvitrogen货号11965的产品，或也可参考网上公开的http //baike. baidu. com/view/3501452. htm 记载的 DMEM(H)细胞培养基(粉末型)成分配制)或者fegle，s minimal essential medium(EMEM，通用的培养基，配方公知。然后在选择的培养基中加入体积分数为5-20%的FBS(胎牛血清)或者 F12营养因子anvitrogen公司产品，品名营养因子混合物，货号21700)，一般还可添加按终度0. lmg/ml添加抗生素penicillin或str印tomycin(青霉素或链霉素)防止污染。本发明方法中的培养条件为通用细胞培养条件。一般温度为36°C 38°C;最好在 37°C下，体积分数为5%二氧化碳的环境中培养。本发明方法中使用的培养基可每隔M 48小时，去掉旧培养基并加入等体积新培养基继续培养。还可以采用的优选的换液方式是采用半量递增的方式换液，即每次换液时保留上次培养基体积的一半在原培养孔中，然后将比上次培养基体积的一半还按体积分数多增加 6% -12%的新鲜培养基加入培养孔。若用标准M孔平底细胞培养板时，标准的M孔平底细胞培养板时，培养基体积可用每孔130-170ul，最佳的体积应为每孔150ul。那么是换液时将比上次培养基体积的一半多2 IOul的新鲜培养基加入培养孔。优选5 10ul，最佳为 8ul。实施例一使用本发明方法培养Balb/c小鼠胚胎期11. 5天肾脏。1、准备承载片用直径12mm的玻璃圆盖片作为承载片，购买于海门市华凯实验玻璃仪器有限公司。首先，用蒸馏水配制体积分数为的盐酸溶液，在室温摇动清洗圆盖片一个小时。用蒸馏水清洗后，放入体积分数为70%的酒精溶液中，摇动清洗过夜。用IOcm 玻璃平皿盛放清洗后的圆盖片，浙干液体后放入高温蒸汽灭菌锅内，121°C灭菌20分钟。烘干后置于超净工作台备用。2、组装培养装置用无菌的镊子夹取处理好的圆盖片放置于无菌的M孔培养板的培养孔中中。无菌的M孔培养板为购置于Costar (康宁公司，美国)的35M型组织培养板。3、获得胚胎期11. 5天小鼠肾脏以受孕Balb/c母鼠，来源于四川大学华西医院基因工程小鼠中心SPF级(无特殊病原菌)动物房，阴道见栓当天为0. 5天开始计算胚胎发育时间，在第11. 5天从动物饲养房取出孕鼠。引颈法处死孕鼠后，用酒精消毒孕鼠及解剖器械。取出小鼠胚胎后于冰上预冷的解剖液(IX PBS，HBSS或者DMEM)中解剖，体视镜下取出肾脏原基，用200ul吸头转移到装有培养基(DMEM+10% FBS) 1. 5ml的EP管中。4、在超净工作台内，用200ul的移液器转移肾脏原基到培养孔，每孔一个。用移液器吸走培养孔中残余培养基并加入150ul培养基。用酒精灯高温灭菌尖镊子，待冷后移动轻轻移动肾脏原基至园盖片中部，并调整园盖片位置使得肾脏原基位于培养孔正中。培养体系的构建参见图5、图6、图7的示意图。5、小心将种好的肾脏放置于细胞培养箱于37°C，5% CO2中培养M小时。6、用移液器将培养孔中培养基全部转移至对应换液孔，再用移液器回吸75ul培养基到培养孔，并丢弃剩余培养基。7、加入75+5ul的新鲜培养基到培养孔，混勻后于细胞培养箱中培养M小时。8、然后同步骤6和7进行半量递增换液留SOul原培养基+SOul新培养基。9、每隔M小时换液。换液体积方案如图8所示。10、培养10天效果(附图9)。图9中第一、二排显示的是小鼠胚胎期12. 5天的肾脏进行培养十天中每天的情况，能看得见明显的输尿管分支及肾单位各阶段前体结果的形成，并可第七、八天开始出现输尿管平滑肌自主性收缩，说明了输尿管感受到液体刺激进行排尿，和生理状况一样，说明培养肾脏接近体内情况，有部分生理功能。而且的输尿管分支和肾单位还能充分的形成，如图9的136小时可见输尿管分支很充分，另免疫荧光结果显示的输尿管分支也很充分，结果与最新报道的培养方法的十天的结果(图10)相似，质量相近。第三排为分别用原位杂交和免疫荧光检测肾单位标志物PAX8和输尿管及远端小管标志物E-cadherin的表达，黑色和白色分别显示阳性信号，实验结果证明了本发明方法培养的肾脏发育良好，可应用于多种方式检测。经多次试验，利用上述方法使用E12. 5天的肾脏进行体外培养几乎是100%成功率，而Ell. 5天则有75%左右的成功率，一个孔可培养培养1个到4个肾脏，一般采用1个孔1个的方式，24孔平板所有孔用完至少可培养M个，最佳是使用8个内圈的孔进行培养。 24孔板(13cmX8. 5cmX2. 5cm养M个即约11立方厘米空间1个肾脏，而现有技术最小是一般3. 5cmX3. 5cmX2. 5cm养一个，即 31立方厘米空间1个肾脏，另外本方案M个肾脏在一起可联系同环境同时操作，生长一致性更好，也更便于实现大规模药物筛选。实施例二本发明培养方法得到的胚胎肾脏的转染
1、准备承载片直径12mm的玻璃圆盖片作承载片，购买于海门市华凯实验玻璃仪器有限公司。首先，用蒸馏水配制体积分数为的盐酸溶液，在室温摇动清洗圆盖片一个小时。用蒸馏水清洗后，放入体积分数为70%的酒精溶液中，摇动清洗过夜。用IOcm玻璃平皿盛放清洗后的圆盖片，浙干液体后放入高温蒸汽灭菌锅内，121°C灭菌20分钟。烘干后置于超净工作台备用。2、组装培养装置用无菌的镊子夹取处理好的圆盖片放置于无菌的M孔培养板中。无菌的M孔培养板为购置于Costar公司的35M型号组织培养板。3、获得胚胎期11. 5天小鼠肾脏以EGFP转基因母鼠(需要简要说明该鼠的来源。(增强的绿色荧光蛋白EGFP转基因小鼠由美国The Jackson Laboratory构建，货号 003115)阴道见栓当天为0.5天开始计算胚胎发育时间，在第11. 5天从动物饲养房取出孕鼠。引颈法处死孕鼠后，用酒精消毒孕鼠及解剖器械。取出小鼠胚胎后于冰上预冷的解剖液(IX PBS, HBSS或者DMEM)中解剖，体视镜下取出肾脏原基，用200ul吸头转移到装有培养基(DMEM+10% FBS) 1. 5ml 的 EP 管中。4、用49ul培养基转移肾脏到200ul PCR管中，在避强光环境下加入Iul 20umol/ L修饰后的Cy5-siRNA(siRNA序列为GCUCUUACGAUGAUA，由广州锐博生物合成并提供商品化修饰)。于细胞培养箱中培养6小时。5、在超净工作台内，用200ul的移液器转移肾脏原基到培养孔，每孔一个。用移液器吸走残余培养基并加入150ul培养基。用酒精灯高温灭菌尖镊子，待冷后移动轻轻移动肾脏原基至园盖片中部，并调整园盖片位置使得肾脏原基位于培养孔正中。6、小心将种好的肾脏放置于细胞培养箱于37°C，5% CO2中培养1天后，用倒置荧光显微镜观察并拍照，可检测很高的转染效率。效果见图11。
权利要求
1.哺乳动物胚胎肾脏的体外器官培养方法，其特征在于包括以下步骤a、在多孔培养板的培养孔中放入尺寸与之适配的承载片，在培养孔底部构建出培养空间；b、将取得的哺乳动物胚胎肾脏放置于承载片上，加入培养基，使肾脏处于培养基和空气的气-液交界处；c、36°C 38°C培养箱中培养，然后每1到2天进行培养基换液。
2.根据权利要求1所述的哺乳动物胚胎肾脏的体外器官培养方法，其特征在于步骤a 所述的多孔培养板为M孔培养板。
3.根据权利要求1所述的哺乳动物胚胎肾脏的体外器官培养方法，其特征在于在使用多孔培养板的各孔间隙加入湿度平衡液，以减缓培养基挥发。
4.根据权利要求1所述的哺乳动物胚胎肾脏的体外器官培养方法，其特征在于步骤 b中加入培养基后调整承载片于培养孔的底部的中心，哺乳动物胚胎肾脏位于承载片的中部。
5.根据权利要求1所述的哺乳动物胚胎肾脏的体外器官培养方法，其特征在于步骤c 中所述的培养基采用半量递增的方式换液，即每次换液时保留上次培养基体积的一半在原培养孔中，然后将比上次培养基体积的一半按体积分数还多增加6%-12%的新鲜培养基加入培养孔。
6.根据权利要求1所述的哺乳动物胚胎肾脏的体外器官培养方法，其特征在于步骤a 所述的承载片为透明玻璃圆片。
7.根据权利要求1所述的哺乳动物胚胎肾脏的体外器官培养方法，其特征在于所述湿度平衡液为无菌的磷酸盐缓冲液或蒸馏水。
8.根据权利要求1所述的哺乳动物胚胎肾脏的体外器官培养方法，其特征在于所述胚胎肾脏为分离的胚胎期10 13天的小鼠肾脏原基。
9.根据权利要求1所述的哺乳动物胚胎肾脏的体外器官培养方法，其特征在于将肾脏平放。
全文摘要
本发明属于生物技术领域，涉及哺乳动物的胚胎肾脏的体外器官培养方法，特别是小鼠胚胎期肾脏的离体器官培养。本发明要解决的技术问题主要是现有培养方法需要特殊材料和占用空间大的缺陷。本发明技术方案是胚胎肾脏的体外器官培养方法，包括以下步骤a、在多孔培养板的培养孔中放入尺寸与之适配的承载片，在培养孔底部构建出培养空间；b、将取得的哺乳动物胚胎肾脏或胚胎肾脏原基放置于承载片上，加入培养基，使肾脏处于培养基和空气的交界处；c、37℃培养箱中培养，然后每1到2天进行培养基换液。使用本发明方法能大量低成本地获得稳定发育且便于后继操作的体外培养肾脏器官，还能满足大规模药物筛选的需求。
文档编号C12N5/073GK102391983SQ20111034524
公开日2012年3月28日 申请日期2011年11月4日 优先权日2011年11月4日
发明者吕小岩, 周钦, 孙环, 陈铁林, 魏于全 申请人:四川大学华西医院