专利名称：一种重组基因获得番茄红素含量高且抗青枯病番茄的方法
技术领域：
本发明涉及生物基因技术领域，具体来说，是涉及一种植物转基因技术方法。
背景技术：
番茄是广东本地栽培的面积最大的果菜之一，适宜华南地区冬春季种植的番茄品种有“穗丰”、“金丰一号”等。广东番茄需求量巨大，仅广州日均消耗量就达1万-2. 5万公斤。另外，广东是国内番茄酱三大产区之一，其外销量呈直线上升。2005年我国番茄酱总产量为100万吨，其中，三分之一产于广东。随着中国近年来经济迅速增长，人们的生活水平逐渐提高，对番茄制品的认知度也逐渐提高，消费量逐年增加将是必然。据悉今年广东地区计划扩大番茄的加工产量，总产量将超过450万吨。但另一方面，生态环境的改变以及城市工业进程的加快，致使产区引种的番茄品种的适应性与抗病性每况愈下。市场需求的逐年增加与生产面积的下降之间矛盾日益突出，目前，广东夏季番茄产量已无法满足本地销售市场。青枯病是严重危害多种茄科植物的一种细菌性病害，病原为青枯假单孢杆菌，主要通过根系危害植物的维管束，造成植物输导系统堵塞，影响水分及营养的吸收，导致植株因水分和营养匮乏而枯萎死亡。近年来，在部分地区青枯病有所发生和发展，受害较重的是番茄，其次是马铃薯和辣椒。该病在广东每年以6 9月份发生最烈，产量损失高达15% 100%。长期以来，由于土传细菌性病害传播快，药剂防治难以起效等特点，加上近年来提倡环保和净化生存空间，所以，番茄抗病品种的选育是育种工作者研究的热点和目标，但由于茄科的抗青枯病遗传是隐性的和多基因的，因此，该类研究工作难度大，进展十分缓慢。青枯病是维管束病害，以开花结果期发生最严重。典型症状为叶片、分枝或植株呈急性萎蔫， 横切茎基部可见木质部变褐。病菌可以在土壤中、病残体、马铃薯块茎上越冬，成为病害的主要侵染来源。国内外对蔬菜青枯病的防治作了大量的研究，但在抗病育种工作中，还存在着抗病性与产量、品质等优良性状的矛盾以及抗性丧失等问题，有些蔬菜目前还没有抗青枯病品种。轮作被认为是较好的一种方法，但效果短暂，当年轮作的效果较好，连续两年种植茄科蔬菜，青枯病仍然发生严重。虽然生物和生态防治具有很大潜力，但因生防菌易受土壤环境影响、生防菌在作物根部定殖能力及其本身退化等问题在田间应用也受到限制。大面积进行土壤消毒，不但成本高，还须注意田间再侵染，否则不能控制整个生长季节青枯病的发生。嫁接防病要有一定的技术，而起耗费劳力，目前难以在广大农村推广。可用于化学防治的高效低毒杀细菌农药较少，防效往往不能令人满意，而且还会造成环境和农产品的污染。为了减少农药使用量，生产无公害产品的有效方法之一就是利用抗病品种。传统的抗病遗传育种由于其周期长，工作量大，很难满足目前需要。而且到目前为止，栽培番茄中仍缺乏一些抗病基因，如番茄的早、晚疫病、青枯病等抗病基因在栽培种中无法找到。可喜的是，随着分子生物学理论与技术的不断发展以及人们对植物抗病分子机制了解的逐步深入，人们有目的的操纵基因获得广谱抗病品种已成为可能。
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从另一方面看，一个品种是否能成为商品，其品种经济性状是非常关键的问题。色泽作为商品番茄关键的经济性状之一是由番茄红素的含量决定的。番茄红素是类胡萝卜素生物合成途径中的一个中间产物。目前，人们对类胡萝卜素生物合成的代谢途径研究的比较透彻。并且植物中番茄红素生物合成的主要酶的基因如GGPP合成酶(GGPS)、八氢番茄红素合成酶(PSY1、PSY2)、八氢番茄红素脱饱和酶(PDQ等均已被克隆。研究表明，番茄果实只有进入转色期后，PSY基因才开始表达，成熟期间的PSY基因的表达均有所加强。番茄红素合成途径中的关键酶的基因PSY和PDS已于1992年得到阐明。对番茄植株生长过程中这两种基因的表达的跟踪研究表明，通过将PSY基因与强启动子结合转化番茄植株，可使PSY 基因得到超量表达，从而增加番茄中的番茄红素含量。最近，英国科学家通过把酵母及细菌中与类胡萝卜素和番茄红素合成有关的酶的基因进行了基因工程操作，使番茄红素含量提高了 2-3倍。贾士荣等得到的抗青枯病马铃薯转基因品种的环境释放以及李颖等选育出了全国首例高抗青枯病的转基因辣椒材料，通过实践证明转抗菌肽基因工程是获得高抗青枯病番茄品种的有效途径。转基因技术的广泛应用和转基因作物的日益推广，使得植物遗传转化过程中应用的标记基因的安全性也受到了越来越多的关注。目前在植物基因工程育种中广泛采用的选择标记基因多为编码抗生素和除草剂的抗性基因。它们的基因产物需要进行安全性和环境影响的评价，这引起了人们对一些转基因作物食品安全性和环境安全性的担忧。当前解决抗性标记基因安全问题的策略有两种一是转化阶段不使用抗性标记基因或采用生物安全标记基因或称无选择标记基因筛选转基因植株；二是先采用抗性标记基因筛选获得转化体后，再剔除标记基因。基于上述基础，我们希望能有一种番茄新品种，它既有抗青枯病特性，又具高番茄红素含量，并且具有食品安全和环境安全特性的优点。
发明内容
针对上述问题，本发明提供一种重组基因获得番茄红素含量高且抗青枯病番茄的方法，通过该方法获得的番茄，它既有抗青枯病特性，又具高番茄红素含量，并且具有食品安全和环境安全特性的优点。本发明的一种重组基因获得番茄红素含量高且抗青枯病番茄的方法，通过以下步骤实现1)构建含PSY2基因的中间载体；2)构建含启动子E8的中间载体；3)将上述构建好的中间载体连接，构建同时含启动子E8和PSY2基因的中间载体；4)将上述含启动子E8和PSY2的基因片段插入到基础载体1^6-GFP中的GFP序列之前，与该基础载体融合；该基因位于载体T-DNA左边界LB和右边界RB序列之间，它含有的XVE杂合蛋白与诱导物17- β -雌二醇结合后可启动重组酶CRE的表达，从而剔除选择标记。5)进行I^6-GFP-PSY2的遗传转化，获得番茄红素含量高且抗青枯病的番茄幼苗。本发明还可做以下改进
步骤1)中，采用BamHI酶和McI限制性酶进行酶切，获得ρΒΙΙΟΙ. 2质粒大片段和PSY2基因片段。步骤1)中，采用 PCR 弓丨物 PSY2F 5，AAC GGATCCGTGTATCAAAGGTAGTAAGGGAAC-3，弓丨 Λ BamH I 酶切位点；PCR 引物 PSY2R :5，ATA GAGCTCACTTGCTAGTGGGGAAGTTG-3，引入 Sac I 限制性酶切位点。步骤2)中，采用HindIII酶和BamHI酶进行酶切，获得Ε8基因片段。步骤2)及步骤 3)中，采用 PCR 引物 E8F 5 ‘ gCAAGCTTA GGAATTTCACGAAATCG3 ‘ 引入 HindIII 酶切位点；PCR 引物 E8R 5' CgGGATCCTCTTTTGCACTGTGAATGAT3‘引入 BamHI 酶切位点。采用T4DNA连接酶进行基因片段的连接；采用大肠杆菌DH5进行中间载体转化，获得大肠杆菌转化子，以进行扩增，提取质粒，酶切等下步操作。步骤幻中，采用农杆菌转化子进行遗传转化。步骤5)中，选用番茄byap211111种子进行遗传转化。步骤幻，所述遗传转化过程中，培育出幼苗后，将幼苗转至含有β -雌二醇的生根培养基中炼苗。本发明的一种重组基因获得番茄红素含量高且抗青枯病番茄的方法，在转基因番茄中的应用。与现有技术相比，本发明具有的有益效果为1)本发明通过转基因的方法对pX6-GFP-psy2质粒进行了转化，在保持番茄品种 BY211111的抗青枯病特性的前提下，提高其番茄红素含量来改善其品相。结果表明伴随着 PSY2基因表达量的增加，番茄果实的番茄红素含量有所提高。2)目前使用的抗性标记基因大多数是抗生素或除草剂抗性基因。当目的基因导入植物基因组后，标记基因就完成了使命，标记基因滞留在植物体内并持久表达不仅给植物生长发育增加负担，而且给其它有利性状基因的表达带来不确定的影响。本发明采用的基础载体I3Xe-GFP基因位于载体T-DNA左边界LB和右边界RB序列之间，它含有的XVE杂合蛋白与诱导物17-β-雌二醇结合后可启动重组酶CRE的表达，从而剔除选择标记，解决了转基因作物的食品安全性和环境安全性问题。本发明中无标记载体的遗传转化不仅可以消除人们对转基因食品安全的疑虑，同时也为获得番茄抗青枯病新品种提供了一种思路。3)本发明构建了含有GFP报告基因的pX6-GFP-psy2质粒，GFP报告基因的使用大大方便了植物转化苗的筛选。
图1为番茄PSY2基因的RT-PCR产物电泳图谱；图中M为DNA相对分子质量标准DL2000(条带从上到下分别为2000，1000，750， 500，250，IOObp)；泳道 1-6 为 PSY2 基因 RT-PCR 产物；图2为pBIPSY2的鉴定图；图中(A)为pBIPSY2的PCR鉴定图谱；⑶为pBIPSY2的酶切鉴定图谱；图3为果实特异性E8启动子重组质粒鉴定图；图中(A)为重组质粒PCR鉴定图；⑶为重组质粒的酶切鉴定图谱；
具体实施例方式为了便于理解本发明，特例举以下实施例。其作用被理解为是对本发明的阐释而非对本发明的任何形式的限制。下列实施例中未注明具体实验条件和方法，所采用的技术手段通常为本领域技术人员所熟知的常规手段。实施中所用的材料及来源分别为番茄品种byap211111为广州市农业科学研究所蔬菜研室提供，大肠杆菌E. coli DH5a，总RNA提取试剂iTrizol, FastTrack 2. OKit5DNA ladder, Platinum Taq DNA Polymerase, PurethaneLink Quick Gel Extraction and PCR Purification Combo Kit,Mini Plasmid DNA Purification Kit 均购自 invitrogen 公司。实施例1含PSY2基因的中间载体的构建根据已发表的番茄PSY2基因序列1EF534739，用生物软件DNAMar设计了该基因的上下游引物，分别命名为PSY2F，PSY2R，分别引入BamHI和McI限制性酶切位点，引物序列如下PSY2F :5，AAC GGATCCGTGTATCAAAGGTAGTAAGGGAAC-3‘ ；PSY2R :5，ATAGAGCTCACTTGC TAGTGGGGAAGTTG-3’。 提取番茄幼苗总RNA，并以此为模板进行RT-PCR反应，回收后的PSY2基因和 pBIlOl. 2质粒分别用BamHI和McI双酶切后，切胶回收酶切后的ρΒΙΙΟΙ. 2质粒大片段和 PSY2基因片段，通过T4 DNA连接酶16°C连接过夜。将连接产物转化到大肠杆菌E. coli DH5 α菌株中，挑取Kan抗性克隆进行BamHI和^icI双酶切验证。将验证成功的重组质粒进行序列测定，连接正确的重组质粒命名为PBIPSY2。1. Giorio G, Stigliani AL, D ‘ Ambrosio C, Phytoene synthase genes in tomato(Solanumlycopersicum L. )-new data on the structures, the deduced amino acid sequences and the expression patterns. 2008, FEBS J. 275(3) :527-35.实施例2含启动子E8的中间载体的构建根据Deikman等报道的番茄Cherry种的果实特异性E8启动子序列，用生物软件 DNAStar 设计 2 条 PCR 引物，分别为 E8F 5 ‘ gCAAGCTTA GGAATTTCACGAAATCG3 ‘引入 HindIII 酶切位点；E8R 5' CgGGATCCTCTTTTGCACTGTGAATGAT3‘引入 BamHI 酶切位点。提取番茄幼苗总RNA，并以此为模板进行RT-PCR反应，回收后的E8基因用 HindIII和BamHI双酶切后，切胶回收酶切后的E8基因片段。将pMDT-18载体与回收的E8片段16°C反应过夜，连接产物转化E. coli DH5a，涂布在含Amp的LB培养基上，挑选单菌落于LB液体培养基中，37°C培养过夜，少量抽提质粒， 用于PCR鉴定。并命名为pMDTE8。实施例3含启动子E8和PSY2基因的中间载体的构建将构建好的pMDTE8和pBIPSY2质粒分别通过HindIII和BamHI双酶切后，切胶回收PBIPSY2质粒大片段和E8启动子片段，通过T4 DNA连接酶16°C连接过夜。将质粒转化到大肠杆菌E. coliDH5 α菌株中，对Kan抗性克隆进行PCR验证，将PCR验证成功的重组质粒进行序列测定，连接正确的重组质粒命名为PBEPSY2。
实施例4将含启动子E8和PSY2基因片段与Px6_gfp中的GFP融合用SpelI酶切质粒pBEPSY2，回收小片段，然后与同样用SpelI酶切且磷酸化的质粒1^6-gfp，16°C连接反应过夜，连接产物转化Ε. coli DH5 α，重组质粒经鉴定，连接正确的命名为 I3Xe-GFP-PSYZ。实施例5Px6-GFP-PSY2 的遗传转化根据CaC12法制备农杆菌EHA105的感受态细胞，取实施例4中含Px6-E8_PSY2的大肠杆菌转化子提取的质粒(Px6-E8-PSY》转化农杆菌EHA105，并鉴定是否转化成功。将番茄byap211111种子无菌处理后播种于发芽培养基上培养5 7天。用剪刀剪取无菌苗的子叶与下胚轴作为外植体，低光照培养2天。将外植体置入经100 μ M的乙酰丁香酮(AS) 重悬好的农杆菌菌液10-15分钟，吸干菌液，暗箱内共培养2 3天。将共培养后的外植体经过羧苄青霉素(400mg/L)溶液洗涤，移到没有选择压力的MS培养基中培养一周时间。将存活的外植体移到选择培养基中30天，存活的愈伤组织移至恢复培养基中，继代两次后将经过选择的植株转入生根培养基上。当根长出约2cm长时，将幼苗转至含有β-雌二醇的生根培养基中，炼苗一周后移到土中，盖上薄膜保护一周。根系发育完好后移栽至温室。实施例6转基因植株的分子检测提取转基因植株的DNA为模板，以GFP引物进行PCR扩增，对GFP是否转入番茄进行检测。PCR引物为引物 1 :5-ATGGTGAGCAAGGGCGAGGA3，
引物 2 5-CTTGTACAGCTCGTCCATGCC3 ’PCR检测结果表明由于GFP基因与PSY2基因融合，GFP基因检测到了，间接证明目的基因已经转入番茄中。Kan标记基因的PCR引物检测引物为35s-500a(5，-ATA gCT ggg CAA Tgg ATT CCg Ag_3，)，35s_500s(5，_CAg ATg gTT AgAgAg gCT TAC gC-3’)。PCR检测结果表明部分转基因植株的标记基因已经去除。实施例7利用I^X6-GFP-PSY2获得的转基因番茄的番茄红素含量分析后代转基因果实经高效液相色谱法(色谱柱BenetnaCh5 — C18(150x4.6mm， 5ym)；选用甲醇-乙腈(50 50)为流动相；流速为1.2ml/min;检测波长为472nm;灵敏度为0. 02AUFS ；柱温为30°C ；进样量为10 μ L)进行番茄红素含量分析，表现为比对照番茄红素含量有所提高，，经本发明的重组基因方法获得的转基因番茄完熟期中番茄红素含量为 1251 μ g/100g (FW)，而未经转基因的番茄完熟期果肉中番茄红素含量为780 μ g/100g (Fff)。 同时转基因番茄中部分品相也由青色转为红色。上述的实施例仅为本发明的优选实施例，不能以此来限定本发明的权利范围，因此，依本发明申请专利范围所作的等同变化，如采用该基础载体1^6-GFP转入其它基因，仍属本发明所涵盖的范围。
权利要求
1.一种重组基因获得番茄红素含量高且抗青枯病番茄的方法，其特征在于包括以下步骤1)构建含PSY2基因的中间载体；2)构建含启动子E8的中间载体；3)将上述构建好的中间载体连接，构建同时含启动子E8和PSY2基因的中间载体；4)将上述含启动子E8和PSY2的基因片段插入到基础载体1^6-GFP中的GFP序列之前，与该基础载体融合；5)进行I^6-GFP-PSY2的遗传转化，获得番茄红素含量高且抗青枯病的番茄幼苗。
2.根据权利要求1所述的一种重组基因获得番茄红素含量高且抗青枯病番茄的方法， 其特征在于步骤1)中，采用BamHI酶和McI限制性酶进行酶切，获得ρΒΙΙΟΙ. 2质粒大片段和PSY2基因片段。
3.根据权利要求2所述的一种重组基因获得番茄红素含量高且抗青枯病番茄的方法， 其特征在于步骤 1)中，采用 PCR 引物 PSY2F :5，AAC GGATCCGTGTATCAAAGGTAGTAAGGGAAC -3，引入 BamHI 酶切位点；PCR 引物 PSY2R :5，ATA GAGCTCACTTGCTAGTGGGGAAGTTG-3，引入 SacI限制性酶切位点。
4.根据权利要求3所述的一种重组基因获得番茄红素含量高且抗青枯病番茄的方法， 其特征在于步骤2)中，采用HindIII酶和BamHI酶进行酶切，获得E8基因片段。
5.根据权利要求4所述的一种重组基因获得番茄红素含量高且抗青枯病番茄的方法，其特征在于步骤幻及步骤⑴中，采用PCR引物E8F 5 ‘ gCMGCTTA GGMTTTCACGAMTCG3 ‘弓| 入 HindIII 酶切位点；PCR 引物 E8R 5' CgGGATCCTCTTTTGCACTGTGMTGAT3‘引入 BamHI 酶切位点。
6.根据权利要求5所述的一种重组基因获得番茄红素含量高且抗青枯病番茄的方法， 其特征在于采用T4DNA连接酶进行基因片段的连接；采用大肠杆菌DH5进行中间载体转化。
7.根据权利要求6所述的任一种重组基因获得番茄红素含量高且抗青枯病番茄的方法，其特征在于步骤幻中，采用农杆菌转化子进行遗传转化。
8.根据权利要求7所述的一种重组基因获得番茄红素含量高且抗青枯病番茄的方法， 其特征在于步骤幻，选用番茄byap211111种子进行遗传转化。
9.根据权利要求8所述的一种重组基因获得番茄红素含量高且抗青枯病番茄的方法， 其特征在于步骤幻，所述遗传转化过程中，培育出幼苗后，将幼苗转至含有雌二醇的生根培养基中炼苗。
10.权利要求1-9中任一项所述的一种重组基因获得番茄红素含量高且抗青枯病番茄的方法，在转基因番茄中的应用。
全文摘要
本发明提供一种重组基因获得番茄红素含量高且抗青枯病番茄的方法，属于生物基因技术领域。是用PSY2及E8启动子插入到基础载体pX6-GFP的GFP序列之前而构建中间载体，再进行遗传转化获得番茄红素含量高且抗青枯病的番茄。该基础载体pX6-GFP基因位于载体T-DNA左边界LB和右边界RB序列之间，它含有的XVE杂合蛋白与诱导物17-β-雌二醇结合后可启动重组酶CRE的表达，从而剔除选择标记，解决了转基因作物的食品安全性和环境安全性问题。本发明中无标记载体的遗传转化不仅可以消除人们对转基因食品安全的疑虑，同时也为获得番茄抗青枯病新品种提供了一种思路。
文档编号C12N15/63GK102382852SQ20111035844
公开日2012年3月21日 申请日期2011年11月11日 优先权日2011年11月11日
发明者刘顺枝, 王小兰 申请人:广州大学