Na⁺/H⁺逆向转运蛋白Nha-K2及其编码基因与应用的制作方法

专利名称：Na⁺/H⁺逆向转运蛋白Nha-K2及其编码基因与应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，具体地，涉及一种Na+AT逆向转运蛋白Nha_K2及其编码基因与应用。
背景技术：
由于全球气候变暖，世界人口不断增加，工业污染加剧，灌溉农业的发展，化肥使用不当等因素，土壤盐渍化日趋严重，这不仅使得土壤荒漠化、生态环境进一步恶化，并且已经成为阻碍作物生长发育及高产优质的主要因素。目前，解决问题的主要途径还是传统改良盐渍土的方法，如淡水洗涤、合理灌溉和使用(^0)3等。但是，传统措施投资大、效益低， 并且随着大量化学物质的加入会加剧土壤的次生盐渍化，这迫使人们考虑采用其它措施来改良利用盐渍土壤。随着生物技术的发展，培育抗盐渍、耐干旱的适宜在盐渍土壤上生长并具有较高经济和生态价值的植物品系，是开发利用盐渍土壤的一条经济而有效的途径。所以对耐盐基因的研究成为当今的研究热点。在自然界中存在着大面积自然形成或者人工形成的各种各样的盐碱环境，如海洋、盐(碱)湖、盐场、盐碱地以及腌制品等为一般生物生长和存活的极限，但却生长着能适应这种极端环境的微生物，我们把这类微生物称为耐盐微生物或嗜盐微生物。根据细菌对 NaCl的需求和最适生长需要的NaCl浓度，可将细菌分为四类(1)非嗜盐菌生长不需要 NaCl，低浓度的NaCl(< 1%)就会对它们的生长产生抑制作用；(2)轻度嗜盐菌生长需要少量的NaCl，其最适生长的NaCl浓度为1 3% ； (3)中度嗜盐菌生长离不开NaCl，它们可在0. 1 32. 5%的条件下生长，最适生长NaCl浓度为3 15% ； (4)极端嗜盐菌一般在9% NaCl以上生长，可在9 35%浓度范围内生长，最适生长NaCl浓度为13 15%。 其中中度嗜盐菌和极端嗜盐菌属于极端环境微生物。中度嗜盐菌和极端嗜盐菌大多存在于海洋、盐(碱)湖、盐场、沙漠植物、盐碱地和盐渍食物等高盐环境中。嗜盐或耐盐微生物在盐域环境中，一方面细胞通过积累亲和性溶质，例如糖、多元醇、氨基酸和氨基酸衍生物等，积累过程既可以通过自身合成也可以通过环境摄入；另一方面细胞将多余的Na+排除细胞外，以维持胞内较低的盐浓度，从而维持细胞正常的形态、结构和生理功能。Na+输出系统又称为钠离子(或单价阳离子)/氢离子逆向转运蛋白，或简称为Na+/H+逆向转运蛋白(Na+Al+antiporter)，广泛存在于微生物(包括细菌和真菌)、植物和动物细胞中。Na+/H+逆向转运蛋白属于跨膜蛋白，催化单价阳离子(如Na+、K+、Li+)输出，该过程与质子(H+)的输入相偶联。嗜盐或耐盐微生物将进入细胞内的Na+再排到细胞外，主要就是通过次级Na+/H+逆向转运蛋白实现的。目前研究的单亚基逆向转运蛋白主要有 NhaA、NhaB、NhaC、NhaD、NhaE、NhaG、NhaP、ChaA 和 MdfA 等。大肠杆菌有4个不同的Na+/H+逆向转运蛋白，分别是NhaA、NhaB, ChaA和MdfA。 ChaA除能输出Na+交换H+外，还能输出Ca+与H+交换，NhaA(简称Ec-NhaA)是大肠杆菌适应在高浓度Na+、L+及碱性pH下生长所必需的主要逆向转运蛋白。NhaB赋予大肠杆菌一定的耐盐性，但在NhaA缺失条件下，NhaB在维持细菌生长方面起着重要作用。nhaA和nhaB双缺失突变后，大肠杆菌变成盐敏感突变株，在含0. 2M NaCl培养基上不能生长，该突变株 (nhaA_和nhaB_)被广泛用于通过功能互补的基因克隆中。在嗜盐微生物中，中度嗜盐菌是一个对盐浓度耐受范围最广的类群，在自然界分布广泛，具有独特的基因类型、特殊的生理机制、多样化的代谢产物和潜在的应用价值。因此大量获取其基因资源，得到更好、更多的转基因材料具有重要的研究意义。

发明内容
本发明的目的是提供一种中度嗜盐菌Na+/H+逆向转运蛋白Nha_K2及其编码基因。本发明的另一个目的在于提供Na+/H+逆向转运蛋白Nha_K2及其编码基因在提高微生物或农作物耐盐环境中的应用。柯柯盐湖位于柴达木盆地东北部，青海省乌兰县境内牦牛山下一小盆地内。湖面海拔3010米，东西长约28公里，南北狭窄，面积119平方公里。柯柯盐湖的湖水为钠盐型， 存在着大量的耐盐或嗜盐微生物基因资源。本发明从柯柯盐湖资源中发现一种中度嗜盐菌 Na+/H+逆向转运蛋白Nha_K2。本发明提供的一种中度嗜盐菌Na+/H+逆向转运蛋白Nha_K2，其氨基酸序列为a) SEQ ID No. 2所示的氨基酸序列；b)SEQ ID No. 2所示的氨基酸序列经替换、缺失、或添加一个或几个氨基酸残基形成的具有同等功能的氨基酸序列。应当理解，本领域技术人员可根据本发明公开的蛋白Nha_K2的氨基酸序列(SEQ ID No.幻，在不影响其活性的前提下，取代、缺失和/或增加一个或几个氨基酸，得到所述蛋白的突变序列。例如在非活性区段，将第495位的F替换为W，将第441位的S替换为Q，将第451位的(V)缺失，将第321位增加一个G或增加S和T，不影响其生物活性。因此，本发明的中度嗜盐菌Na+/H+逆向转运蛋白Nha-K2还包括SEQ ID No. 2所示氨基酸序列经取代、替换和/或增加一个或几个氨基酸，具有与中度嗜盐菌Na+/H+逆向转运蛋白Nha_K2同等活性的由Nha-K2衍生得到的蛋白质。本发明基因包括编码所述蛋白的核苷酸序列。本发明提供了编码上述Na+/H+逆向转运蛋白的基因，其核苷酸序列为(1)序列表SEQ ID NO. 1第571-2058位核苷酸序列，或(2) SEQ ID No. 1所示核苷酸序列经取代、缺失和/或增加一个或几个核苷酸；或(3)编码序列表SEQ ID NO. 2所示蛋白质序列的多核苷酸，或(4)在严格条件下与(1)限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。所述严格条件为在0. 1XSSC(成分为NaCl 0. 015M，柠檬酸钠0. 0015MpH7. 0)， 0. 1% SDS的溶液中，在65°C下杂交，并用该溶液洗膜。序列表中SEQ ID NO. 1是由2746个脱氧核苷酸组成；第571-573位核苷酸序列为nha-K2基因的起始密码子，第2059-2061位核苷酸序列为nha-K2基因的终止密码子；第 571-2058位核苷酸序列为nha-K2基因的编码序列。SEQ ID NO. 1第1-570位核苷酸序列为nha-K2基因的上游序列；SEQ ID NO. 1第2062-2746位核苷酸序列为nha_K2基因的下游序列。此外，应理解，考虑到密码子的简并性以及不同物种密码子的偏爱性，本领域技术人员可以根据需要使用适合特定物种表达的密码子。因而，本发明中度嗜盐菌Na+/H+逆向转运蛋白的编码基因还包括由SEQ ID No. 1所示核苷酸序列经取代、缺失和/或增加一个或几个核苷酸，得到编码Nha_K2的核苷酸序列。本发明提供一种含有上述任一种基因的重组质粒。可将本发明基因与表达载体可操作地连接，得到能够表达本发明蛋白的重组表达载体，进一步将该重组表达载体导入恰当的宿主细胞中，获得表达本发明Nha_K2的基因工程菌。在本发明实例中，通过将nha_K2基因插入到表达载体pUC118上构建得到重组表达载体pUC Nha-K2，其质粒图谱如附图1所示。进一步，将该表达载体导入到E. coli KNabc 中获得表达Nha-K2基因工程菌。上述重组载体转化的宿主细胞也属于本发明的保护范围。本发明还涉及中度嗜盐菌Na+/H+逆向转运蛋白及其编码基因在提高细菌菌株耐盐能力中的应用。具体的应用为将编码中度嗜盐菌Na+/H+逆向转运蛋白Nha_K2的基因转入宿主菌，使宿主菌表达中度嗜盐菌Na+/H+逆向转运蛋白Nha_K2，得到具有耐盐能力的重组菌株。所述宿主菌为大肠杆菌KNabc。本发明还提供中度嗜盐菌Na+/H+逆向转运蛋白及其编码基因在提高农作物耐盐能力中的应用。本发明提供一种利用农杆菌介导转化水稻的方法，将编码中度嗜盐菌Na+/H+逆向转运蛋白的基因转入水稻，使水稻表达中度嗜盐菌Na7H+逆向转运蛋白，得到具有耐盐能力的转基因水稻，使其可以在盐渍土壤上生长，这是开发利用盐渍土壤的一条经济而有效的途径。本发明的有益效果主要体现在提供中度嗜盐菌Na+/H+逆向转运蛋白Nha_K2及其编码基因，经实验验证将该Na+/H+逆向转运蛋白Nha_K2在大肠杆菌中表达，可提高大肠杆菌耐盐环境的能力，这对于农作物育种具有重要的借鉴意义，可将其转入农作物中，获得具有耐盐能力的转基因农作物，以提高农作物的适应性，在农作物育种中有重要的应用前景。


图1是重组质粒pUC Nha-K2构建示意图；图2是携带nha-K2基因的阳性克隆在不同Na+、Li+和K+浓度下的生长情况，其中图加是Na+浓度下的生长情况，图2b是Li+浓度下的生长情况，图2c是K+浓度下的生长情况；图3是Nha_K2的Na+/H+逆向转运蛋白的活性检测结果，其中其中a图为阳性检测结果，b图为阴性对照；图4是Nha_K2的Li+/H+逆向转运蛋白的活性检测结果，其中其中a图为阳性检测结果，b图为阴性对照；图5是Nha_K2的K+/H+逆向转运蛋白的活性检测结果，其中其中a图为阳性检测结果，b图为阴性对照。
具体实施例方式以下实施例仅用于说明本发明，并不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，如《分子克隆实验室手册》(New York =Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的条件进行。实施例1柯柯盐湖宏基因组文库的构建、nha-K2基因的克隆及序列分析(1)柯柯盐湖宏基因组文库的构建柯柯盐湖位于柴达木盆地东北部，青海省乌兰县境内牦牛山下一小盆地内。湖面海拔3010米，东西长约观公里，南北狭窄，面积119平方公里。湖水为钠盐型，渐趋干涸， 现仅东西两端有小面积水面。晶间卤水来源为穿过山前倾斜平原砂砾层后在粘土层而逸出的泉水，泉眼665处以上。盐矿蕴藏量大，每平方公里达750万吨左右，氯化钠总储藏量达 9亿多吨，便于露天开采，再生能力强，建有柯柯盐厂进行开采。分别采集青海柯柯盐湖的湖底淤泥、盐土混合和全盐三种样品。为了针对性的获得中度嗜盐菌的耐盐基因，首先利用8%的Gibbson培养基(每升含有酪蛋白5g，酵母粉 10g，蛋白胨 5g, KCl 2g，柠檬酸三钠 3g，MgSO4 · 7H20 20g, NaCl 80g, pH 7. 5)对样品进行富集培养。在8%的GitDbson培养基中生长良好的菌株，则是中度嗜盐菌。具体实施方法如下从湖底淤泥、盐土混合和全盐三种样品中各称取2g 土壤溶于20mL 8%的GilAson 培养基中，于37°C、180rpm、培养36h。然后，将三种样品按照1 %的接种量再转接于20mL 8%的Gibbson培养基中，于37°C、180r/min、培养36h。再将它们按照的接种量接种于 200mL 8%的Gibbson培养基中相同条件下培养36h，然后收集菌体，提取DNA。DNA提取步骤如下a.取200mL新鲜菌液，以12，000r/min，在4°C离心5min，收获菌体，用TE缓冲液以同样条件离心洗涤1到2次；b.将菌体沉淀悬浮在TE缓冲液中，加入50mg/mL的溶菌酶至终浓度为^iig/mL， 37°C 反应 4-24h ；c.加入20% SDS溶液至终浓度2%，20mg/mL蛋白酶K至终浓度0. lmg/mL,充分混合后，水浴55 °c反应池；d.加入等体积的Tris饱和酚(pH 8. 0)，轻轻上下颠倒摇动5min，再加等体积 (IOmL)的氯仿/异戊醇混合液(24 1，V/V)，轻轻上下颠倒摇动5min, 12，000r/min离心 lOmin，吸取上清到干净的离心管中。重复该步骤一次；e.加入等体积的氯仿/异戊醇混合液04 1，V/V)，轻轻上下颠倒摇动5min， 12，OOOr/min离心lOmin，用大口吸头小心吸取上清到干净的离心管中；f.上清液加入冷的2倍体积乙醇，用玻璃棒将DNA卷出；用冰预冷的70%的乙醇洗涤三次，风干；g.在4°C下将风干的DNA溶解在IOmL TE缓冲液中，加入lOmg/mLRNase至总浓度 50 μ g/mL, 37°C水浴2h ；再加入浓度为20mg/mL蛋白酶K至总浓度100 μ g/mL, 55°C水浴中 2h ；h.重复步骤e和f，将风干的DNA溶于TE缓冲液中，4°C存放至DNA完全溶解。用Sau3A I对提取的柯柯盐湖宏基因组DNA进行部分酶切，具体方法如下
a.用酶储藏液把原酶Sau3AI(3U/yL)稀释100倍，然后设多个试切反应，每个反应中分别加入不同体积稀释后的Sau3AI ；b.取6yL DNA、2yL的缓冲液(10X)、加无菌水至终体积20yL，先不加酶，于 37°C温浴 30min ；c.在20uL的反应体系中加入不同体积的酶液，37°C消化30min，然后立即加入 6μ L EDTA(0. 2Μ)终止反应；d.调整酶和DNA浓度、不断重复上述反应，找出在30min左右2 51Λ范围内最强荧光为最佳反应条件。结果表明，要获2 51Λ大小的DNA片段，最适酶量为每20yL体系加0. 3yL 100 倍稀释的Sau3AI。用最适酶量对柯柯盐湖宏基因组DNA进行多管大量酶切，将获得2 51Λ 大小的DNA片段，用来自中科瑞泰的DNA回收纯化试剂盒，按其中的标准操作方法回收纯化酶切DNA片段。然后将纯化回收的2 51Λ大小的柯柯盐湖宏基因DNA片段与购买的BamH I酶切并去磷酸化的PUC118载体(Takara)按照5 1的比例进行混合，再加入Buffer和连接酶，16°C连接12h。将连接产物电击转化大肠杆菌突变株Ε. coli Knabc (由美国纽约大学Mount Sinai医学院生物化学系的Terry A. Krulwich教授惠赠)，在LBK (每升含有胰蛋白胨10g，酵母粉5g，KCl 6.48g，自然pH)平板上，经蓝白斑筛选，白斑约占90%左右，挑取白斑，每一百个克隆为一个单位，扩大培养，构建柯柯盐湖DNA文库。(2) nha-K2基因的获得及序列分析将步骤(1)构建的柯柯盐湖宏基因组文库每个单位的转化子细胞接种于含氨苄青霉素和卡那霉素抗性的LBK+0. 2M NaCl液体培养基中，37°C培养12_1他，采用常规碱裂解法小量提取大肠杆菌中的重组质粒。将提取的柯柯盐湖宏基因组文库重组质粒电转化到 E. coli KNabc中，转化产物经复壮后涂布在LBK+0. 2M NaCl的平板上，37°C培养箱中培养 12-24h。Ε. coli KNabc是一个Na+输出相关基因缺失的菌株，它只能在无Na+的LBK培养基中生长，在LBK+0.2M NaCl的培养基中不能生长。如果文库中的重组质粒能够功能互补 E. coli KNabc,即在LBK+0. 2M NaCl的平板上能够生长，说明该重组质粒中含有Na+输出相关基因。通过这种功能互补的方法，在柯柯盐湖宏基因组文库中筛选得到阳性克隆E. coli KNabc/pUCK3，提取质粒pUCK3(此处质粒为含有nha_K2基因及其上下游基因的质粒，后续实验中，通过亚克隆获得只含有nha-K2编码区的重组质粒pUC Nha-K2质粒)，送北京博迈德公司测序，测序引物为M13通用引物，序列如下Ml3 正向引物5 ‘ -GTAAAACGACGGCCAGT-3 ‘Ml3 反向引物5 ‘ -CAGGAAACAGCTATGAC-3 ‘运用Genebank中Blastx对质粒上插入的外源DNA片段进行分析，结果表明该外源片段中存在一个完整的开放读码框(ORF)，此ORF与Alkalimonas amylolytica的Na+/H+ 逆向转运蛋白NhaD同源性为73%;与Pseudoalteromonas haloplanktis的Na+/H+逆向转运蛋白NhaD同源性为72% ；与Aeromonas salmonicida的Na+/H+逆向转运蛋白NhaD的同源性为71%，说明质粒pUC K3上的插入片段含有Na+/H+逆向转运蛋白NhaD基因，命名为 nha_K2(Na./H+antiporter of Keke S alt Lake)。DNAman分析表明，获得的逆向转运蛋白基因nha_K2大小1488bp (如序列表中的SEQ ID NO. 1第571-2058位核苷酸序列)，编码一个由496个氨基酸组成的多肽Nha-K2(其氨基酸序列如序列表中的SEQ ID N0.2所示)，其分子量为55，034Da，等电点为9. 18。本领域专业技术人员根据本发明公开的nha-Kl基因核苷酸序列，可以通过人工合成的方法获得 nha-Kl 基因。禾Ij用 Internet 网站 http://www. sbc. su. se/ erikw/toppred2/ 进行疏水性分析。在496个氨基酸残基中，有287个氨基酸残基位于疏水区，构成12个跨膜区，是典型的整合膜蛋白。实施例2逆向转运蛋白Nha_K2提高大肠杆菌耐盐能力的作用通过实施例1中所列举的采样地点，采取土样，在8% GitDbson培养基中富集培养， 提取总DNA后，部分酶切，构建宏基因组文库，利用大肠杆菌盐敏感突变株KNabc为受体进行转化，在含有0. 2M NaCl LBK培养基中筛选可获得nha_K2基因。(1)构建重组质粒用限制性内切酶Ml I酶切质粒PUC118，然后将其与用同样酶切的含有nha-K2基因和其上下游序列的片段(大小约为2. 7kb)连接，得到重组质粒pUCNha-K2(图1)，经鉴定，pUCNha-K2在Ml I位点插入了含有nha_K2基因的外源片段(如序列表中的SEQ ID NO. 1)。(2)重组质粒pUCNha_K2转化大肠杆菌本实施例优选大肠杆菌KNabc为宿主，也可将nha-K2基因导入其他细菌中表达。将步骤(1)获得的重组质粒pUCNha_K2，采用电击转化法转化至大肠杆菌Na+ 输出基因缺失的菌株KNabc，筛选转入重组质粒的阳性转化子，命名为E. C01 i KNabc/ pUCNha_K2。具体步骤如下大肠杆菌电击感受态细胞的制备E. coli KNabc菌种于37°C，200r/min培养过夜；次日晨以1%接种量转接，于371、20017^11，摇3-5小时至OD600 = 0. 5-0. 7 ；将培养物冰浴15-30min后，4°C离心收集菌体；用冰预冷灭菌ddH20清洗菌体2_3次，10%甘油洗菌体1次；然后用10%甘油悬浮，细胞悬液按40 μ L小份分装保存。电击转化将1 μ L质粒DNA加到40 μ L感受态细胞中混勻，将混合物吸入预冷的电激杯内，迅速将电激杯放入电极的滑块内，立即按下Pulse键，电击条件为12. 5kV/cm, 25 μ F,4_5ms0(3)转入重组质粒pUCNha_K2的大肠杆菌耐盐能力检测将阳性克隆E. coli KNabc/pUCNha-K2和转入空载体pUC118的大肠杆菌E. coli KNabc/pUC118 (阴性对照)接种于含不同浓度Na+、Li+和K+的培养基中，当到达生长稳定期后，测定它们的0D_，可反映出它们在不同Na+、Li+和K+浓度下的生长情况(图2)。结果表明携带nha-K2基因的阳性克隆KNabc/pUCNha-K2可以耐受高达0. 6M Na+浓度，而阴性对照菌KNabc/pUC118在0. 2M Na+浓度下便不能生长；且阳性克隆可以耐受0. 4M高Li+浓度，而阴性对照在0. 05M Li+浓度下就不能生长；阳性克隆对K+的耐受能力不很明显。上述实验和结果表明，nha-K2基因的的表达可以赋予大肠杆菌缺失钠离子输出相关基因的突变株KNabc较强的耐盐能力，尤其是对Na+和Li+，K+较不明显。说明若将Nha_K2 蛋白转入农作物，使农作物表达该蛋白，也可提高农作物耐盐的能力，这对农作物育种具有重要的借鉴意义。实施例3对Nha_K2蛋白的单价阳离子逆向转运活性的检测
(1)反转膜的制备所谓反转膜即为菌体粗蛋白的混合体，由于阳性克隆E. coli KNabc/pUC Nha~k2 的反转膜中含有Nha-K2蛋白，而阴性对照菌E.coli KNabc/pUC118的反转膜中则不含 Nha-K2蛋白，通过检测这两种菌反转膜的单价阳离子转运活性，可以确定Nha-K2蛋白转运盐离子的功能。将实施例2获得的阳性克隆E. coli KNabc/pUC Nha_K2和转入空载体pUC118的大肠杆菌E. coli KNabc/pUC118 (阴性对照)接种于盛有20ml LBK液体培养基的三角瓶中，37°C、180r/min摇床中过夜培养。然后，转接于200mL的LBK液体培养基中相同条件培养至对数末期。离心收集菌体，用缓冲液A[10mM Tris-HCl (pH7. 5)，140mM氯化胆碱，0. 5mM 二硫苏糖醇(l，4-dith DTT)，250mM蔗糖(或10%甘油)，5mM MgCl2]洗2次，加入适量的缓冲液A悬浮菌体(另外需加入PMSF至终浓度ImM，少量蛋白酶抑制剂和DNase，缓冲液A 用量为20mL/g菌体)；然后通过Freeh Press破碎细胞，于4°C、8，000r/min、IOmin以去除未破碎细胞及杂质等，再35，000r/min超速离心1小时，沉淀即为制备的反转膜，用ImL缓冲液A悬浮。(2)采用荧光监测法测定反转膜中的逆向转运蛋白活性利用考马斯亮蓝法测定步骤(1)制备的反转膜样品的蛋白含量，确定反应的样品加入量，具体步骤如下取反转膜5-10 μ L，加蒸馏水至0. 2mL,加入2mL考马斯亮蓝G-250 (称取IOOmg考马斯亮蓝G-250，溶于50mL90%乙醇(或甲醇)中，再加入100mL85% (ff/V)的磷酸，用蒸馏水定容至1L)，充分混勻。放置aiiin后，测定OD595值，计算反转膜中蛋白质的含量。然后利用荧光分光光度计监测反转膜的逆向转运蛋白活性。首先，向盛2mL缓冲液B (IOmM Tris-MES (pH6. 5-9. 5)，140mM氯化胆碱，5mMMgCl2)的石英杯中加入1 μ M吖啶橙 (acridine orange,A0)和40 μ g反转膜，抽吸混勻，此时出现的是平稳曲线；然后向反应体系中添加Tris-L-乳酸钾(测K+/H+逆向转运蛋白活性时用Tris-L-乳酸替代Tris-L-乳酸钾)至终浓度为5mM，此时荧光强度开始猝灭；利用AO作为荧光探针，通过荧光分光光度计监控跨膜PH梯度的变化。荧光监测参数为激发光(EX)波长495nm，发射光(EM)波长 530nm ；当荧光强度下降至稳态时，向反应体系加入5 μ L浓度为2Μ的NaCl、LiCl或KCl，以破坏ΔρΗ，此时，荧光强度开始升高。荧光强度的恢复程度即为Na7H+(Li7H+或Κ+/Η+)逆向转运蛋白活性的大小。阳性克隆 E. coliKNabc/pUC Nha_K2 和阴性对照 E. coliKNabc/pUC118 的 Na+/H+、 Li+/H+和K+/H+逆向转运蛋白活性如图3、4、5所示。结果表明，在pH9. 5的缓冲液B中Nha_K2 表现出较高的Na+/H+和Li+/H+逆向转运蛋白活性，而阴性对照菌株E. coliKNabc/pUC118来源的反转膜中未能检测到任何逆向转运蛋白活性。同时，仅检测到非常微弱的Nha-K2的K+/ H+逆向转运蛋白活性。该结果与实施例2中阳性克隆在不同Na+、Li+和K+浓度中的生长情况一致，因此证实，Nha-K2蛋白具有较强的Na+/H+和Li+/H+逆向转运蛋白活性，而K+/H+逆向运蛋白活性较不明显。说明Nha-K2蛋白可以赋予大肠杆菌较强的耐盐能力，若将Nha-K2 蛋白转入农作物，使农作物表达该蛋白，也可提高农作物耐盐的能力，这对农作物育种具有重要的借鉴意义。
权利要求
1.一种Na+/H+逆向转运蛋白Nha-K2，其特征在于，其氨基酸序列为a)SEQ ID No. 2所示的氨基酸序列；b)SEQID No. 2所示的氨基酸序列经替换、缺失、或添加一个或几个氨基酸残基形成的具有同等功能的氨基酸序列。
2.编码权利要求1所述的Na+/H+逆向转运蛋白的基因。
3.如权利要求2所述的基因，其特征在于，其核苷酸序列为1)序列表SEQID NO. 1第571-2058位核苷酸序列，或2)SEQ ID No. 1所示核苷酸序列经取代、缺失和/或增加一个或几个核苷酸；或3)在严格条件下与(1)限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。
4.含有权利要求2或3所述基因的重组载体。
5.如权利要求4所述的重组载体，其特征在于，是通过将权利要求2或3所述基因插入到表达载体PUC118上构建得到重组表达载体pUC Nha-K2。
6.权利要求4或5所述的重组载体转化的宿主细胞。
7.中度嗜盐菌Na+/H+逆向转运蛋白Nha-K2或其编码基因在提高细菌菌株耐盐能力中的应用。
8.如权利要求7所述的应用，其特征在于所述应用为将权利要求4所述的重组载体转入宿主菌，使宿主菌表达权利要求1所述的Nha-K2蛋白，得到具有耐盐能力的重组菌株。
9.如权利要求8所述的应用，其特征在于所述宿主菌为大肠杆菌KNabc。
10.中度嗜盐菌Na+/H+逆向转运蛋白Nha-K2或编码基因在提高农作物耐盐能力中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种Na+/H+逆向转运蛋白Nha-K2及其编码基因与应用。该Na+/H+逆向转运蛋白Nha-K2编码基因具有序列表中SEQ ID NO.1第571-2058位核苷酸序列。本发明的Na+/H+逆向转运蛋白具有较高的逆向转运蛋白活性，将本发明的Nha-K2蛋白导入宿主菌中表达，可提高宿主菌耐盐的能力，也可将其转入农作物中，获得具有耐盐能力的转基因农作物以提高农作物适应性，在农作物育种中有重要的应用前景。
文档编号C12N1/21GK102492026SQ201110366059
公开日2012年6月13日 申请日期2011年11月17日 优先权日2011年11月17日
发明者王磊, 陈三凤, 陶丽, 高淼 申请人:中国农业大学