专利名称：枯草芽孢杆菌木糖诱导的外分泌表达载体的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种能在枯草芽孢杆菌中分泌表达外源基因的表达载体pXYL-amyQ。
背景技术：
枯草芽孢杆菌UaciBm ·5油iihi)是一种革兰氏阳性细菌，其细胞壁不含内毒素，能形成芽孢，分泌蛋白能力强，是一些重要工业酶制剂的生产菌，自1958年Spizizen 发现枯草杆菌168菌株能摄取外源基因以后，随着DNA重组技术的发明，特别是金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)带抗性标志的质粒可作为其载体的发现，枯草芽孢杆菌基因工程的工作迅速发展。作为很有吸引力的外源基因表达的宿主，枯草芽孢杆菌有以下几种优点①枯草芽孢杆菌是非致病的土壤微生物，不产内毒素，美国食品和药物管理局(FDA)已经将枯草芽孢杆菌列为原则上认为安全的微生物GRAS (generally recognised as safe)宿主； ②拥有一套高效的分泌信号肽及分子伴侣系统，赋予芽孢杆菌高效分泌表达目的蛋白的能力，可以直接把目标蛋白分泌到培养基中，有利于蛋白的分离纯化及后期处理③良好的发酵基础和生产技术，培养条件简单，能高密度培养，生长周期短。是目前原核表达系统中表达和分泌外源蛋白较理想的宿主。国内外在开发和使用枯草芽孢杆菌作为表达系统方面做了许多研究，但是到目前为止仍没有一套商业化高效的表达载体出现，研究和开发枯草芽孢杆菌的表达载体已经成为人们研究的重点之一。
发明内容
本发明的目的是提供一种能在枯草芽孢杆菌中分泌表达外源基因的枯草芽孢杆菌木糖诱导的外分泌表达载体PXYL-amyQ。将外源基因克隆到该表达载体，转化枯草芽孢杆菌，通过木糖诱导能够将有活性的目的蛋白分泌到细胞外，实现外源基因在枯草芽孢杆菌中的分泌表达。为实现上述目的，本发明将枯草芽孢杆菌整合载体pAXOl质粒上的木糖诱导的启动子序列作为该表达载体的启动子，为实现载体的严紧调控表达，将木糖诱导的启动子的阻遏基因序列加入到木糖诱导的启动子的前端，使其在不加诱导剂的情况下不能表达。同时引入信号肽序列，以实现表达的外源蛋白能够分泌到培养基中。本发明的一种枯草芽孢杆菌木糖诱导的外分泌表达载体pXYL-amyQ，其是以枯草芽孢杆菌质粒PHT43为出发质粒，去掉原有的启动子及其阻遏基因，插入枯草芽孢杆菌木糖启动子的表达盒和信号肽序列构建而成。所述信号肽为α -淀粉酶基因信号肽，所述枯草芽孢杆菌木糖启动子的表达盒为木糖诱导的启动子及其阻遏蛋白。所述α-淀粉酶基因信号肽是如下(a)或(b)的蛋白质 (a)由序列表中SEQ ID NO. 1所示的氨基酸组成的蛋白质；
3(b)将SEQID NO. 1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加且与 SEQ ID NO. 1具有相同功能的由SEQ ID NO. 1衍生的蛋白质。所述阻遏蛋白具体为如下(C)或(d)的蛋白质
(c)由序列表中SEQID NO. 2所示的氨基酸组成的蛋白质；
(d)将SEQID NO. 2的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加且与 SEQ ID NO. 2具有相同功能的由SEQ ID NO. 2衍生的蛋白质。所述α-淀粉酶基因信号肽为如下1)、2)或3)的DNA分子
1)其碱基序列是SEQID Ν0. 3所示的DNA分子；
2)在严格条件下与1)限定的DNA序列杂交且编码所述蛋白的DNA分子；
3)与1)或2)限定的DNA序列具有90%以上的同源性，且具有相同功能的DNA分子； 所述阻遏蛋白的编码序列为如下4)、5)或6)的DNA分子
4)其碱基序列是SEQID N0. 4所述的DNA分子；
5)在严格条件下与4)限定的DNA序列杂交且编码所述蛋白的DNA分子
6)与4)或5)限定的DNA序列具有90%以上的同源性，且具有相同蛋白功能的DNA分
子；
所述木糖诱导的启动子为如下7)或8)的DNA分子
7)其序列是序列表中SEQID N0. 5所示的DNA分子；
8)与7)限定的DNA序列具有90%以上同源性，且具有相同木糖诱导功能的DNA分子； 所述的外分泌表达载体pXYL-amyQ，其核苷酸序列如SEQ ID N0. 6所示。所述外分泌表达载体PXYL-amyQ在表达同源或外源蛋白中的应用。将纤维素酶基因克隆到该表达载体中，构建纤维素酶的重组表达载体，转化枯草芽孢杆菌，通过测定发酵液中纤维素酶的酶活来评价该表达载体的分泌表达水平。结果表明，所构建的枯草芽孢杆菌的分泌表达载体可实现外源基因在枯草芽孢杆菌中的高效分泌表达，表达的产物具有较好的生物学活性。本发明的显著优点
本发明构建的表达载体可作为枯草芽孢杆菌表达系统的载体，将目的基因克隆到该表达载体上，通过木糖诱导能够将有活性的目的蛋白分泌到细胞外，有利于蛋白的分离纯化及后期处理，具有广泛的应用前景。本发明构建的表达载体可以在枯草芽孢杆菌中高效分泌表达具有生物学活性的蛋白，该表达载体所使用的诱导剂是木糖，所使用的宿主枯草芽孢杆菌是GRAS宿主，具有生物安全性。本发明的分泌表达载体将在蛋白表达，特别是酶的表达及抗体制备中发挥重要的作用。
图1是枯草芽孢杆菌木糖诱导的外分泌表达载体pXYL-amyQ的质粒图谱；
图2是不同发酵液的水解圈:A、Bacillus subtilis 168 pXYL-amyQ-cel诱导发酵液水解圈，B、Bacillus subtilis 168木糖诱导发酵液水解圈，C、Bacillus subtilis 168 pXYL-amyQ-cel未诱导发酵液水解圈。
具体实施例方式本发明结合附图和实施例做进一步的说明。本发明所使用的大肠杆菌宿主菌DH5 α购自Takargi, Bacillus subtilils 168及枯草芽孢杆菌整合载体pAXOl购自feci/^As Genetic Stock Center (BGSC)，枯草芽孢杆菌 pHT43 购自 MoBiiTec。实施例1枯草芽孢杆菌分泌表达载体pXYL-amyQ的构建 1、包含木糖诱导启动子及其阻遏基因xylose cassette的克隆以pAXOl为模板，以引物对
xyl+ :5，GCATGAGCTCCTAACTTATAGGGGTAAC 3，(含 c I 酶切位点) xyl- :5，GCATGGATCCCATTTCCCCCTTTGATTT 3，(含 BamH I 酶切位点)(下划线部分为酶切位点)
扩增木糖诱导启动子及其阻遏基因，PCR反应条件为94°C变性5min ；94°C变性30s， 60°C退火30s，72°C延伸2min，30个循环；72°C延伸lOmin。扩增产物胶回收后经BamHl和 Sac I双酶切后，用胶回收试剂盒回收1440bp的目的基因片段，得到枯草芽孢杆菌木糖启动子的表达盒xylose cassette。2、枯草芽孢杆菌胞内表达载体pXYL的构建
PHT43经BamHl和&ic I双酶切，去掉LacI、Pgrac及SamyQ的片段，切胶回收6400bp 左右的PHT43质粒骨架。用T4DNA连接酶将xylose cassette及pHT43质粒骨架连接起来，并转化DH5 α 感受态细胞。提取质粒DNA，并用BamHl和Mc I双酶切验证，筛选出阳性克隆并测序验证， 得到木糖诱导的枯草芽孢杆菌胞内表达质粒，并命名为PXYL。3、信号肽基因序列的亚克隆及pXYL-amyQ分泌表达载体的构建以PHT43为模板，用引物对
amyQ+ 5 ‘GGACAGATCTATGATTCAAAAACGAAAGCG 3，(含 Bgl II 酶切位点) amyQ- 5 ‘GATCGGATCCTACGGCTGATGTTTTTGTAAT 3，(含 BamH I 酶切位点) 扩增出枯草芽孢杆菌分泌信号肽amyQ基因序列，PCR反应条件为94°C变性5min; 94°C变性 30s, 59. 5°C退火 30s，72°C延伸 45s，30 个循环；72°C延伸 IOmin0 得到 IOObp 左右的目的片段，回收目的片段，用BamHl和Bgl II双酶切回收的目的片段，克隆到BamHl酶切CIAP去磷酸化的载体pXYL上，提取质粒DNA，PCR验证并测序，得到木糖诱导的枯草芽孢杆菌外分泌质粒表达载体，命名为pXYL-amyQ。实施例2纤维素酶的分泌表达
为评估该表达载体的分泌表达水平，本例以纤维素酶为报道基因。1、含有纤维素酶基因的重组表达载体的构建
以枯草芽孢杆菌Bacillus subtilisl68基因组为模板，用引物对 eel+ 5' GCATGGATCCATGAAACGGTCAATCTCT 3，(含 BamHl 酶切位点) eel- :5，GCATCCCGGGCTAATTTGGTTCTGTTCC 3，(含 Sma I 酶切位点) 扩增出1500bp的纤维素酶基因，PCR反应条件为94°C变性5min;94°C变性30s， 59. 5°C退火30s，72°C延伸2min，30个循环；72°C延伸lOmin。回收目的片段，BamHl和Sma I 双酶切并胶回收，同样的酶双酶切pXYL-amyQ载体胶回收。两种回收片段在T4连接酶的作用下进行连接，构建含有纤维素酶基因eel的重组表达载体pXYL-amyQ-cel。2、枯草芽孢杆菌的转化及鉴定
采用化学转化的方法将重组质粒pXYL-amyQ-cel转入枯草芽孢杆菌168感受态细胞中。用5ug/ml的氯霉素平板筛选后，挑单菌落液体LB培养提质粒，通过双酶切鉴定筛选阳性转化子。3、纤维素酶表达的检测
通过刚果红鉴定板来鉴定本发明质粒的分泌表达纤维素酶的能力，其原理是刚果红是一种能够和大分子多糖相结合的染色剂，染色之后能和纤维素结合形成红色。纤维素酶能将纤维素水解成小分子的还原糖，在用刚果红染色之后没有被水解的纤维素能够和刚果红结合显红色，而水解的部位则不能和刚果红结合而出现透明圈。将携带pXYL-amyQ-cel重组质粒的枯草芽孢杆菌168的单菌落于40ml含氯霉素的LB培养基中，37°C过夜培养，加入木糖诱导48h，发酵液6000g，2min离心取上清，取发酵液上清50ul于刚果红活性鉴定板中观察水解圈的大小(图2 A)，在相同的培养条件下，以不携带重组质粒的枯草芽孢杆菌168加诱导剂(图2 B)及携带重组质粒pXYL-amyQ-cel的枯草芽孢杆菌168不加诱导剂(图2 C)为对照。图2A有明显的水解圈，图2B没有水解圈， 说明pXYL-amyQ-cel重组质粒在木糖诱导下具有分泌表达纤维素酶的能力。图2A有明显的水解圈，图2C没有水解圈说明木糖诱导的枯草芽孢杆菌外分泌表达载体具有严紧调控外源基因表达的性质。适当稀释发酵液，根据中华人民共和国轻工行业标准-纤维素酶制剂(QB 2583-2003)的方法测定CMC酶的活力，酶活力达到20. 56IU/ml，并可通过进一步的优化提高表达量。酶活定义为(50 士 0. 1)°C，在量pH6.0的条件下，1 min水解纤维素底物，产生出相当于1 uMmol葡萄糖的还原糖为1个酶活力单位，以IU/mL表示。实验结果表明，本发明的木糖诱导的枯草芽孢杆菌外分泌表达载体能实现外源基因在枯草芽孢杆菌中的高效分泌表达，且表达的蛋白具有生物活性。此外在不加诱导剂的情况下不表达外源基因，说明本发明的载体具有严紧调控外源基因的表达的性质。
权利要求
1.一种枯草芽孢杆菌木糖诱导的外分泌表达载体pXYL-amyQ，其是以枯草芽孢杆菌质粒PHT43为出发质粒，去掉原有的启动子及其阻遏基因，插入枯草芽孢杆菌木糖启动子的表达盒和信号肽序列构建而成。
2.根据权利要求1所述的外分泌表达载体pXYL-amyQ，其特征在于所述信号肽为 α-淀粉酶基因信号肽，所述枯草芽孢杆菌木糖启动子的表达盒为木糖诱导的启动子及其阻遏蛋白。
3.根据权利要求2所述的外分泌表达载体pXYL-amyQ，其特征在于，所述α_淀粉酶基因信号肽是如下(a)或(b)的蛋白质(a)由序列表中SEQID NO. 1所示的氨基酸组成的蛋白质；(b)将SEQID NO. 1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加且与 SEQ ID NO. 1具有相同功能的由SEQ ID NO. 1衍生的蛋白质；所述阻遏蛋白具体为如下(c)或(d)的蛋白质(c)由序列表中SEQID NO. 2所示的氨基酸组成的蛋白质；(d)将SEQID NO. 2的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加且与 SEQ ID NO. 2具有相同功能的由SEQ ID NO. 2衍生的蛋白质。
4.根据权利要求2所述的外分泌表达载体pXYL-amyQ，其特征在于，所述α-淀粉酶基因信号肽为如下1)、2)或3)的DNA分子1)其碱基序列是SEQID NO. 3所示的DNA分子；2)在严格条件下与1)限定的DNA序列杂交且编码所述蛋白的DNA分子；3)与1)或2)限定的DNA序列具有90%以上的同源性，且具有相同功能的DNA分子； 所述阻遏蛋白的编码序列为如下4)、5)或6)的DNA分子4)其碱基序列是SEQID NO. 4所述的DNA分子；5)在严格条件下与4)限定的DNA序列杂交且编码所述蛋白的DNA分子6)与4)或5)限定的DNA序列具有90%以上的同源性，且具有相同蛋白功能的DNA分子。
5.根据权利要求2所述的外分泌表达载体pXYL-amyQ，其特征在于，所述木糖诱导的启动子为如下1)或2)的DNA分子1)其序列是序列表中SEQ ID NO. 5所示的DNA分子；8)与1)限定的DNA序列具有90%以上同源性，且具有相同木糖诱导功能的DNA分子。
6.根据权利要求1所述的外分泌表达载体pXYL-amyQ，其特征在于，该表达载体的核苷酸序列如SEQ ID NO. 6所示。
7.如权利要求1-6中任一所述外分泌表达载体pXYL-amyQ在表达同源或外源蛋白中的应用。
全文摘要
本发明提供了枯草芽孢杆菌木糖诱导的分泌表达载体pXYL-amyQ，其是以枯草芽孢杆菌质粒pHT43为出发质粒，去掉原有的启动子及其阻遏基因序列，插入枯草芽孢杆菌木糖启动子的表达盒和信号肽序列构建而成。所述的木糖启动子表达盒包括木糖诱导的启动子序列及其阻遏基因序列。本发明构建的表达载体pXYL-amyQ可在枯草芽孢杆菌中分泌表达同源和异源蛋白。该载体的宿主菌枯草芽孢杆菌是GRAS宿主，所使用的诱导剂木糖无毒，具有生物安全性，将在蛋白表达，特别是酶及抗体制备中发挥重要的作用。
文档编号C12N15/113GK102382855SQ20111035816
公开日2012年3月21日 申请日期2011年11月14日 优先权日2011年11月14日
发明者吕暾, 黄文斌 申请人:福州大学