专利名称：一种生产2,3-丁二醇的方法及其专用地衣芽胞杆菌的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种生产2，3- 丁二醇的方法及其专用地衣芽胞杆菌。
背景技术：
2，3-丁二醇广泛应用于化工、食品、燃料及航天航空等多个领域(Appl Microbiol Biotechnol，2001，55(1) 10-18)。因其热值较高(27，200kJ/kg)，同乙醇(29, 100kJ/kg)相当，可用作燃料添加剂；可代替1，4_ 丁二醇，用于聚酯和聚亚安酯的合成；其脱水产物甲乙酮是一种低沸点溶剂，广泛应用于涂料、润滑剂、燃料等行业，同时又可作为有机合成香料、 抗氧化剂等的中间体；其脱水产物1，3-丁二烯可用来合成橡胶单体，是一种重要的石油化工基础有机原料；同甲乙酮缩合加氢形成辛烷，可用于生产高级航空用油。目前2，3-丁二醇的生产方法主要有化学合成法和微生物发酵法。化学法主要以石油裂解时产生的丁烯为原料，经过Hao的氧化及NaOH的作用后，在高温高压下水解得到几种不同种类的丁二醇，再通过减压分馏分离获得。相比于化学法，微生物发酵法具有环境友好，工艺简单等特点。自然界中具有2，3_ 丁二醇生产能力的细菌主要包括，克雷伯氏菌属(Klebsiella)、芽胞杆菌属(Bacillus)和肠杆菌属(Enterobacter)等(J Biotechnol, 1993,27(3) :317-329) 0目前，国内外发酵生产2，3-丁二醇的研究常用菌株多为克雷伯氏菌，但其潜在的致病性，限制了克雷伯氏菌在工业化生产中的应用。芽胞杆菌具有生物安全性，现已有多粘芽胞杆菌、地衣芽胞杆菌和枯草芽胞杆菌生产2，3-丁二醇的报道(CN201010026807. 1，CN101851598A, World J. Microbial. Biotechnol.，8，378-381)，但其发酵液浓度较低或发酵周期较长，限制了其在工业化生产中的应用。同时，已报道的2， 3- 丁二醇生产菌株发酵温度均为30 42°C，需要对培养基进行灭菌，造成了能源的浪费和营养的损失。嗜热的芽胞杆菌由于其具有较高的发酵温度(42 60°C )，大大减少了发酵过程中污染杂菌的机会。同时，以较高的温度进行发酵，可降低发酵液粘度，有利于后续处理步骤的操作，而且可以在培养基不灭菌的条件下进行发酵生产，降低了能耗和2，3_ 丁二醇的生产成本。经检索，未见利用嗜热的地衣芽胞杆菌生产2，3-丁二醇的方法报道。
发明内容
针对现有2，3_ 丁二醇生产方法中的技术难点及存在问题，本发明的目的在于提供一种生产2，3- 丁二醇的方法及其专用嗜热地衣芽胞杆菌。本发明所述嗜热地衣芽胞杆菌为地衣芽孢杆菌(Bacillus lichenif0rmis)5-2-D，其已于2011年11月2日保藏于中国典型培养物保藏中心(简称 CCTCC，湖北省武汉市武昌珞珈山)，保藏号为=CCTCC M 2011371。上述地衣芽胞杆菌(Bacilluslicheniformis) 5-2-D CCTCC M 2011371 菌株形态为棒杆状，长1. 5 μ m 3. 0 μ m，直径0. 6 μ m 0. 7 μ m，菌落颜色为黄色或白色，产芽孢，VP反应成阳性，可利用葡萄糖、蔗糖、果糖产酸，可水解酪蛋白、明胶、吐温80，可利用柠檬酸盐，可在含100g/L NaCl的培养基中生长，可在42 60°C条件下生长。上述地衣芽胞杆菌CCTCC M 2011371菌株的脂肪酸图谱是典型的芽孢杆菌的脂肪酸图谱。上述地衣芽胞杆菌CCTCC M 2011371菌株的16S rDNA序列(SEQ ID NO. 1所示) 与其他已知不同种的地衣芽孢杆菌的16S rDNA序列有99% 100%的相似性。上述地衣芽胞杆菌CCTCC M 2011371菌株可以在高糖(糖150克/升)LB培养基中生长。本发明所述生产2，3- 丁二醇的方法是以42 55°C、培搅拌养18 60小时为发酵条件，以葡萄糖为底物发酵上述地衣芽孢杆菌CCTCC M 2011371，得到2，3_ 丁二醇。具体步骤顺是(1)斜面培养将地衣芽孢杆菌CCTCC M 2011371菌种接种于含有1. 5 2衬％的琼脂的固体斜面培养基上，培养温度为42 55°C，培养时间为8 12小时；(2)种子培养将步骤(1)的斜面培养物，在无菌条件下接种到种子培养基中，培养温度为42 55°C，培养方式为旋转式摇床培养，转速为120转/分钟，培养时间8 12 小时；(3)发酵培养以5 10%的体积比的接种量，将步骤( 的种子培养液接入发酵培养基，培养温度为42 55°C，培养方式为搅拌培养，搅拌转速为200 400转/分钟，旋转半径为33mm，培养时间为18 60小时，制得含有2，3- 丁二醇的发酵培养液；(4)分离样品将步骤(3)的发酵液以8，000转/分钟离心10分钟，留取上清液， 得含有2，3-丁二醇的溶液；(5)样品检测取步骤的上清液，稀释，检测葡萄糖含量和2，3_ 丁二醇含量。其中，步骤⑴、⑵、(3)中所述的菌体培养温度优选是50 55°C。其中，步骤(1)中所述的菌体培养时间优选是8 10小时。其中，步骤O)中所述的菌体培养时间优选是11 12小时。其中，步骤(3)中所述的菌体培养时间优选是36 48小时。其中，上述种子培养基配方是葡萄糖30 50克/每升，酵母粉10 15克/每升，蛋白胨5 10克/每升，余量为水；pH为6 7。其中，上述发酵培养基配方是如下酵母粉5 20克/每升，蛋白胨5 20克/ 每升，玉米浆5 20克/每升，大豆肽5 20克/每升或大豆蛋白胨5 20克/每升，五种氮源中的至少一种；葡萄糖80-150克(初糖含量)/每升，磷酸二氢钾4克/每升，乙酸钠1克/每升，氯化钾2克/每升，其余为水；pH为6 7。上述发酵培养基不需灭菌。本发明的特点及有益效果是(1)本发明提供的嗜热的地衣芽孢杆菌CCTCC M 2011371是耐高糖且能高产2， 3-丁二醇的生物安全菌株；( 利用本发明提供的菌株以葡萄糖为底物，在本发明给出发酵条件下获得的2，3- 丁二醇最高浓度可达92克/升，生产强度可达2. 56克/升/小时； (3)本发明提供的生产2，3-丁二醇的方法充分利用高温发酵过程的优势，污染杂菌的机率小，且不对发酵培养基进行灭菌，减少了能量的消耗和营养物质的损失，同时实现了产量3/4页
高，生产强度大的目标。
具体实施例方式下面结合实施例对本发明的实质作进一步阐述，但本发明所保护的内容不仅限于此。实施例1 耐高糖并且能产2，3- 丁二醇菌株的筛选从果园等地取得土样，用筛选培养基浸泡池，在500mL锥形瓶中装浸泡液50mL，在 50°C条件下，置于摇床上以180r/min的转速培养M小时。将培养液以10_2、10_3、10_4、10_5、 10_6五个稀释度涂布在固体筛选培养基的培养皿中，50°C培养12h。挑单菌落，扩大培养，通过VP反应进行初筛。根据反应时间和颜色变化筛选出阳性菌株。筛选原理是2，3-丁二醇在碱性条件下氧化为双乙酰，与肌酸或胍类衍生物所合成红色物质，加入α -萘酚、肌酸可以促进反应。然后测定初筛的阳性细菌的2，3-丁二醇产量，挑选其中最高产量的菌株。其中得到的产量最高的菌株为地衣芽孢杆菌5-2-D。上述筛选培养基配方为1L蒸馏水中含150g葡萄糖，IOg蛋白胨，5g酵母粉，IOg NaCl, 115°C条件下灭菌20min。固体筛选培养基是在上述配方的基础上加入20g/L的琼脂粉。上述地衣芽孢杆菌5-2-D菌株形态为棒杆状，长1.5μπι 3. Ομπι，直径0. 6 μ m 0.7 μ m，菌落颜色为黄色或白色，产芽孢，VP反应成阳性，可利用葡萄糖、蔗糖、果糖产酸， 可水解酪蛋白、明胶、吐温80，可利用柠檬酸盐，可在含100g/L NaCl的培养基中生长，可在 42 60°C条件下生长。其脂肪酸图谱是典型的芽孢杆菌的脂肪酸图谱。其16S rDNA序列 (如SEQ ID NO. 1所示)与其他已知不同种的地衣芽孢杆菌的16S rDNA序列有99%-100% 的相似性。将上述地衣芽孢杆菌定名为地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis) 5-2-D，所述菌株已于2011年11月2日保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC，中国.武汉.武汉大学)，其保藏号为CCTCC M 2011371。实施例2 制备地衣芽孢杆菌CCTCC M 2011371菌株的细胞液体培养物挑取固体高糖LB培养基斜面培养的地衣芽孢杆菌CCTCC M 2011371菌株一环， 接种在装有灭菌的IOOmL高糖LB培养基的500mL锥形瓶中，在55°C条件下，置于摇床上以 180r/min的转速培养24h，即制得地衣芽孢杆菌CCTCC M 2011371菌株的细胞液体培养物。上述高糖LB培养基配方如下1L蒸馏水中含150g葡萄糖，IOg蛋白胨，5g酵母粉，IOg NaCl，115°C条件下灭菌15min。固体高糖LB培养基是在上述配方的基础上加入 20g/L的琼脂粉。实施例3 利用地衣芽孢杆菌CCTCC M 2011371菌株以发酵培养基1在锥形瓶中发酵生产2，3-丁二醇将通过实施例2获得的地衣芽孢杆菌CCTCC M 2011371菌株的细胞液体培养物以 50mL/L的接种量接种在装有灭菌的IOOmL发酵培养基的500mL锥形瓶中，在50°C条件下， 置于摇床上以"(^/!!!^！的转速培养，间隔处取样并检测？力-丁二醇含量，在第34h检测 2，3- 丁二醇的浓度达到56. 0g/L。在第60h将锥形瓶从摇床上取下停止发酵。上述发酵培养基1配方如下
葡萄糖120克/升，酵母粉10克/升，玉米浆5克/升，磷酸二氢钾4克/升，乙酸钠1克/升，氯化钾2克/升。实施例4 利用地衣芽孢杆菌CCTCC M 2011371菌株以发酵培养基2在锥形瓶中发酵生产2，3-丁二醇重复实施例3的操作，只是将发酵培养基1改为发酵培养基2，经检测第42h 2， 3-丁二醇的浓度达到67g/L。上述发酵培养基2配方如下葡萄糖140克/升，酵母粉10克/升，蛋白胨5克/升，磷酸二氢钾4克/升，乙酸钠1克/升，氯化钾2克/升。实施例5 利用地衣芽孢杆菌CCTCC M 2011371菌株以发酵培养基3在锥形瓶中发酵生产2，3-丁二醇重复实施例3的操作，只是将发酵培养基1改为发酵培养基3，经检测第32h 2， 3- 丁二醇的浓度达到52. Og/L。上述发酵培养基3配方如下葡萄糖120克/升，玉米浆10克/升，蛋白胨5克/升，磷酸二氢钾4克/升，乙酸钠1克/升，氯化钾2克/升。实施例6 利用地衣芽孢杆菌CCTCC M 2011371菌株以发酵培养基2在5L发酵罐中发酵生产2，3-丁二醇将通过实施例2获得的地衣芽孢杆菌CCTCC M 2011371菌株的细胞液体培养物以体积百分比10%的接种量接种在装有未灭菌的4L发酵培养基2的5L发酵罐中，在55°C条件下，发酵罐搅拌转速400r/min，通气量为0. 5vvm 1. Ovvm,发酵36h。经检测可得到浓度为92克/升的2，3- 丁二醇发酵液。上述发酵培养基2配方如下葡萄糖140克/升，酵母粉10克/升，蛋白胨5克/升，磷酸二氢钾4克/升，乙酸钠1克/升，氯化钾2克/升。
权利要求
1.一株地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis) 5-2-D，所述菌株已于2011年11月 2日保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏号为CCTCC M 2011371。
2.一种生产2，3- 丁二醇的方法，是以42 55°C、培搅拌养20 60小时为发酵条件， 以葡萄糖为底物发酵权利要求1所述地衣芽孢杆菌CCTCC M 2011371，得到2，3_ 丁二醇。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于所述发酵条件是培养温度为50 55°C； 培养时间为36 48小时；搅拌转速为200 400转/分钟，旋转半径为33mm。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述发酵培养基配方是如下酵母粉5 20克/每升，蛋白胨5 20克/每升，玉米浆5 20克/每升，大豆肽5 20克/每升或大豆蛋白胨5 20克/每升，五种氮源中的至少一种；葡萄糖80-150克/每升，磷酸二氢钾4克/每升，乙酸钠1克/每升，氯化钾2克/每升，其余为水；pH为6 7。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于所述发酵培养基不需灭菌。
6.根据权利要求2所述的方法，其特征在于发酵培养前，先将地衣芽孢杆菌CCTCCM 2011371接入种子培养基中，在42 55°C，以转速为120转/分钟，培养时间8 12小时后，再接入发酵培养基；其中，所述种子培养基配方是葡萄糖30 50克/每升，酵母粉 10 15克/每升，蛋白胨5 10克/每升，余量为水；pH为6 7。
全文摘要
本发明公开了一株地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)5-2-D及利用其以42～55℃、培搅拌养20～60小时为发酵条件，以葡萄糖为底物发酵生产2，3-丁二醇的方法。本发明提供的生产2，3-丁二醇的方法充分利用高温发酵过程的优势，污染杂菌的机率小，且不对发酵培养基进行灭菌，减少了能量的消耗和营养物质的损失，同时获得的2，3-丁二醇最高浓度可达92克/升，生产强度可达2.56克/升/小时。
文档编号C12N1/20GK102391970SQ20111036915
公开日2012年3月28日 申请日期2011年11月18日 优先权日2011年11月18日
发明者张丽杰, 李理想, 许平, 马翠卿 申请人:山东大学