专利名称：甘蔗锈病检测用引物及其检测方法
技术领域：
本发明涉及一种甘蔗锈病检测用引物及其检测方法。
背景技术：
甘蔗锈病是由真菌引起的一种甘蔗病害，该病害在爪哇、加勒比海地区(古巴、牙买加等)、澳大利亚、美国、墨西哥、印度、泰国和非洲的毛里求斯等国家已普遍发生，常造成巨大的经济损失。目前，由于引种频繁、品种单一、植期多样化及不良气候的影响下，甘蔗锈病已扩散到我国的多个甘蔗主要种植区如广西、云南、福建、四川、江西及广东等地区。因此，加强甘蔗锈病的早期检测，及时割除发病严重的病叶，对减少该病的扩散传播具有重要的意义。长期以来，甘蔗锈病的检测主要依赖田间症状观察和室内显微镜或电镜观察予以证实，这些检测方法不仅耗时费工，而且其结果的准确性和可信度也在很大程度上取决于研究人员的技术水平和经验，难以满足快速、高通量诊断检测的实际需求。因此，有必要利用现代生物技术，研发简单易行、灵敏准确的甘蔗锈病快速诊断和检测技术。本发明根据甘蔗锈病基因组序列，设计用于PCR检测的特异性引物，通过对反应体系和反应的退火温度的优化，建立了甘蔗锈病PCR检测方法，反应结束后即可根据特异性扩增片段的位置判定样品中是否为甘蔗锈病。
发明内容
本发明的目的在于提供用于甘蔗锈病PCR检测的弓I物序列及其检测方法。本发明通过分析已报道的甘蔗锈病基因组序列，设计引物。所述的引物对由正向和反向引物组成，其核苷酸序列如序列表PM1&PM2所示。本发明还进一步给出了应用上述引物的PCR检测方法，该方法以样品总DNA为模板，进行PCR扩增，反应结束后根据特异性扩增的59!3bp DNA片段判定结果。PCR扩增过程如下在PCR 管里力卩入 JXiTaq PCR MasterMix 6. Oul，PMl QOumol/L) l.Oul， PM2(20umol/l) 1. Oul，DNA模板1. Oul，灭菌ddH20 16ul，加完后短速离心8 10秒后放进 PCR 仪，94°C预变性 5min ；94°C变性 lmin，53°C退火 50s，72°C延伸 Imin, 34 个循环；72°C延伸5min，4°C保存。本发明根据甘蔗锈病基因组序列设计引物，用于甘蔗锈病的PCR检测，本发明的检测方法，引物特异性好，检测方法快速、准确、灵敏、可用于大量甘蔗样品的检测，有效克服了田间症状观察、室内显微镜或电镜观察等现有检测方法的缺点
图1是甘蔗锈病PCR方法特异性检测结果。1-2为甘蔗锈病的检测结果，3为甘蔗梢腐病的检测结果，4为甘蔗黑穗病的检测结果，5为健康甘蔗叶片的检测结果。
图2是甘蔗锈病PCR检测方法的灵敏度结果。1-6的稀释梯度依次为1ο—1，10_2， ο-3, ο-4, ο-5 和 ιοΛ
具体实施例方式下面实施例子用于对本发明的进一步说明，但不用来限制本发明的范围。实施例1引物的设计和合成根据GenBank数据库中已报道的甘蔗锈病基因组序列(序列登录号JN035303)设计了扩增甘蔗锈病的特异性引物ΡΜ1/ΡΜ2，扩增的目的片段大小为59!3bp，引物序列如下PMl :5，-ATCATCTGTGGGTCAAAC-3，PM2 5，-AATAAAGCCAGAGTAAGC-3，实施例2甘蔗叶组织总DNA抽提(1)称取0. 5g具有明显甘蔗锈病症状的叶片放入研钵中，加适量液氮研磨至粉状后转至2ml离心管中；(2)在装有研磨物的离心管中加入600ul 65°C预热的CTAB抽提液，倒置混勻后放入65°C恒温浴锅中温育》ir，中间每隔20min颠倒离心管数次；(3)取出装有研磨物和CTAB抽提液的离心管置_20°C冷却^iin ；(4)加入 600ul 氯仿异戊醇(24 1)，充分混勻，12000rpm/min 离心 IOmin ；(5)取上清液加入2/3体积(340ul)的异丙醇，轻轻混勻；_20°C放置过夜；(6)室温下 12000rpm/min 离心 IOmin ；(7)弃上清，沉淀用70%乙醇和无水乙醇洗涤2次。(8)沉淀用200ul灭菌去离子水溶解，加入lulRNaseA，37°C水浴30min。(9)加入 400ul 预冷的无水乙醇，-20°C放置 30min，12000rpm 离心 lOmin。(10)弃上清，沉淀用70%乙醇洗涤沉淀2次，室温风干。沉淀用20ul灭菌去离子水溶解，_20°C保存备用。实施例3 PCR扩增方法的建立以总DNA为模板，进行PCR反应。25ul反应体系进行PCR反应，即在200ul的PCR反应管里加入2XTaq PCR MasterMix 6. Oul, PMl (20umol/L) 1. Oul, PM2 (20umol/l) 1. Oul, DNA模板1. Oul，灭菌ddH20 16ul，加完后短速离心8 10秒后放进PCR仪，94°C预变性 5min ；94°C变性 lmin，53°C退火 50s，72°C延伸 lmin，;34 个循环；72°C延伸 5min，4°C保存。
实施例4甘蔗锈病PCR的特异性确定以表现症状的甘蔗叶片总DNA为模板，以甘蔗梢腐病、甘蔗黑穗病、健康叶片为对照，通过PCR进行扩增，反应结束后根据特异性扩增的59!3bp DNA片段判定结果。实验结果以表现症状的甘蔗叶片总DNA为模板，通过PCR检测可观察到593bp的扩增片段， 而甘蔗梢腐病、甘蔗黑穗病、健康叶片则均没有特异性扩增条带的出现，说明建立的PCR方法对甘蔗锈病具有良好的特异性。结果见图一。实施例5甘蔗锈病PCR方法的灵敏度确定从0. 5g发病叶片中提取总DNA，20ul灭菌去离子水溶解总DNA后，用双蒸水10倍系列稀释甘蔗锈病模板DNA，进行相对灵敏度检测。检测结果如图二所示。表明建立的PCR方法可从稀释到10_5的DNA中成功检测出甘蔗锈病。具有较高的灵敏度，符合检测要求。
本发明的检测方法，引物特异性好，检测方法快速、准确、灵敏、可用于大量甘蔗样品的检测，有效克服了田间症状观察、室内显微镜或电镜观察等现有检测方法的缺点核苷酸序列表
<110>云南省农业科学院甘蔗研究所
<120>甘蔗锈病检测用引物及其检测方法
<160>2
<210>1
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<400>1
ATCATCTGTGGGTCAAAC 18
<210>2
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<400>2
AATAAAGCCAGAGTAAGC 18
权利要求
1.一种甘蔗锈病检测用引物，其特征在于由正向引物和反向引物组成，正向引物的核苷酸序列为PMl :5’ -ATCATCTGTGGGTCAAAC-3，， 反向引物的核苷酸序列为 PM2 :5’ -AATAAAGCCAGAGTA AGC-3，， 目的条带大小为59!3bp。
2.一种采用权利要求1所述甘蔗锈病检测用引物的检测方法，其特征在于步骤如下 (1)以样品总DNA为模板，利用权利要求1所述的PMl和PM2引物对进行PCR扩增，(2)反应结束后根据特异性扩增DNA片段的位置判定结果。
3.如权利要求2所述的检测方法，其特征在于PCR反应中PCR扩增的过程如下在PCR 管里加入2XTaq PCR MasterMix 6. Oul, PMl (20umol/L) 1. 0ul,PM2 (20umol/l) 1. Oul, DNA模板1. Oul,灭菌ddH20 16ul，加完后短速离心8 10秒后放进PCR仪，94°C预变性 5min ；94°C变性 lmin，53°C退火 50s, 72°C延伸 lmin, 34 个循环；72°C延伸 5min，4°C保存。
全文摘要
本发明提供了一种甘蔗锈病检测用引物及其检测方法，所述引物的核苷酸序列如序列表PM1&PM2所示。本发明还进一步提供了检测甘蔗锈病的方法，该方法以样品总DNA为模板，利用上述引物进行PCR扩增，反应结束后根据特异性扩增片段的位置判定结果。本发明能有效克服田间症状观察、室内显微镜或电镜观察等现有检测方法的缺点，快速、准确、特异、灵敏的检测甘蔗锈病，可用于大规模甘蔗锈病的PCR检测。
文档编号C12Q1/68GK102367481SQ201110349220
公开日2012年3月7日 申请日期2011年11月8日 优先权日2011年11月8日
发明者尹炯, 李文凤, 王晓燕, 罗志明, 黄应昆 申请人:云南省农业科学院甘蔗研究所