专利名称：一种糯玉米杂交种遗传纯度的快速鉴定方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，涉及一种糯玉米杂交种遗传纯度的快速鉴定方法，利用SRAP和RAPD分子标记技术进行糯玉米品种‘苏玉糯2号’种子遗传纯度的检测。
背景技术：
种子是农业极其重要的生产资料，种子质量直接关系到种子生产者、经营者和使用者的经济利益。种子质量好坏评判的重要依据是遗传纯度、发芽率、净度与水分等4项指标。后3项指标检验可在室内进行，而遗传纯度鉴定相对比较困难。准确、迅速、简便地鉴定种子遗传纯度是现代农业生产与种子工作的重要内容。玉米属禾本科玉米属Gea)玉米种(mays)(盖钧镒.作物育种学各论[M].北京中国农业出版社，2006，128-129)。按照收获时期和用途玉米可划分为籽粒用玉米、青贮玉米、鲜食玉米、爆裂玉米等。其中鲜食玉米能够像蔬果一样食用鲜嫩果穗及其加工产品。国外把鲜食玉米称之为蔬菜玉米。鲜食玉米包括甜玉米、糯玉米、笋玉米等，其中糯玉米因其籽粒黏软清香、风味独特、皮薄无渣，比甜玉米含有更丰富的营养物质和更好的适口性，且易消化吸收，已成为老少皆宜的休闲食品 (杨华等.鲜食与爆裂玉米育种和栽培[M].北京中国农业科学技术出版社，2008，3-5)。杂交育种在作物育种工作中占据重要的位置，由于玉米雌雄同株异花授粉，是典型的异花授粉作物，比较容易进行杂交制种(张泽民.玉米杂交制种概述[M].北京中国农业出版社，2008，87-88)。在制种过程中，杂交种中常常混有由母本自交产生假杂种，也会有机械混杂，引起极大的生产风险，将给杂交种种子生产者、销售商以及种植者带来重大损失。因此，在杂交种种子销售之前，对一代杂交种种子的遗传纯度进行快速、准确鉴定显得尤为重要。目前对玉米优良品种种子的遗传纯度检测主要有田间种植鉴定、同工酶鉴定，但田间鉴定需要播种育苗，大田种植管理，需要对形态特征进行观察，耗时长，工作量大，并且易受季节限制和环境因素影响(孔广超等.玉米种子纯度检验方法研究[J].种子，2000， (3) :26-28) 0由于在收获前玉米假杂交种与真杂交种之间形态学的差异表现不是很明显， 在苗期与成株期不易鉴别，尤其当亲本之间遗传基础很近时，更加不易鉴别。同工酶分析容易受到环境和所取材料部位的影响，且对于一些亲本遗传差异较小的杂交品种，同工酶有时难以进行纯度检测与鉴定，准确度不高(柳李旺等.分子标记技术在蔬菜作物品种鉴定与纯度检测中的应用[J].分子植物育种，2004，2 (4) :563-568)。随着分子生物学的发展， 基于PCR技术的DNA分子标记技术，由于其快速简便、稳定可靠、成本相对较低等优点，成为现代农作物优良品种种子遗传纯度鉴定的重要技术之一，开始应用于棉花、水稻、番茄、甘蓝等多种作物中。‘苏玉糯2号’是利用自交系T361与T366杂交育成的早熟、高产的糯玉米杂交品种(国审编号国审玉2003066)(陈国清等.早熟优质糯玉米杂交种‘苏玉糯2号’的选育及应用[J].金陵科技学院学报，2006，(1) :71-74)。该品种不仅早熟性好、产量高，而且具有口感风味佳、成熟整齐、营养丰富等优点，目前在山东、河南、河北、陕西、江苏北部、安徽北部夏玉米生产区大面积推广应用。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术的上述不足，提供糯玉米品种‘苏玉糯2号’种子遗传纯度的快速鉴定方法。本发明的目的可通过如下技术方案实现糯玉米品种‘苏玉糯2号’种子遗传纯度的鉴定方法，包括以下步骤1)提取‘苏玉糯2号，幼苗基因组DNA。2)利用 SRAP 引物组合 NAUSRem7/NAUSRpml，或 RAPD 引物 NAURP709 与 NAURP712， 以糯玉米‘苏玉糯2号’基因组DNA为模板进行PCR扩增，亦或者同时利用SRAP引物组合 NAUSRem7/NAUSRpml，和 RAPD 引物 NAURP709 与 NAURP712，以玉米‘苏玉糯 2 号，基因组 DNA 为模板进行PCR扩增；所述的SRAP弓丨物组合序列为正向引物NAUSRem7 :GACTGCGTACGAATTATG (SEQ ID No. 1)；反向引物NAUSRpml TGACGGCGAACAATCTCC (SEQ ID No. 2)；RAPD引物序列NAURP709 :AGTCCCCCTC(SEQ ID No. 3)；NAURP712 :CAGCTCCTGT(SEQ ID No. 4)。3)将扩增后的DNA片段，分别利用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测SRAP扩增产物，利用琼脂糖凝胶电泳检测RAPD扩增产物。4)对电泳结果进行分析，将同时具有母本、父本特异性标记条带的单株判定为真正的杂交种，计算种子遗传纯度，其中SRAP引物组合NAUSRem7/NAUSRpml产生大小为170bp母本特异性标记条带，和 150bp父本特异性标记条带；RAPD引物NAURP709产生大小为790bp母本特异性标记条带；NAURP712产生大小为1250bp父本特异性标记条带。其中，SRAP-PCR反应体系含 IOng 基因组 DNA，2. 5mmol · I^Mg2+， 0. 15mmol · L—dNTPs，0. 5 μ mol .171 SRAP 正向引物 NAUSRem7 与反向引物 NAUSRpml，0. 75U Taq DNA 聚合酶；PCR 扩增程序90°C 3min ；94°C lmin,35°C lmin，72°C 1. 5min，5 个循环； 94°C lmin,50°C lmin，72°C 1.5min，33 个循环；72°C 7min 延伸，10°C保存。RAPD-PCR 反应体系含 IOng 基因组 DNA, 2. Ommol · L-1 Mg2+，0. 15mmol · I^dNTPs， 0. 4ymol ‘ L-1 NAURP709 或 NAURP712，0. 75U Taq DNA 聚合酶；PCR 扩增程序 94 °C 2min ； 94°C 30s，37°C 45s，72°C 1.5min，40 个循环；72°C IOmin 延伸，10°C保存。有益效果本发明筛选出能够在一代杂种中产生具有父母本特异标记条带且不受环境影响的分子标记，用于鉴定糯玉米种子的遗传纯度，可以大大提高杂交种遗传纯度鉴定的效率， 从而为其种子遗传纯度的快速鉴定建立起高效、准确的质量控制方法。该检测方法具有标记稳定，准确性高，不受被测样品生长阶段与环境影响，在整个生长季节都可以进行，成本低，并且能够在短时间内准确地鉴定出糯玉米种子遗传纯度等优点。
图1是糯玉米品种‘苏玉糯2号，种子遗传纯度检测特异性引物NAUSRem7/ NAUSRpml 的 SRAP-PCR 电泳图谱。泳道F ‘苏玉糯2号，母本；泳道M ‘苏玉糯2号，父本；泳道1_11 ‘苏玉糯2 号’ F1杂交种；泳道L =IOObp分子标准量；箭头示特异性标记条带。图2是糯玉米品种‘苏玉糯2号，种子遗传纯度检测特异性引物NAURP709的 RAPD-PCR电泳图谱。泳道F ‘苏玉糯2号，母本；泳道M ‘苏玉糯2号，父本；泳道1_11 ‘苏玉糯2 号’ F1杂交种；泳道L :DL2000 plus分子标准量；箭头示特异性标记条带。图3是糯玉米品种‘苏玉糯2号，种子遗传纯度检测特异性引物NAURP712的 RAPD-PCR电泳图谱。泳道F ‘苏玉糯2号，母本；泳道M ‘苏玉糯2号，父本；泳道1-11 ‘苏玉糯2 号’ F1杂交种；泳道L :DL2000 plus分子标准量；箭头示特异性标记条带。
具体实施例方式实施例1糯玉米杂交种种子遗传纯度的快速鉴定。利用SRAP和RAPD分子标记技术进行糯玉米品种‘苏玉糯2号’种子遗传纯度的快速鉴定主要操作程序如下1 DNA 提取(1)取糯玉米品种‘苏玉糯2号’幼苗幼嫩叶片约0. lg，经液氮研磨，加入500μ 1 CTAB 裂解液(2% CTAB，2mol 吨―1 NaCl,20mmol 吨―1 EDTA, IOOmmol 吨―1 Tris-HCl(pH 8.0) 与0. 2%的β -巯基乙醇，V/V)转入1. 5ml离心管中，65°C水浴30_50min ；(2)取出在16°C，12，OOOrpm条件下离心lOmin，上清液转入新灭菌的1. 5ml离心管中，加入等体积氯仿异戊醇04 1，体积比)混合液，然后轻轻摇晃，室温12，OOOrmp 条件下离心IOmin ；(3)将上清液吸入新离心管中，重复步骤次，加入0. 1体积的醋酸钠和等体积预冷的异丙醇并缓慢翻转5-10次，放置于_20°C冰箱30min以上；(4)4°C，12，OOOrmp条件下离心lOmin，倒掉上清液，用70%预冷乙醇洗涤DNA沉积物；(5) 40C，12，OOOrmp条件下离心2_%iin，倒掉上清液，干燥后加入80 μ L灭菌TE缓冲液溶解DNA，琼脂糖凝胶电泳检测所提DNA后保存于4°C或_20°C备用。2分子标记分析利用RAPD和SRAP引物对糯玉米品种‘苏玉糯2号’及其亲本进行PCR扩增，筛选出可以产生目标标记条带的特征引物SRAP引物组合NAUSRem7(SEQ ID No. 1)/NAUSRpml (SEQ ID No. 2)，RAPD 引物 NAURP709(SEQ ID No. 3)与 NAURP712 (SEQ ID No. 4)。利用获得的有效特征引物对糯玉米品种‘苏玉糯2号’幼苗基因组DNA进行PCR扩增。SRAP与RAPD标记扩增反应体系与扩增程序为
SRAP-PCR 反应体系含 IOng 基因组 DNA, 2. 5mmol · I71 Mg2+, 0. 15mmol · I^dNTPs， 0. 5ymol Γ1 SRAP 正向引物 NAUSRem7 与反向引物 NAUSRpml，0. 75U Taq DNA 聚合酶；PCR 扩增程序:90°C 3min ；94°C lmin，35°C lmin，72°C 1. 5min，5 个循环；94°C lmin,50°C lmin, 72°C 1.5min，33 个循环；72°C 7min 延伸，10°C保存。RAPD-PCR 反应体系含 IOng 基因组 DNA, 2. Ommol · L-1 Mg2+, 0. 15mmol · I^dNTPs， 0. 4ymol .171 NAURP709 (SEQ ID No. 3)或NAURP712 (SEQ ID No. 4,0. 75U Taq DNA聚合酶； PCR扩增程序94°C 2min ；94°C 30s, 37°C 45s, 72°C 1. 5min，40 个循环；72°C IOmin 延伸，10°C保存。3扩增产物检测SRAP-PCR扩增产物采用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)。25ml凝胶中含有 Arc Bis (29 1，质量比)6. 65ml、5XTBE 5ml,TEMED 20 μ 1,10% AP 0. 3ml ;PCR 产物在 6. 0%的聚丙烯酰胺凝胶上分离。预电泳50-60V 30min后上样，120V电泳2. 5-3. Oh ；凝胶采用0. 5%冰醋酸、10%乙醇固定液固定12-20min ；0. 2% AgNO3溶液染色15min ；蒸馏水洗涤两次后于显影液(1.5% NaOH,0. 4%甲醛，0. 002% Na2S2O3)中显影；拍照。RAPD-PCR扩增产物采用含有溴化乙锭(EB)的1. 2%琼脂糖凝胶电泳。采用1倍 TAE电泳缓冲液；扩增后的DNA样品加入3 μ 1加样缓冲液(含0. 25%溴酚蓝、30%蔗糖)， 混勻后用移液枪加样8μ 1，120V恒压条件下电泳40-50min ；利用凝胶成像系统拍照，保存。4杂种种子遗传纯度鉴定对糯玉米‘苏玉糯2号’ F1杂种幼苗基因组DNA扩增产物进行电泳分析。根据3 个特异性引物产生的目标标记条带来判别真、假杂种。只有同时具有父、母本特异性标记条带的幼苗单株判定为真正的杂交种，将仅具有母本特异性标记条带或父本特异性标记条带的幼苗单株判定为假杂种。其中利用SRAP引物组合NAUSRem7/NAUSRpml进行PCR扩增，在杂交种中产生大小为170bp的母本特异性标记条带NAUSRem7/NAUSRpml17(1与150bp的父本特异性标记条带 NAUSRem7/NAUSRpml150的幼苗单株判定为真正的杂交种(图1)。利用RAPD引物NAURP709进行PCR扩增，在杂交种中产生大小为790bp的母本特异性标记条带NAURP70979C1(图2)，且利用引物NAURP712进行PCR扩增，在杂交种中产生大小为1250bp的父本特异性标记条带NAURP712125C1(图幻的幼苗单株判定为真正的杂交种。根据SRAP或RAPD分子标记特异性引物分析结果，计算供检种子遗传纯度(％ ) [供检种子粒数(幼苗数)-假杂种粒数(幼苗数)]/供检种子粒数(幼苗数)X100。其中SRAP引物代号NAUSRem7/NAUSRpml，其含义为‘NAU’代表“南京农业大学”； “SR”代表SRAP引物，“NAUSR em7/NAUSR pml”代表实验室SRAP引物编号；RAPD引物NAURP709，其含义为‘NAU，代表“南京农业大学”;“RP”代表RAPD引物， “709”代表实验室RAPD随机引物编号；RAPD引物NAURP712，其含义为‘NAU，代表“南京农业大学”;“RP”代表RAPD引物， “712”代表实验室RAPD随机引物编号。
权利要求
1.糯玉米品种‘苏玉糯2号’种子遗传纯度的鉴定方法，其特征在于包括以下步骤1)提取‘苏玉糯2号，幼苗基因组DNA；2)利用SRAP 引物组合 NAUSRem7/NAUSRpml，或 RAPD 引物 NAURP709 与 NAURP712，以糯玉米‘苏玉糯2号’基因组DNA为模板进行PCR扩增，亦或者同时利用SRAP弓丨物组合NAUSRem7/ NAUSRpml，和RAPD引物NAURP709与NAURP712，以糯玉米‘苏玉糯2号，基因组DNA为模板进行PCR扩增；所述的SRAP引物组合序列为正向引物 NAUSRem7 :SEQ ID No. 1 ；反向引物 NAUSRpml :SEQ ID No. 2 ；RAPD引物序列NAURP709 =SEQ ID No. 3 ；NAURP712 =SEQ ID No. 4；3)将扩增后的DNA片段，分别利用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测SRAP扩增产物，利用琼脂糖凝胶电泳检测RAPD扩增产物；4)对电泳结果进行分析，将同时具有母本、父本特异性标记条带的单株判定为真正的杂交种，计算种子遗传纯度，其中SRAP引物组合NAUSRem7/NAUSRpml产生大小为170bp母本特异性标记条带，和150bp 父本特异性标记条带；RAPD引物NAURP709产生大小为790bp母本特异性标记条带；NAURP712产生大小为 1250bp父本特异性标记条带。
2.根据权利要求1所述的糯玉米品种‘苏玉糯2号’种子纯度的鉴定方法，其特征在于所述的 SRAP-PCR 反应体系含 IOng 基因组 DNA, 2. 5mmol · L^1Mg2+, 0. 15mmol · I^dNTPs， 0· 5 μ mo 1 · I^1SRAP 正向引物 NAUSRem7 与反向引物 NAUSRpml，0. 75U Taq DNA 聚合酶；PCR 扩增程序:90°C 3min ；94°C lmin，35°C lmin，72°C 1. 5min，5 个循环；94°C lmin,50°C lmin, 72°C 1. 5min，33 个循环；72°C 7min 延伸，10°C保存；所述的 RAPD-PCR 反应体系含 IOng 基因组 DNA，2. Ommol Γ1 Mg2+, 0. 15mmol 'L^dNTPs, 0. 4ymol ‘ L-1 NAURP709 或 NAURP712，0. 75U Taq DNA 聚合酶；PCR 扩增程序 94 °C 2min ； 94°C 30s, 37°C 45s, 72°C 1.5min，40 个循环；72°C IOmin 延伸，10°C保存。
全文摘要
本发明属于生物技术领域，涉及一种糯玉米杂交种遗传纯度的快速鉴定方法。其步骤是提取糯玉米基因组DNA，利用筛选出的SRAP有效引物组合NAUSRem7/NAUSRpm1以及RAPD有效引物NAURP709、NAURP712进行PCR扩增，将扩增后的PCR产物分别进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳和琼脂糖凝胶电泳，拍摄DNA电泳图谱。通过比较和分析电泳图谱中的DNA片段序列差异形成的多态性扩增片段大小与位置差异，进行糯玉米F1杂交种‘苏玉糯2号’种子遗传纯度的鉴定。本发明的检测方法具有标记稳定，准确性高，不受被测样品生长阶段与环境影响，成本低，且在整个生长季节都可以进行等优点。
文档编号C12Q1/68GK102505044SQ20111035188
公开日2012年6月20日 申请日期2011年11月10日 优先权日2011年11月10日
发明者刘君, 徐良, 柳李旺, 陆虎华, 陈莹, 龚义勤 申请人:南京农业大学