专利名称：巨大芽孢杆菌ala2细胞色素p450酶基因及其重组质粒的构建及酶的纯化方法
技术领域：
本发明属于分子生物学技术领域，涉及一种编码巨大芽孢杆菌细胞色素P450酶基因及其重组质粒的构建方法，以及克隆、定点突变及其高效表达纯化方法。具体涉及对原始巨大芽孢杆菌的细胞色素P450酶基因进行生物信息学分析和基因的定向改造，以及重组酶的制备。
背景技术：
细胞色素P450 (cytochrome P450或CYP)为一类亚铁血红素一硫醇盐蛋白的超家族，它参与内源性物质和包括药物、环境化合物在内的外源性物质的代谢。细胞色素 P450酶分布广泛，至今已在各种动物、植物、真菌和细菌中都发现有其存在。(Estabrook R W, 1996, FASEB J, 10:202-204)
细胞色素P450酶基因多样性决定了其结构多样性和功能多样性。细胞色素P450酶的功能不仅降解化合物以获得碳源，而且还解毒外源化合物以及合成具生物学活性的化合物如甾醇、前列腺素和花生四烯酸酯代谢物。细胞色素P450酶也被用于基因治疗以补偿重要代谢途径缺损。另外，细胞色素P450酶可被用于使立体和位置选择性的化合物加单氧化作用以产生重要的生物活性(冷欣夫等，细胞色素P450酶系的结构功能与应用前景，2001)。 细胞色素P450酶有如此多样的功能作用，体现出其生物学的重要性，可以预见细胞色素 P450酶的应用具有广阔的前景。通过调控其表达和活性，可望改变生物体内物质的代谢途径，改变产物的性质和数量。随着现代生物技术如基因工程技术的发展，人们可以操纵细胞色素P450酶基因的结构及其表达过程，由此改变细胞色素P450酶的活性，甚至构建具有天然细胞色素P450酶不具备的新活性。在细菌细胞色素P450酶中，P450-BM3又称CYP102A1，能催化中长链脂肪酸的末端羟基化，它能够快速催化链长大约C12-C20的饱和或不饱和脂肪酸的单加氧酶活性(Urlacher V B, Appl Microbiol Biotechnol 64(2004) :317-325)0 巨大芽孢杆菌 {Bacillus megaterium)是细胞色素P450酶的高产菌株，其中巨大芽孢杆菌ALA2菌株所产生的细胞色素P450酶具有对不饱和脂肪酸超强的氧化催化能力(Hilker et al., 2007, Progress in Lipid Research 47(2008) : 1_14)。但是，通过营养条件和培养条件的优化， 巨大芽孢杆菌ALA2菌株所产的细胞色素P450酶不能满足工业上的需要，而且成本较高。 研究表明，对细胞色素P450酶的基因进行克隆、改造和重组表达被认为可以从根本上显著提高细胞色素P450酶性质的最有效方法(Daniel A et al. , Biotechnology J, 88(2001)167-171)。到目前为止，在GenBank和DDJB数据库中虽然已有其他巨大芽孢杆菌细胞色素P450酶基因序列被报道，国内外也有实现了细胞色素P450酶基因在大肠杆菌中表达的研究报道，但均未进行该基因的超量表达的研究。大肠杆菌是目前应用最广泛，最成功的表达体系，常做高效表达的首选体系。其遗传背景清楚，技术操作简单，培养条件简单，大规模发酵经济倍受遗传工程专家的重视。研究表明，外源蛋白在大肠杆菌中表达的差异主要由表达系统的选择及外源基因本身的特性决定。到目前为止，对巨大芽孢杆菌ALA2菌株细胞色素P450酶基因进行定向改造以及该重组酶的高效表达在国内外还未见研究报道。
发明内容
解决的技术问题本发明的目的是提供巨大芽孢杆菌ALA2细胞色素P450酶基因及其重组质粒的构建及酶的纯化方法，本发明大幅度提高了巨大芽孢杆菌ALA2菌株的细胞色素P450酶的重组表达水平，获得能在大肠杆菌中超量表达的巨大芽孢杆菌ALA2菌株的细胞色素P450酶基因cypl及其重组质粒，及其重组酶的纯化方法。技术方案编码巨大芽孢杆菌ALA2细胞色素P450酶基因，该基因的核苷酸序列 cypl 拟 SEQ ID NO. 1 所述。包含上述核苷酸序列的重组质粒。 包含上述核苷酸序列的重组质粒pTrC99A-c_F/7/。包含上述核苷酸序列的重组质粒pTrC99A-Cj^/的制备方法，构建步骤为将获得的基因cyp和pTrc99A用内切酶Nco I和BamH I酶切，连接构建重组质粒pTrc99A-c_F/7， 通过一步反向PCR对第269位苏氨酸进行定点随机突变，经磷酸化后连接，获得重组质粒含有上述重组质粒pTrc99A-cj^/的宿主细胞为大肠杆菌T0P10。巨大芽孢杆菌ALA2细胞色素P450酶的纯化方法，挑取含重组质粒pTrc99A-cj^/ 的大肠杆菌摇菌培养；当培养至0D_达到0.6-0. 8，用终浓度0.5 mM IPTG诱导6_8 h ；离心收集菌体并洗涤；用镍柱纯化向洗涤后的菌体中加入IXBinding Buffer重悬菌体，超声破碎菌液后离心，然后取离心液上样，再用IXBinding Buffer洗柱子除去未结合的蛋白质，最后用含有80 mM咪唑的洗脱液洗脱，即得目标蛋白。具体方案内容为
包括原始基因的克隆、基因的分析和定向改造以及重组酶的制备。1.参照Genebank上已发表的巨大芽孢杆菌细胞色素P450酶基因序列(登录号为Genbank: J04832. 1)设计引物，以提取的巨大芽孢杆菌ALA2菌株的基因组DNA为模板进行PCR，获得目的基因，并将基因克隆到PMD-19T载体，得到重组载体pMD19T-cj^，再以克隆得到的重组载体为模板，通过PCR扩增获得的基因克隆到大肠杆菌表达载体pET-20b和 pTrc99A，得到重组质粒pET20b-c_F/7和pTrc99A_c双，转化大肠杆菌诱导表达后酶活分别达到 200 U/mL禾口 770 U/mL (具体见实施例1)。2.通过对巨大芽孢杆菌细胞色素P450酶蛋白的氨基酸序列进行比对分析，找到其活性中心位点，根据活性中心的序列设计一组用于新基因合成的寡核苷酸，运用DNA合成仪经过化学合成获得这组寡核苷酸引物，用反向PCR法获得全新的巨大芽孢杆菌细胞色素P450酶基因cypl (具体见实施例2)。
3.重组质粒pTrc99A-cj^/转化大肠杆菌T0P10，加入IPTG诱导后，重组细胞色素 P450酶的活力达到1020 U/mL。为进一步提高制备细胞色素P450酶的效率，本研究优化了纯化方法，最终得到电泳纯的重组细胞色素P450酶(具体见实施例3)。有益效果通过对大肠杆菌表达载体的选择和基因的定向改造，同时结合选择的 pTrc99A使重组蛋白的表达量大为增加，是选用的pET20b的重组蛋白表达量增加了 3. 8倍， 酶活达到770 U/mL。改造后的巨大芽孢杆菌ALA2菌株的细胞色素P450酶基因cypl在大肠杆菌中的酶活较原始基因cyp提高了 32%，酶活达到1020 U/mL (图-2)。
图1 为重组质粒 pPTrc99A-c_F/7/ ；
图2为重组大肠杆菌表达细胞色素P450酶的蛋白电泳图。(a)不同表达载体的全细胞蛋白样品表达水平。M为蛋白质Marker ；第1泳道为重组大肠杆菌(含pTrc99A)全细胞蛋白样品；第2泳道为重组大肠杆菌(含pTrC99A-Cj^/) 全细胞蛋白样品；第3泳道为重组大肠杆菌(含pET20b)全细胞蛋白样品；第4泳道重组大肠杆菌(含pET20b-cj^/)全细胞蛋白样品；
(b)细胞色素P450酶纯化SDS-PAGE图。M为蛋白质Marker ；第1泳道为重组大肠杆菌(含pTrC99A-Cj^/)全细胞蛋白样品；第2泳道为蛋白上样后的样品；第3泳道为20 mM 咪唑洗脱液；第4泳道为纯化后的细胞色素P450酶。
具体实施例方式
实施例1 巨大芽孢杆菌P450基因的克隆及重组质粒pET-20b-c_F/7和pTrc99A-cj^的
构建
1.1巨大芽孢杆菌ALA2菌株的基因组DNA的提取(精编分子生物学实验指南(第四版)北京科学出版社，2005)
1.1.1巨大芽孢杆菌的培养巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)购于美国农业部，NRRL编号是B-21660。巨大芽孢杆菌在固体培养基(LLB培养基胰蛋白胨10 g/L，酵母提取物5 g/L， NaCl 5 g/L，琼脂15 g/L)上生长，挑单菌落至液体LLB培养基。37°C摇床培养8-12 h，收集细胞。用含10% wt甘油的LLB培养基将菌种保存至-80°C。巨大芽孢杆菌基因组DNA的提取 A.细胞制备及裂解
(1)37°C摇床培养巨大芽孢杆菌ALA2 8 h，取5mL菌液4，000 g离心10 min收集细胞。(2)用0.5 mL TE缓冲液重悬菌体，加入30 μ L溶菌酶(50 mg/mL)，混合均勻， 37°C 保温 Ih。(3)加入 50 μ L 10% wt 十二烷基硫酸钠(SDS)和 5 μ L 蛋白酶 K (20 mg/mL), 混合均勻，37 °C保温30 min。B. DNA 的提取
(1)加入 0.75 mL 5 mol/L NaCl，混勻，静止 5 min。
(2)向离心管中加入等体积酚/氯仿/异戊醇(体积比=25:24:1)，混勻，10，000 g 离心 10 min。(3)为防止剪切力造成基因组DNA断裂，用粗口吸管将上清转入另一离心管中，向离心管中加入等体积氯仿/异戊醇(体积比=24:1)混勻，10，000 g离心10 min。(4)将上清转移至另一离心管中，加入0. 6倍体积异丙醇，轻轻晃动至白色丝状 DNA沉淀清晰可见。(5)离心收集沉淀，用70% Vt酒精清洗一次。(6)室温下风干，加50 PL TE缓冲液溶解。(7)稀释用核酸蛋白检测仪检测DNA浓度。引物设计
按照已知的巨大芽孢杆菌P450酶基因(Genbank: J04832. 1)设计引物，引物由中科院上海生物工程中心合成。引物 1 (N 端)5，-ATGACAATTAAAGAAATGCCTCAGC-3，， 引物 2 (C 端)5，-TTACCCAGCCCACACGTC-3，。以提取的巨大芽孢杆菌ALA2的基因组DNA为模板，用合成的引物1、引物2进行 PCR扩增，扩增的条件是94°C，5 min;暂停计时，加TaKaRa Ex Taq 聚合酶，30次循环( 94°C, 30 s;53°C，60 s;72°C，3 min 15 s );72°C，10 min ；反应停止，4°C保温。通过PCR纯化试剂盒对PCR扩增产物进行纯化，得到巨大芽孢杆菌ALA2中细胞色素P450酶基因cyp。克隆
采用 TaKaRa 公司的 pMD-19T Vector。反应体系 10 yL，其中 pMD_19T Vector DNA 1 μ L, Insert DNA 4 μ L, Solution I 5 yL，16°C反应过夜。转化大肠杆菌 T0P10 的感受态细胞，并涂布在含Amp的LLB固体培养基(100 Pg/mL Amp)上，37°C静置培养。挑选若干白色菌落至5 mL LLB液体培养基(含Amp)中，37°C下震荡培养8 h，提取重组质粒进行测序验证，得到含有原始基因cyP的重组质粒pMD19T-cj^。重组质粒的构建和重组蛋白的表达
大肠杆菌表达系统是近年来发展很快的一个原核表达系统，非常适合原核蛋白的表达，表现在遗传背景清楚，技术操作简单，培养条件简单。研究表明，外源蛋白在大肠杆菌中表达的差异主要由表达系统的选择及外源基因本身的特性决定。不同表达系统的选择是影响基因在异源宿主中表达效率的主要因素。因此，为实现CJ^在大肠杆菌中的高效表达，本研究首先对比了不同的表达系统对细胞色素P450酶的影响。重组质粒的构建
A.重组质粒pET-20b-c_F/7的构建按照测序结果设计相对于pET-20b载体的引物，引物3 (N端)5' -CCGG ATCCATGACAATTAAAGAAATGCCTCAGC-3，，前端加上 BamH I 位点；弓丨物 4 (C 端) 5，-GCGCTCGAGCCCAGCCCACACGTC-3，，前端加上 Xho I 位点。以 T 克隆载体 pMD19T_cj^ 为模板进行PCR扩增，使用TaKaRa公司的I^rime STAR HS DNA聚合酶，反应体系50 yL，获得 PCR产物。反应体系pMD19T_cj^0. 5 yL，引物 3 (10 μΜ) 1 yL，引物 4 (10 μΜ) 1 μ L， dNTP Mixture (各 2. 5 mM) 4 μ L，5 X PCR Buffer 10 μ L, Prime STAR HS 聚合酶 0.5μ L，力口 ddH20 至 50 yL。反应条件94°C预变性5 min，94°C变性 30 s，58°C退火 30 s，72°C 3 min 15 s, 30个循环，72°C延伸10 min，取5 μ L反应产物电泳检测。将获得的目的基因和pET_20b用内切酶BamH I和)(h0 I双酶切，并割胶回收，浓缩后16°C连接过夜。宿主菌使用大肠杆菌BL21的感受态细胞，涂布在LLB平板(含100 μ g/ mL Amp)上，倒置平板过夜。挑选单菌落到5 mL液体LLB培养基(含100 μ g/mL Amp)中， 37°C，200 rpm培养8 h。提取重组质粒进行测序验证，得到含有原始基因的重组质粒 pET-20b-cj^ οB.重组质粒pTrc99A-c_F/7的构建
按照测序结果设计相对于pTrc-99A载体的引物，引物5 (N端)5' -CCGc catgggcACAATTAAAGAAATGCCTCAGCc-3’，前端加上 Nco I 位点。引物 6 (C 端) 5’ -GCGCTCGAGCCCAGCCCACACGTC-3’，前端加上BamH I位同时引入组氨酸标签，便于后期纯化。以T克隆载体pMD19T-c_F/7为模板进行PCR扩增，使用TaKaRa公司的I^rime STAR HS DNA聚合酶，反应体系50 μ L，获得PCR产物。反应体系pMD19T_cj^0. 5 μ L，引物 5 (10 μΜ) 1 μ L，引物 6 (10 μΜ) 1 μ L， dNTP Mixture (各 2· 5 mM) 4 μ L，5 X PCR Buffer 10 μ L, Prime STAR HS 聚合酶 0· 5 μ L，力口 ddH20 至 50 yL。反应条件94°C预变性5 min，94°C变性 30 s，58°C退火 30 s，72°C 3 min 15 s, 30个循环，72°C延伸10 min，取5 μ L反应产物电泳检测。将获得的目的基因和pTrc99A用内切酶Nco I和BamH I双酶切，并割胶回收，浓缩后16°C连接过夜。宿主菌使用大肠杆菌T0P10的感受态细胞，涂布在LLB平板(含100 μ g/ mL Amp)上，倒置平板过夜。挑选单菌落到5 mL液体LLB培养基(含100 μ g/mL Amp)中， 37°C，200 rpm培养8 h。提取重组质粒进行测序验证，得到含有原始基因的重组质粒 pTrc99A-cj^ 。重组蛋白的表达
将阳性转化子接种到LLB平板上活化，37°C培养12 h，接单菌落到5 mL LLB液体培养基中，370C，200 rpm摇床培养8-10 h，转摇瓶培养，当OD600达到0. 6-0. 8之间时，加入IPTG 至终浓度为0.5 mM，于30°C，120 rpm条件下诱导6-8 h。样品于12000 rpm下离心5 min, 弃上清，将大肠杆菌重悬后，超声波破壁，再次离心，取上清检测酶活。酶活采用NADPH法测定。(Budde M. ， Applied Microbiology and Biotechnology (2004), 66(2), 180-186) 实施例2 :P450基因的定向改造及重组质粒pTrc99A -cypl的构建 2. 1巨大芽孢杆菌细胞色素P450酶基因的定向改造
酶蛋白的活性中心位点对酶的催化性能的有重要影响。酶的活性中心是一个由若干活性点组成的三维空间结构，其中T269残基位于血红素域I-helix末端，对分子氧O2的结合与激活具有重要作用。(Yeom H et al, Biochemistry 34 (1995) :14733)
在 Swiss-pdbViewer4. 03 软件的辅助下(Arnold K et al, Bioinformatics, 22,195; Schwede T et al, Nucleic Acids Research 31: 3381 )，以原始酶的核苷酸序列cjp 为基准，希望通过改变细胞色素P450酶对氧的结合能力来达到提高酶活的目的，采用一步反向 PCR对细胞色素P450酶基因cyp的密码子进行突变。通过对细胞色素P450酶结构进行分析，对位于269位处苏氨酸残基进行定点随机突变。以来源于巨大芽孢杆菌ALA2的细胞色素P450酶基因(^双)序列为基础，为了改变269位处的苏氨酸，设计了一组寡核苷酸，引物7 5' -GAANNNACAAGTGGTCTTTTATCATTTGC GC -3'；引物8 :5'-GTGTCCCGCAATTAAGAACG _3'，共定点随机突变了 3个碱基，将氨基酸序列中的一个苏氨酸改为其他氨酸。运用DNA合成仪经过化学合成获得这组寡核苷酸。人工进化的巨大芽孢杆菌ALA2的细胞色素P450酶基因cypl的获得采取反向PCR 扩增技术。反应体系以0. 5 μ L pTrc99A-cjp 为模板，引物 7 (10 μΜ) 1 μ L，引物 8 (10 μΜ) 1 μ L,4 μ L dNTP Mixture (各2.5 mM), 10 μ L 5X PCR Buffer,0. 5 μ L Phusion 聚合酶，加水补足50 UL0反应条件98°C预变性30 s，98°C变性 10 s，55°C退火 30 s，72°C 3 min 30 s， 30个循环，72°C延伸10 min，取5 μ L反应产物电泳检测。重组质粒pTrc99A-c_F/7 /的构建
通过PCR纯化试剂盒对PCR扩增产物进行纯化。因为Wiusion聚合酶扩增片段是平端，可以直接用jM Polynucleotide Kinase对5’ _0H末端寡核苷酸的磷酸化。磷酸化反应T4Polynucleotide Kinase 1 μ L, IOX Buffer 1 μ L，PCR 产物 8 μ L，总体系共10 μ L (反应体系中可加入终浓度ImM的ATP)。37°C，反应3-4 h。再用T4 DNA连接酶16°C连接过夜。从磷酸化体系中取8 μ L液体，加1 μ L Τ4 DNA连接酶，1 μ L相应的IOX Buffer,总体系10 μ L。取1-2 μ L连接液电击转化，宿主菌使用大肠杆菌Τ0Ρ10，涂布在LLB平板(含100 Pg/mL Amp)上，倒置平板过夜，挑选单菌落到5 mL液体LLB培养基(含100 Pg/mL Amp)中， 37°C，200 rpm培养8 h。提取重组质粒进行测序验证，得到含有定向进化后的基因I 的重组质粒 pTrc99A-c_F/7 I (图 _1)。
实施例3 重组质粒pTrc99A-cj^/转化大肠杆菌及重组酶的制备 3.1大肠杆菌的电击转化
大肠杆菌的电击转化高压电转化是目前效率最高的质粒DNA转化大肠杆菌的方法。按照常规办法制备大肠杆菌T0P10感受态细胞，50 μ L分装一管，放于_80°C保存。电转化具体步骤
(1)取1 μ 重组质粒pTrc99A-c_F/7 /加入到50 μ L融化的大肠杆菌感受态细胞T0P10 中，混勻。(2)调节电击仪，使电脉冲为25 μ F，电压2. 5 kV，电阻200 Ω。(3)将转化混合物转移到预冷的电转化池中，吸干池的外表面，然后放入样品槽中。(4)进行脉冲电转化，然后马上向电转池中加入1 mL SOC培养基，混勻。(5)将混合物转移到无菌培养管中，于37°C 180 rpm摇床培养45 60 min。(6)取100 μ 涂布于LLB平板(含100 Pg/mL Amp)上，倒置平板于37°C培养。重组大肠杆菌工程菌株的诱导表达
从电击转化的平板上挑去含有重组质粒pTrc99A-cj^ /的重组菌至挑选单菌落到5 mL液体LLB培养基(含100 Pg/mL Amp)中，37°C，200 r/min培养8 h。然后按转接至200 mL LLB液体培养基(含100 Pg/mL Amp)中，至OD600达到0. 6-0. 8，加入IPTG至终浓度为0. 5 mM，于30°C，120 rpm条件下诱导6-8 h。离心收集菌体，用50 mM磷酸盐缓冲液(pH 8.0) 洗涤一次。重组酶的制备
由于重组质粒 pTrc99A-cj^/中含有 His-tag 标签，通过 His*Bind Purification Kit (Novagen)进行纯化，得到纯化的重组酶。具体操作过程 A.样品的处理
(1)将洗涤过的菌体，用IXBinding Buffer 8mL重悬，超声波破壁。(2)破壁后，13，000 g离心30 min，取上清即为样品。B.处理柱子
(1)取1 mL填料装柱。(2 )用3mL的无菌水洗柱子。(3 )用 5mL 的 1 X Charge Buffer 洗柱子。(4)用 3mL 的 IXBinding Buffer 洗柱子。C.上样
(1)将样品加入柱子，控制流速约每分钟6滴。(2)用3 mL IXBinding Buffer洗柱子，除去未结合的蛋白质。(3)用4 mL含有20 mM咪唑的洗脱液洗柱子，除去杂蛋白。(4)用80 mM咪唑的洗脱液洗柱子，将目的蛋白洗脱下来。(5)用 4 mL IXStrip Buffer 洗柱子。通过此过程得到纯化的细胞色素P450酶，将此酶液在50 mM磷酸缓冲液(pH 8.0) 中过夜透析，除去咪唑。用NADPH法测酶活。
权利要求
1.巨大芽孢杆菌ALA2细胞色素P450酶基因，其特征在于该基因的核苷酸序列cp/如 SEQ ID NO. 1 所述。
2.包含权利要求1所述核苷酸序列的重组质粒。
3.包含权利要求1所述核苷酸序列的重组质粒pTrc99A-cj^/。
4.包含权利要求1所述核苷酸序列的重组质粒pTrC99A-Cj^/的制备方法，其特征在于构建步骤为将获得的基因cw和pTrc99A用内切酶Afco I和BemM I酶切，连接构建重组质粒pTrc99A-c双，通过一步反向PCR对第269位苏氨酸进行定点随机突变，经磷酸化后连接，获得重组质粒pTrc99A-cj^/。
5.含有权利要求3所述重组质粒pTrC99A-Cj^/的宿主细胞为大肠杆菌TOPlO。
6.巨大芽孢杆菌ALA2细胞色素P450酶的纯化方法，其特征在于挑取含重组质粒 pTrC99A-Cj^/的大肠杆菌摇菌培养；当培养至OD6tltl达到0. 6-0. 8，用终浓度0. 5 mM IPTG诱导6-8 h ；离心收集菌体并洗涤；用镍柱纯化向洗涤后的菌体中加入IXBinding Buffer 重悬菌体，超声破碎菌液后离心，然后取离心液上样，再用IXBinding Buffer洗柱子除去未结合的蛋白质，最后用含有80 mM咪唑的洗脱液洗脱，即得目标蛋白。
全文摘要
巨大芽孢杆菌ALA2细胞色素P450酶基因及其重组质粒的构建及酶的纯化方法，该基因的核苷酸序列cypI如SEQIDNO.1所述。通过对大肠杆菌表达载体的选择和基因的定向改造，选择的pTrc99A载体使重组蛋白的表达量大为增加，比选用的pET20b载体的重组蛋白表达量增加了3.8倍，酶活达到770U/mL。将改造后的编码巨大芽孢杆菌ALA2细胞色素P450酶基因cypI插入pTrc99A，并转化大肠杆菌，其在大肠杆菌中表达的酶活较原始基因cyp提高了32%，酶活达到1020U/mL(图-2)。
文档编号C12N15/53GK102399796SQ20111035081
公开日2012年4月4日 申请日期2011年11月9日 优先权日2011年11月9日
发明者李迅, 王亮亮, 王婷 申请人:南京林业大学