专利名称：一种耐重金属的植物内生细菌及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于农业和环境污染治理技术领域，涉及一种耐重金属的植物内生细菌及其应用。
背景技术：
土壤重金属污染及其修复研究是关系土壤资源可持续利用的重大问题。利用植物进行污染土壤的生物修复侧重于治理污染与景观美化、生态恢复和重建、可持续发展，受到国内外政府、高校、研究机构和商业化企业的广泛关注和重视。植物修复技术包括植物稳定、植物挥发和植物提取。但植物修复技术的开展对超积累植物的筛选与生长依赖较大，治理效果取决于超积累植物对重金属的提取和固定效果。目前大多超积累植物生长慢、周期长、生物量小、对金属有选择性，制约了植物修复技术的发展。如何促进超积累植物生长、提高重金属吸收是植物修复技术中的关键。微生物可以促进超积累植物生长、提高重金属吸收。其中植物内生细菌作为一类特殊的与植物共生菌类，其在植物修复中的应用得到了研究者的关注。植物内生菌是植物在漫长的进化过程中获得的有益的微生物类群，对植物抵抗外界不良环境的有重要作用。一些研究者发现与豆科植物内共生的根瘤菌(Miizobium)或伯克霍尔德氏菌 (Burkholderia)的一些菌种能够产生植物激素促进大豆生长，并且提高了大豆对重金属的吸收。Sheng等从污染农田土壤中重金属耐性油菜根和茎内分离筛选到一株具重金属抗性和植物促生效应的内生细菌——荧光假单胞菌O^seudomonas fluorescens) GlO。这些内生微生物将有助于提高植物富集重金属的效能，在植物修复重金属污染土壤中具有应用潜力。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术的上述不足，提供一种耐重金属的植物内生细菌。本发明的另一目的是提供含有该细菌的生物修复制剂。本发明的又一目的是提供该细菌和生物修复制剂的应用。本发明的目的可通过如下技术方案实现一种植物内生细菌 Y1-3-9，分类命名为 Pseudomonas thivervalensis Y1-3-9， 保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2011年7月沈日，菌种保藏号为CCTCC NO M2011251。该植物内生细菌Y1-3-9是从中国江西省某铜尾矿区生长的石香薷(Mosla chinensis)叶中分离得到，经鉴定为Pseudomonas thivervalensis。主要生物学特性为 G_，幼龄时菌体为杆状，无芽孢。甲基红(M.R.)试验、乙酰甲基醇(V. P.)试验、淀粉水解阴性；柠檬酸盐试验、过氧化氢酶试验阳性。LB培养基上生长良好，单个菌落圆形，边缘整齐， 直径1 3mm，白色，不透明。一种含有所述的保藏号为CCTCC NO =M 2011251的植物内生细菌Yl_3_9的生物修复制剂。
所述的生物修复制剂优选为液体制剂，其中含有保藏号为CCTCC NO =M 2011251 的Y1-3-9菌株有效活菌数为10亿个/毫升以上。所述的液体制剂是通过常规的液体深层发酵方法发酵Y1-3-9菌株制备得到。所述的生物修复制剂还可优选为固体制剂，其中含有保藏号为CCTCC NO =M 2011251的Y1-3-9菌株有效活菌数为2亿个/克以上。所述的固体制剂是使用草炭、蛭石或其他载 体吸附保藏号为CCTCC NO :M2011251 的Y1-3-9菌株发酵液配制成颗粒剂或粉剂。所述的保藏号为CCTCC NO =M 2011251的Yl_3_9菌株在土壤重金属污染的植物修
复中的应用。所述的含Υ1-3-9菌株的生物修复制剂在土壤重金属污染的植物修复中的应用。一种所述的含Υ1-3-9菌株的生物修复制剂用于土壤重金属污染的植物修复方法在含重金属的湿润土壤中播种植物种子，接种Υ1-3-9菌株生物修复制剂，每亩接种IO8 个细菌/mL的菌液44kg，分1-2次接种。有益效果本发明所述的植物内生细菌Y1-3-9菌株能耐受多种重金属(Cu、Pb、Cd、Ni的最小抑制浓度分别为3. 1、4. 8、4. 5、1. 7mM)。本发明所述的植物内生细菌及其强化植物土壤重金属污染修复的方法与现有技术相比有如下优点(1)本发明所述的 Y1-3-9 菌株具有 ACC 脱氨酶(l-aminocyclopropane-l-carbox ylic acid deaminase)活性，酶活性最高可达251 μ M α -KB · h-1 · mg—1 ；高产铁载体，有助于提高植物抗逆性(抗旱、抗涝、抗盐碱、抗病虫害)；该菌株能产生吲哚乙酸，IAA最高产量可达18mg · Γ1 ；具有溶磷特性，有助于促进植物生长。(2)利用植物内生细菌促进植物生长，提高植物提取修复效率。(3)可以回收重金属，无二次污染。生物样品保藏信息植物内生细菌Y1-3-9，分类命名为Pseudomonas thivervalensis Y1-3-9，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉武汉大学，保藏日期为2011年7月沈日， 菌种保藏号为CCTCC NO =M 2011251。
具体实施例方式实施例1本发明耐重金属的植物内生细菌Y1-3-9菌株从石香薷(Mosla chinensis)叶中分离纯化得到，分离鉴定方法如下先用自来水将石香薷叶片表面清洗干净，然后用无菌水清洗一遍，接着用75%乙醇浸泡消毒5min，无菌水冲洗后再浸入2. 5%次氯酸钠溶液中消毒5min，无菌水冲洗数遍。 将表面消毒的叶片置于研钵内研磨至勻浆，取0. Iml勻浆液涂布于LB平板(蛋白胨10g， 酵母膏5g, NaCl 10g,7jC lOOOmL，琼脂20g, pH 7. 0) 培养3d，挑取单菌落在LB平板上划线纯化后保存。将菌株接种于LB培养液中，30°C摇床振荡培养18h，取1. OmL菌液于 Eppendorf离心管中，IOOOOrpm离心5min收集菌体，按常规方法提取细菌总DNA，PCR扩增细菌16S rDNA,扩增产物经测序后与GenBank中已知16S rDNA序列进行比对分析，与 Pseudomonas thivervalensis的16S rDNA序列相似性达到99%，将其鉴定为这个种。实施例2将Yl-3-9 (CCTCC NO =M 2011251)划线接种于含不同重金属浓度的LB培养基， 30°C培养3d，观察其能否生长及生长情况。结果见表1。Y1-3-9菌株能耐受多种重金属 (Cu、Pb、Cd、Ni 的最小抑制浓度分别为 3. 1,4. 8,4. 5,1. 7mM)。表1菌株在含不同重金属浓度的LB培养基上的生长情况
权利要求
1.一种植物内生细菌 Y1-3-9，分类命名为 Pseudomonas thivervalensis Y1-3-9，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2011年7月沈日，菌种保藏号为CCTCC NO M2011251。
2.一种含有权利要求1所述的保藏号为CCTCC NO =M 2011251的植物内生细菌Y1-3-9 的生物修复制剂。
3.根据权利要求2所述的生物修复制剂，其特征在于该生物修复制剂为液体制剂，其中含有保藏号为CCTCC NO =M 2011251的Y1-3-9菌株有效活菌数为10亿个/毫升以上。
4.根据权利要求3所述的生物修复制剂，其特征在于所述的液体制剂是通过常规的液体深层发酵方法发酵Y1-3-9菌株制备得到。
5.根据权利要求2所述的生物修复制剂，其特征在于该生物修复制剂为固体制剂，其中含有保藏号为CCTCC NO =M 2011251的Y1-3-9菌株有效活菌数为2亿个/ 克以上。
6.根据权利要求5所述的生物修复制剂，其特征在于所述的固体制剂是使用草炭、蛭石或其他载体吸附保藏号为CCTCC NO =M 2011251的Y1-3-9菌株发酵液配制成颗粒剂或粉剂。
7.权利要求1所述的保藏号为CCTCCNO =M 2011251的Y1-3-9菌株在土壤重金属污染的植物修复中的应用。
8.权利要求2所述的Y1-3-9菌株的生物修复制剂在土壤重金属污染的植物修复中的应用。
9.一种权利要求2所述的含Y1-3-9菌株的生物修复制剂用于土壤重金属污染的植物修复方法，其特征在于在含重金属的湿润土壤中播种植物种子，接种Y1-3-9菌株生物修复制剂，每亩接种IO8个细菌/mL的生物修复制剂44kg，分1-2次接种。
全文摘要
本发明属于农业和环境污染治理技术领域，涉及一种耐重金属的植物内生细菌及其应用。保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2011年7月26日，菌种保藏号为CCTCC NOM 2011251。该菌株液体制剂含有有效活菌数为10亿个以上/毫升，固体制剂含有效活菌数2亿个以上/克。该菌株对溶液中沉淀态铜有良好的活化作用，活化率达到73％以上。在含重金属的湿润土壤中种植植物，接种生物修复制剂，促进植物对重金属铜的吸收提取，提高植物提取修复效率。
文档编号C12N11/14GK102391973SQ20111037769
公开日2012年3月28日 申请日期2011年11月24日 优先权日2011年11月24日
发明者何琳燕, 张文辉, 张艳峰, 盛下放, 黄智 申请人:南京农业大学