专利名称：一种抗菌脂肽的制备方法及其在兽医药中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种抗菌脂肽的制备方法及其在兽医药中的应用，属于生物医药技术领域。
背景技术：
近年来，研究人员发现某些细菌分泌的产物也具有抗菌活性，目前研究较多的主要有两种(阳离子抗菌肽和脂肽)。脂肽主要来源于一些由细菌、酵母菌、真菌分泌的代谢产物，结构上含亲水的肽键和亲油的脂肪烃链两部分。其中肽链上的氨基酸能以内酯或酰胺键形式与脂肪烃链的羧基、羟基或氨基结合形成环状结构。脂肽分子中脂肪链部分的碳原子数一般在12 19之间，肽链部分的氨基酸残基数在6 13之间。枯草芽孢杆菌在自然生长和发酵培养后期产生的脂肽类抗生素是其最重要的抗菌物质。脂肽类抗生素包括伊枯草菌素(iturins)、泛革素(fengycins)和表面活性素(surfactin)，其中伊枯草菌素和泛革素具有很强的抗真菌活性，而表面活性素对病毒、肿瘤、支原体都有很高的抑制活性。抗菌脂肽属于抗菌肽家族中的一种，具有抗菌活性高、抗菌谱广、结构稳定，对人、兽、畜无害等特性。其抗菌机理和一般抗生素有所不同，它是在微生物的细胞膜上形成孔洞而使细胞内容物流出从而导致细菌死亡或螯合一、二价阳离子从而抑制了细菌代谢过程中多种酶类活性，不易产生耐药性。此外，由于是肽类物质在自然界中容易分解，极具潜力开发为一种新型、环境友好的生物药物。迄今已有近千种天然抗菌肽被分离出来，但是天然抗菌肽的分离纯化过程烦琐且费用较高，另外多数抗菌肽的活性较弱难以达到应用的水平，有些抗菌肽还具有副作用。当前制备抗菌脂肽的方法主要有生物材料提取法，化学合成法和基因工程表达等方法。天然抗菌脂肽在生物材料中含量低，分离也较烦琐，采用这种方法获得的样品难以满足应用需求。化学合成虽可以完成，但成本较高。因此，研发新型、广谱、易于大量制备与纯化而又有较高活性的抗菌脂肽将有利于降低成本，并为开发代替抗生素的抗菌药物提供更大的发挥空间。本发明提供了一种抗菌脂肽的生物制备方法，产量高，生产成本低。所得抗菌脂肽对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌均有较好的抗菌活性，应用于兽医药临床实践中，取得了良好的效果。
发明内容
本发明的目的之一是提供一种抗菌脂肽的制备方法。本发明的另外一种目的是提供一种抗菌脂肽的纯化方法。本发明方法制备的抗菌脂肽应用于兽医药领域取得了良好的效果，提供了一种抗菌脂肽的新用途。本发明所述的抗菌脂肽制备方法为种子菌的培养、发酵培养、抗菌脂肽的粗提、抗菌脂肽的纯化、抗菌脂肽的鉴定与制备结果评价。
上述种子菌培养中的种子菌包括枯草芽孢杆菌(B. subtilis Al株，购于中国普通微生物菌种保藏中心)。其中，种子菌的制备方法为B. subtilisAl株菌种转接至LB平板上，37°C培养 24h ；用接种环取活化菌种，接种于含有100ml LB液体培养基的锥形瓶中，培养过夜作为种子菌。上述的发酵培养中的培养基包括NS-L-I培养基(葡萄糖20.0g，L-谷氨酸钠 5. 0g, MgS040. 5g, KCl 0. 5g, KH2P04 lg, FeS04 0. 15mg, MnS04 5. Omg, CuS04 0. 16mg，蒸馏水 1000ml，pH 7. 0。)。其中，NS-L-I培养基可用其中葡萄糖含量调整，乳糖，L-谷氨酸钠，微量元素等及培养基PH值进行调整后的培养基取代。其中，发酵条件为种子菌接种量(1% 15%)，发酵温度(20°C 37°C)，发酵时间(24 72h)，发酵转速(50 300r/min)，发酵初始pH为pH 5. 0 9. 0。上述抗菌脂肽的粗提过程为取制备的发酵菌液在PH2.0 5.0条件下经 7000rpm离心lOmin，去除菌体，取上清用6mol/L HCL分别调节所需pH，再以7000rpm离心 lOmin，收集沉淀。将沉淀在70°C的烘箱中下燥20h，即得抗菌脂肽粗提物。上述抗菌脂肽的纯化过程采用酸-醇法，具体步骤为取未烘干的抗菌脂肽粗提物，加入醇类物质后用NaOH调节pH至5. O 8. 0，再用醇类物质抽提2次并将其抽提液合并，然后将其a^phadex LH-20层析柱，最后用离心浓缩仪浓缩至完全干燥，即得抗菌脂肽的纯化物。上述抗菌脂肽的鉴定过程为取抗菌脂肽纯化物溶解在少量醇类中，再取一定量的该抗菌脂肽溶液分多次点样于硅胶板上，待点样点风干后，放入盛有展开剂的层析缸中饱和30min，展开剂的组成为氯仿甲醇水=65 25 4 (体积比)，然后，待展开剂到达距硅胶板上层边缘2cm左右时取出，待有机溶剂充分挥发后，再采用含有0. 5%茚三酮的丙酮溶液喷雾显色。上述抗菌脂肽的的制备结果评价方法为70°C的烘箱中干燥所得纯化的抗菌脂肽，产量需大于6. 8g/L。上述提纯的抗菌脂肽的抗菌效果评价方法如下选用如下表的10种动物病原菌，将其培养至对数期后，分别制备成菌悬液，活菌数大于106CFU/ml，备用。将素琼脂固体培养基融化后倒入培养皿，待冷却凝固后，等距平稳地将3个已经灭菌的牛津杯放在固体培养基平面上，再将分别培养细菌的LB半固体培养基融化，冷却至40°C 50°C，移取Iml菌悬液到培养基中，混勻，然后用移液管移取8ml含菌培养基至素琼脂平板上。待凝固后，拔出牛津杯，用移液枪取30 μ 1不同浓度的纯抗菌脂肽加入牛津孔内，以生理盐水作对照。每个处理重复3次，最后细菌放置于37°C培养箱培养 24h。培养完成后，取出培养皿测量抑菌圈的直径大小。纯抗菌脂肽的抗菌谱
权利要求
1.一种抗菌脂肽的制备方法，其特征在于该方法包括种子菌的培养、发酵培养、抗菌脂肽的粗提、抗菌脂肽的纯化、抗菌脂肽的鉴定与制备结果评价。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于上述种子菌培养中的种子菌包括枯草芽孢杆菌(B. subtilis Al株，购于中国普通微生物菌种保藏中心)。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于种子菌的制备方法为B.subtilis Al株菌种转接至LB平板上，37°C培养24h ；用接种环取活化菌种，接种于含有100ml LB液体培养基的锥形瓶中，培养过夜作为种子菌。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于上述的发酵培养中的培养基包括 NS-L-I 培养基(葡萄糖 20. 0g, L-谷氨酸钠 5. 0g, MgS040. 5g，KCl 0. 5g，KH2P04 lg，FeS04 0. 15mg, MnS04 5. Omg, CuS04 0. 16mg，蒸馏水 1000ml，pH 7. 0。)。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于=NS-L-I培养基可用葡萄糖含量调整， 乳糖，L-谷氨酸钠，微量元素及培养基pH值进行调整后的培养基取代。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于种子菌接种量是 15%，发酵温度是20°C 37°C，发酵时间为M 72小时，发酵转速为50 300转/分钟，发酵初始pH 为 pH 5. 0 9. 0。
7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于抗菌脂肽粗提物的制备过程是发酵菌液在pH2. 0 5. 0条件下经7000rpm离心10分钟，去除菌体，取上清用6mol/L HCL分别调节所需PH，再以7000rpm离心10分钟，收集沉淀，将沉淀在70°C的烘箱中干燥20小时，即得。
8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于抗菌脂肽的纯化过程采用酸-醇法， 具体步骤是取未烘干的抗菌脂肽粗提物，加入醇类物质后用NaOH调节pH至5. 0 8. 0，再用醇类物质抽提2次并将其抽提液合并，然后将其过kphadex LH-20层析柱，最后用离心浓缩仪浓缩至完全干燥，即得抗菌脂肽的纯化物。
9.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于抗菌脂肽的鉴定方法为抗菌脂肽纯化物溶解在少量醇类中，再取一定量的该抗菌脂肽溶液分多次点于硅胶板上，待点样点风干后，放入盛有展开剂的层析缸中饱和30分钟，展剂的组成为氯仿甲醇水= 65 25 4(体积比)，然后，待展开剂到达距硅板上层边缘2厘米时取出，待有机溶剂充分挥发后，再采用含有0.5%茚三酮丙酮溶液喷雾显色。
10.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于所得纯化的抗菌脂肽，量大于6.8 克/升。
11.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于该制备方法获得的抗菌肽可用于抑制革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌。
12.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于该制备方法获得的抗菌肽可用于对断奶仔猪和白羽肉鸡细菌病的治疗作用。
全文摘要
本发明涉及一种抗菌脂肽的制备方法及其在兽医药中的应用，通过抗菌脂肽制备工艺的优化，使抗菌脂肽产量较高，达到了6.8g/L。该制备方法获得的抗菌脂肽具有广谱抗菌作用，尤其对革兰氏阳性菌(葡萄球菌和链球菌)效果更佳。将其应用到兽医临床试验中，发现其对猪病原菌(副嗜血杆菌、胸膜肺炎放线杆菌、链球菌、多杀性巴氏杆菌、肺炎双球菌等)和鸡病原菌(沙门氏菌、大肠杆菌、巴氏杆菌等)均有良好的抗菌效果，具有无毒副作用，无耐药性和抗菌谱广的优点，更无化学药物类抗菌素残留等食品安全问题，可成为新型抗生素替代品，具有良好的应用前景。
文档编号C12R1/125GK102559816SQ20111036165
公开日2012年7月11日 申请日期2011年11月16日 优先权日2011年10月13日
发明者韩健宝 申请人:韩健宝