专利名称：一种用于pcr扩增fgfr1基因片段或者检测fgfr1基因的试剂盒和引物的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物医药领域，尤其涉及一种用于PCR扩增FGFRl基因片段或者检测 FGFRl基因的试剂盒和引物和该引物的应用。
背景技术：
成纤维生长因子受体I(FGFRl)分子靶点是一种新型有效蛋白靶点，近些年发现在部分乳腺癌、恶性神经胶质瘤、脑膜瘤等肿瘤组织中FGFRl基因高度扩增，同时伴有FGFRl蛋白过度表达，其肿瘤发生机理是成纤维生长因子(FGF)与FGFRl结合，从而激发受体的酪氨酸激酶活性，使结合于激酶区的底物(信号分子)发生磷酸化，引发细胞内的一系列信号传导途径，刺激细胞繁殖、肿瘤生长，FGFRl可以与多种FGF结合。含有FGFRl基因高度扩增的肿瘤细胞对FGFRl信号传导有着依赖性，因此可以应用FGFRl抑制剂来抑制这些肿瘤细胞生长、导致肿瘤细胞凋亡，从而达到治疗癌症的效果。事实上，国际上有十多家公司(包括 Boehringer Ingelheim,诺华，施贵宝等等)已经开发了十多种不同的能够抑制FGFRl的药物。一直以来，针对这些FGFR抑制剂的开发大都是在乳腺癌病人中开展的。但是2010 年12月，德国马克斯-普朗克研究所(Max-Planck Institute)的研究人员在美国《科学-转化医学》(Science Translational杂志上发表了一篇轰动性的报道发现在常见于吸烟人群的鳞状细胞肺癌(Squamous Cell Lung Cancer)中基因扩增非常常见(高于20%)，并且临床上正在开发的抗癌药物FGFR抑制剂特异性地抑制含有/ ^ 基因扩增的鳞状细胞肺癌细胞，而对没有/ ^基因扩增的鳞状细胞肺癌细胞则没有抑制作用。非小细胞肺癌中主要有腺癌和鳞癌(鳞状细胞肺癌)两大类，在非吸烟患者的肺癌中大多是腺癌，而在吸烟人群肺癌中大多是鳞癌。目前已知的有效肺癌靶向药物如特罗凯、 易瑞沙主要是针对腺癌的，而在马克斯-普朗克研究所的有关/ ^扩增的发现之前，医学界还没有掌握针对吸烟人群中肺鳞癌的有效药物靶点。因此，马克斯-普朗克研究所的这一发现，被认为是找到了第一个针对吸烟人群中鳞状细胞肺癌的药物靶点，从而第一次为肺鳞癌的个性化地靶向治疗提供了依据。利用FGFR抑制剂对肺鳞癌病人进行个性化的靶向治疗，首先需要筛选出那些在癌细胞中有FGFRl基因扩增的病人。因此需要开发一种基因诊断试剂盒，通过检测肿瘤组织中FGFRl的扩增情况，确定癌症的病变因素和制定有效治疗方案。如果存在FGFRl高度扩增情况，可以推荐患者接受FGFR抑制剂药物治疗，使适宜FGFR靶向治疗的患者获益，尤其是让吸烟人群中的肺鳞癌患者受益于FGFR抑制剂；如果不存在FGFRl高度扩增，应及时考虑其它治疗药物，避免使患者蒙受药物的潜在毒性作用及不必要的经济负担，并错过最佳治疗时机
发明内容
为了解决上述的技术问题，本发明的第一个目的是提供一种用于PCR扩增FGFRl 基因片段或者检测FGFRl基因的试剂盒。本发明的第二个目的是提供上述的引物和该引物的应用。为了实现上述的第一个目的，本发明采用了以下的技术方案
一种用于PCR扩增FGFRl基因片段或者检测FGFRl基因的试剂盒，该试剂盒至少包括两个寡聚核苷酸引物，所述的两个寡聚核苷酸引物的核苷酸序列分别如下所述 5， -gcttagctgctgtggcaatg-3，和 5， _cccactttgggtctgtgtca_3，。本试剂盒还可以包含用于PCR扩增的聚合酶、脱氧核糖核酸(dNTP )等等。其中可以包含，也可以不包含，一个荧光标记探针，例如TaqMan探针。TaqMan探针的核苷酸顺序可 Lii,^ 5' -FAM-agaataacaaaatggaactccgccccc-TAMRA-3'。本试剂盒还可以(但不是必须)包括另一对PCR引物，用于PCR扩增一个单拷贝持家基因Uiouseke印ing gene),例如人白蛋白Ulbumin )基因、β -actin基因、 等等。在一个具体实施方案中，此对引物是5’ - gcgcactaaggaaagtgcaa -3’和5’ -caacagcacaggttttgtggtt -3'。另外本试剂盒还可以(但不是必须)包含能够和一个持家基因
ge/^)，例如人白蛋白(W/wffli/ )基因或β -actin基因杂交的荧光标记探针，例如TaqMan探针。在一个具体实施方案中，TaqMan探针的核苷酸顺序可以是5’ -VIC-actatcccaaagacct atccattgcac t-TAMRA-3，。为了实现上述的第二个目的，本发明采用了以下的技术方案
一种用于PCR扩增FGFRl基因片段或者检测FGFRl基因的引物，其特征在于该引物的核苷酸序列分别如下所述5’ -gcttagctgctgtggcaatg-3'和 5' -cccactttgggtctgtgtca-S'ο上述的两个寡聚核苷酸引物5，-gcttagctgctgtggcaatg-3， 和 5’ -cccactttgggtctgtgtca-3'用于制备在肿瘤细胞或组织中检测FGFRl基因的试剂盒的用途。所述肿瘤细胞或组织可以是任何人肿瘤细胞和组织，如乳腺癌、非细胞肺癌、膀胱癌、 口腔鳞癌、食道鳞状细胞癌、卵巢癌、前列腺癌、等等。在一个具体实施方案中，所述肿瘤细胞或组织为乳腺癌或肺鳞癌细胞或组织。本发明的试剂盒通过检测肿瘤组织中FGFRl的扩增情况，确定癌症的病变因素和制定有效治疗方案。如果存在FGFRl高度扩增情况，可以推荐患者接受FGFR抑制剂药物治疗，使适宜FGFR靶向治疗的患者获益，尤其是让吸烟人群中的肺鳞癌患者受益于FGFR抑制剂；如果不存在FGFRl高度扩增，应及时考虑其它治疗药物，避免使患者蒙受药物的潜在毒性作用及不必要的经济负担，并错过最佳治疗时机。FGFRl基因扩增检测试剂盒的开发将第一次使肺鳞癌能够得益于靶向药物。因此本发明试剂盒的问世也将带来极大的社会效益。
图1 图6为以SW620、DLDU C0L0320、HCT116、Ll和HT29细胞系和正常人血淋巴细胞的DNA为模板，STORGreen染料法的检测两种引物的扩增情况图。
具体实施方式
本发明的试剂盒可以用来检测肿瘤细胞或组织中FGFRl基因是否有扩增。具体地说，可以从人肿瘤细胞或组织中提取基因组DNA作为PCR模板，然后利用上述FGFRl引物进行荧光定量PCR，同时利用上述人白蛋白ALB引物进行荧光定量PCR，然后将FGFRl基因扩增的Ct值与ALB基因扩增Ct值比较，通过计算Δ Ct=CtFGFE1-CtALB,以人基因组中单拷贝白蛋白(ALB)基因为内参基因，从而相对定量地确定FGFRl基因的扩增情况。此处荧光定量 PCR可以是任何形式的荧光定量PCR，如利用双链DNA结合染料例如STORGreen染料标记 PCR产物，也可以是利用一个或多个荧光标记探针如TaqMan探针或molecular beacon法。表1 FGFRl及ALB引物及探针信息
权利要求
1.一种用于PCR扩增FGFRl基因片段或者检测FGFRl基因的试剂盒，其特征在于该试剂盒至少包括两个寡聚核苷酸引物，所述的两个寡聚核苷酸引物的核苷酸序列分别如下所述5，-gcttagctgctgtggcaatg-3，和 5，_cccactttgggtctgtgtca_3，。
2.根据权利要求1所述的一种用于PCR扩增FGFRl基因片段或者检测FGFRl基因的试剂盒，其特征在于该试剂盒还包括引物5’ - gcgcactaaggaaagtgcaa -3’和5’ -caacagcacaggttttgtggtt -3'。
3.根据权利要求1所述的一种用于PCR扩增FGFRl基因片段或者检测FGFRl基因的试剂盒，其特征在于该试剂盒还包括荧光标记探针5’-FAM-agaataacaaaatggaactccgccccc-T AMRA-3，。
4.根据权利要求1所述的一种用于PCR扩增FGFRl基因片段或者检测FGFRl基因的试剂盒，其特征在于该试剂盒还包括荧光标记探针5’-VIC-actatcccaaagacctatccattgcac t-TAMRA-3，。
5.一种用于PCR扩增FGFRl基因片段或者检测FGFRl基因的引物，其特征在于该引物的核苷酸序列分别如下所述5’ -gcttagctgctgtggcaatg-3'和 5' -cccactttgggtctgtgtca-S'ο
6.两个寡聚核苷酸引物5’-gcttagctgctgtggcaatg-3’ 和 5’ -cccactttgggtctgtgtca-3'用于制备在肿瘤细胞或组织中检测FGFRl基因的试剂盒的用途。
7.根据权利要求6所述的用途，其特征在于所述的肿瘤为乳腺癌、非细胞肺癌、膀胱癌、口腔鳞癌、食道鳞状细胞癌、卵巢癌或前列腺癌。
8.根据权利要求7所述的用途，其特征在于所述的肿瘤细胞或组织为乳腺癌或肺鳞癌细胞或组织。
全文摘要
本发明涉及生物医药领域，尤其涉及一种用于PCR扩增FGFR1基因片段或者检测FGFR1基因的试剂盒和引物和该引物的应用。一种用于PCR扩增FGFR1基因片段或者检测FGFR1基因的试剂盒，该试剂盒至少包括两个寡聚核苷酸引物，所述的两个寡聚核苷酸引物的核苷酸序列分别如下所述5’-gcttagctgctgtggcaatg-3’和5’-cccactttgggtctgtgtca-3’。本发明的试剂盒通过检测肿瘤组织中FGFR1的扩增情况，可以确定癌症的病变因素和制定有效治疗方案。
文档编号C12N15/10GK102352353SQ20111035209
公开日2012年2月15日 申请日期2011年11月9日 优先权日2011年11月9日
发明者徐丽华 申请人:湖州数问生物技术有限公司