专利名称：一种生防菌株及其毒素的提取工艺及其用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种控制以加工番茄、甜瓜、向日葵等经济作物的寄生性杂草列当发生的生防菌株及其毒素的用途以及该菌株毒素的适用于工业化生产的提取工艺方法，特别是一种瓜果腐霉菌及其毒素的用途和该菌株毒素的提取工艺和用途。
背景技术：
新疆种植的加工番茄因红色素、谷维素含量高，霉菌少，黏度好，是制作加工番茄制品的上等原料，因而番茄产品在国际市场上非常有竞争力。2009年新疆种植加工番茄近 120万亩，占全国种植面积的75%以上，新疆已成为我国最主要的加工番茄种植和加工基地。哈密瓜是新疆的著名特产，以优良的品质风味深受消费者喜爱，曾被誉为瓜中珍品而名扬国内外。随着产业结构调整，哈密瓜、西瓜面积大幅度增加，2007年全疆种植面积达到了 55万亩，产品品质也明显提高。此外，打瓜、向日葵、甜叶菊等农作物是阿勒泰、塔城等地重要的经济作物，是这些地区农场和农民的主要经济收入来源。但这些农作物都无一例外地受到了根寄生性种子植物列当的严重危害，并造成严重经济损失。列当属列当科，全世界约有100种，我国有23种，其中危害最严重的有2种，分别为向日葵列当和埃及列当(瓜列当)，这2种列当寄主范围非常广泛，可寄生瓜类、葫芦、茄科植物、烟草、胡萝卜、白菜、洋葱以及一些杂草等共计17科近百种寄主植物，其没有自己的叶绿素，全靠用吸盘在寄主根部截流寄主的水分和营养成分维持自己生长，当寄主被寄生后，植株生长缓慢、矮化、黄化、萎蔫或枯死，给农作物产量和品质造成严重损失。据关洪江的调查，每株向日葵寄生5株列当，向日葵株高降低10. 6%，茎粗降低39.沈％，单株产量降低 63. 76% ；每株向日葵寄生10 20株，花盘直径降低21. 7%，百粒重降低18. 0%，结实率降低 8.8%，产量降低67.72%-74.26%。单株寄生超过51株以上则可直接导致向日葵绝收。其寄生在瓜根部后，可导致寄主因缺乏水分和养分不能正常生长发育。瓜叶片发黄、瘦小，茎蔓细弱，生长发育迟缓，生长期较正常缩短15-20天，提前出现衰老症状。在座果期和果实膨大期，受其影响，果实不能正常膨大，时间一到就定型成熟，直接影响单果的重量，导致西、 甜瓜总产的直接下降，轻者减产40%，严重者甚至绝收。收获的果实肉硬、水分少，含糖量降低，适口性极差。列当的生育期非常短，完成一个生育期仅需要30天左右，每棵列当可产生种子5 万 10万粒，最多达45万粒。落入土中的种子，在5 10 cm深的土层中可存活5 10 年，条件适宜时甚至可存活30年以上，故列当一旦定植，无数种子散落到田间就很难清除， 且列当种子的萌发和寄生过程是在地下完成的，其最初危害不被人觉察，当田内长出植株时，寄主已经受害，因此对根寄生杂草列当的有效防治已经成为新疆加工番茄、哈密瓜、向日葵等多种经济作物生产过程中迫切需要解决的问题。对列当的防治，目前主要是以加强检疫防治其传入新区和培育抗列当品种为主的综合防治措施。然而，列当繁殖种子的能力非常强，一株列当可繁殖近10万粒种子，而且可在土壤中存活10年以上，甚至有资料表明其可以存活50年，而且在条件适宜的时候可以终年萌发，因此对已有列当发生的区域，寻找合适的防治方法就显得尤为重要。对列当已发生区域，目前的防治思路主要有2种，针对土壤中已经存在列当种子的情况，进行轮作倒茬使其找不到合适寄主而不能萌发，通过多年轮作最后使列当种子在土壤中死亡，或是寻找能诱发列当种子提前萌发的天然诱发刺激物，将其提前诱发出来后由于找不到合适的寄主致使其提前死亡，或者是种植诱集植物，诱发其提前出土死亡。但这些措施较为麻烦，长期轮作在许多地区难以实施，喷洒天然刺激物或者种植诱集植物因不能将列当种子一次性全部诱发出来，而列当繁殖能力非常强，一旦有少量存活，就能产生大量后代，因此防治效果不明显。另一种防治列当的思路为其萌发后的防治，如筛选抗列当的品种、人工拔除、增施鸡粪等有机肥、涂抹机油或将都尔+草甘膦+水按1 :3 40或1 4 50复配后对列当进行涂抹等措施来进行防治，但这些措施存在操作困难或成本较
高等缺点而难以实施。如培育抗病品种难度很大、费时很长，一旦列当生理小种发生变化将会失去防治效用。而用除草剂涂抹或者喷洒，具有费工、费力和安全性较差等缺点。因此筛选出能够损伤列当而对列当寄主安全的致病菌作为生防因子来防治列当至关重要。从新疆生病列当中选择高效防病生防菌株，开发适宜于新疆特殊地理气候条件下使用的新的生物农药，不但可以很好地控制以加工番茄、甜瓜及向日葵为主的经济作物上的寄生性杂草的发生，还会保证新疆农业和经济可持续发展，同时将会取得良好的经济和生态效益。
发明内容
本发明的目的是提供一种适宜于新疆独特地理气候条件的、特别是可以很好地用于防治以加工番茄、甜瓜及向日葵为主的经济作物的根寄生性杂草列当发生的生防菌株， 还提供一种该生防菌株毒素适于工业化规模生产的、经济实用、低成本的提取工艺方法。本发明公开了一种防治列当的生防菌株，所述生防菌株为瓜果腐霉菌。所述的瓜果腐霉菌是从新疆自然死亡的列当植株上分离获得。本发明还公开了一种防治列当的瓜果腐霉菌毒素的提取工艺，其特征是提取工艺过程如下
将保存在斜面上的瓜果腐霉菌在PDA平板上活化M 48h，挑取菌块在PD培养基中摇培48 后，收集菌丝，用乙酸乙酯溶液在超声循环提取仪中萃取3 4次后旋蒸浓缩， 将粗提物用5% 8%NaHN03溶液萃取3 4次，然后转入乙醚溶液中，收取水相，调节pH至 2. 95 3. 05，将提取物用石油醚溶液萃取3 4次，收集水相将其用乙酸乙酯萃取3 4 次，将乙酸乙酯相减压浓缩后甲醇定容即可。所述超声循环提取仪可以是HF-2B超声循环提取仪。参照图1一图3，经实验结果表明所述毒素为邻苯二甲酸二甲酯。本发明所公开的防治列当的生防菌株及其毒素的用途，是利用生防菌株即瓜果腐霉菌，及毒素即邻苯二甲酸二甲酯用于控制和防治根寄生性杂草列当的发生。所述的根寄生性杂草是指寄生在加工番茄、甜瓜、西瓜、籽瓜、南瓜、豇豆、向日葵、 辣椒中的一种，尤其是新疆地区寄生在哈密瓜上的瓜列当的防治。经试验证明，采用本发明的发酵菌液喷施列当3次后，列当死亡率达到80%以上， 处理组寄主作物与对照相比，差异不显著。采用本发明的毒素喷施列当1次后，列当死亡率达到100%，处理组与对照寄主相比，差异不显著。说明筛选获得的生防菌株或毒素对列当有较好的防治作用。从新疆自然死亡的130株列当病样中分离得到的105个菌株，经离体接种、盆栽实验获得对列当有较好防治效果且对寄主安全的4个菌株，其中一个菌株HN4-0对列当的防治效果最好，通过形态学及分子鉴定为瓜果腐霉/^iAi腫aphanidermatum (Edson) Fitzp0在列当发生严重的种植田中对本发明的毒素进行盆栽和大田实验，把本发明的毒素以不同的比例与水混合喷施列当，结果显示均显示使用本发明的毒素以体积比1:10与水混合处理列当1次，列当的发病率达到100%，列当的病情指数达到93. 9%，处理组寄主与对照差异不显著。对于获得的粗毒素进行对列当致病性和对寄主安全性测定，结果显示用乙酸乙酯萃取得到的粗毒素活性最高，对列当的致病性达到100%，且对寄主安全。对经过乙酸乙酯萃取获得的粗毒素进行气相色谱-质谱分析，测定结果显示粗毒素的主要成分为邻苯二甲酸二甲酯。明确了腐霉菌粗毒素HN4-0防治列当的最适浓度。通过盆栽，小区和大田实验，分别将所提取的毒素稀释10倍、20倍、50倍、100倍、200倍以及500倍，将所稀释的毒素喷洒在列当上后，所有浓度均可对列当造成抑制。2011年在淖毛湖农场20亩地中进行了试验示范，试验示范结果为稀释10倍的毒素抑制率最高，抑制率达到100%，喷洒M小时后，病情指数为93. 9，稀释20倍的毒素抑制率次之，抑制率达到98. 9%，喷洒M小时后，病情指数为79. 4，其余浓度对列当生长也有抑制，但效果有所下降，考虑到防治成本和防治效果，确定提取的毒素以稀释20倍进行大田应用效果最佳(参见图5中表格)。试验证明，本发明提供了一种适宜于新疆特殊地理气候条件的、特别是可以很好地控制以加工番茄、甜瓜及向日葵为主的经济作物的寄生性杂草列当发生的生防菌株和毒素，并且提供了该生防菌株及其毒素的适于工业化规模生产的工艺方法，为开发适宜于新疆特殊地理气候条件下使用的新的生物农药，特别是控制以加工番茄、甜瓜及向日葵为主的经济作物上的寄生性杂草列当发生的生物农药提供了基础条件。与现有技术相比，本发明的优点是适宜于新疆独特地理气候条件，特别是可以很好地控制以加工番茄、甜瓜及向日葵为主的经济作物的根寄生性杂草列当发生，利用所述该生防菌株及其毒素防治列当经济高效，可以对列当的生长有效抑制，并大大节约防治成本。所提供的生防菌株毒素提取工艺方法适用于工业化规模生产、经济实用。
图1、图2为本发明实施例1中的邻苯二甲苯二甲酸及毒素的高效液相色谱图。图 1中所示为标准品邻苯二甲酸二甲酯的高效液相色谱图，出峰保留5. 307分钟；图2为所提取的生防菌株毒素的高效液相色谱图，出峰保留5. 343分钟。图3为本发明实施例1中邻苯二甲酸二甲酯与所提取的生防菌株毒素混合后的高效液相色谱图，出峰保留5. 342分钟。图4为本发明实施例1生防菌株毒素提取物质谱图。图5为腐霉菌HN4-0的粗毒素防治列当的不同浓度的防治效果表格。
具体实施方式
实施例1
参照图1一图5，一种防治列当的生防菌株为瓜果腐霉菌，所述的瓜果腐霉菌是从新疆自然死亡的列当植株上分离获得，利用所述瓜果腐霉菌株发酵液针对寄生在哈密瓜列当的防治
在接种列当种子的网室中进行对比测定用本发明的瓜果腐霉菌株发酵液进行试验。 结果显示使用本发明的发酵菌液处理列当3次后，列当的发病率达到89. 10%，列当的病情指数为0.6719。试验组与对照组寄主差异不显著。实施例2
与实施例1相比，本实施例不同地方在于2010年7月，在列当严重发生的加工番茄种植田中进行对比测定用本发明的瓜果腐霉菌株发酵液进行试验。结果显示使用本发明的发酵菌液处理列当2次后，列当的发病率达到81. 40%，列当的病情指数达到36. 57，试验组与对照组寄主差异不显著。实施例3
与实施例1相比，本实施例不同地方在于2011年7月，在列当严重发生的籽瓜种植田中进行对比测定用本发明的瓜果腐霉发酵液进行试验。结果显示使用本发明的菌液处理列当2次后，列当的发病率达到92. 20%，病情指数为56. 11，试验组与对照组寄主差异不
显者ο实施例4
与实施例1相比，本实施例的不同之处在于
利用所述防治列当的瓜果腐霉菌所提取的毒素进行向日葵列当的防治，所述的防治列当的瓜果腐霉菌毒素提取工艺过程如下
将保存在斜面上的瓜果腐霉菌在PDA平板上活化Mh，挑取菌块在PD培养基中摇培 7 后，收集菌丝，用乙酸乙酯溶液在HF-2B超声循环提取仪中萃取3次后旋蒸浓缩，将粗提物用5%NaHN03溶液萃取3次，然后转入乙醚溶液中，收取水相，调节pH至3. 0，将提取物用石油醚溶液萃取3次，收集水相将其用乙酸乙酯萃取3次，将乙酸乙酯相减压浓缩后甲醇定容即可。
参照图1一图4，所述毒素为邻苯二甲酸二甲酯。在列当发生严重的向日葵种植田中对本发明的毒素进行盆栽和大田实验，把本发明的毒素以不同的比例与水混合喷施列当，结果显示均显示使用本发明的毒素以体积比 1 10与水混合处理列当1次，列当的发病率达到100%，列当的病情指数达到93. 9%，处理组寄主与对照差异不显著。实施例5
与实施例4相比，本实施例的不同之处在于
利用所述防治列当的瓜果腐霉菌所提取的毒素针对寄生在籽瓜上的列当的防治，所述的防治列当的瓜果腐霉菌毒素提取工艺过程如下
将保存在斜面上的瓜果腐霉菌在PDA平板上活化35h，挑取菌块在PD培养基中摇培 60h后，收集菌丝，用乙酸乙酯溶液在HF-2B超声循环提取仪中萃取4次后旋蒸浓缩，将粗提物用6%NaHN03溶液萃取4次，然后转入乙醚溶液中，收取水相，调节pH至3. 0，将提取物用石油醚溶液萃取3次，收集水相将其用乙酸乙酯萃取3次，将乙酸乙酯相减压浓缩后甲醇定容即可。实施例6
与实施例4相比，本实施例的不同之处在于
利用所述防治列当的瓜果腐霉菌所提取的毒素针对寄生在籽瓜上的列当的防治，所述的防治列当的瓜果腐霉菌毒素提取工艺过程如下
将保存在斜面上的瓜果腐霉菌在PDA平板上活化^h，挑取菌块在PD培养基中摇培 7 后，收集菌丝，用乙酸乙酯溶液在HF-2B超声循环提取仪中萃取4次后旋蒸浓缩，将粗提物用7%NaHN03溶液萃取3次，然后转入乙醚溶液中，收取水相，调节pH至2. 95，将提取物用石油醚溶液萃取4次，收集水相将其用乙酸乙酯萃取3次，将乙酸乙酯相减压浓缩后甲醇定容即可。实施例7:
与实施例4相比，本实施例的不同之处在于
利用所述防治列当的瓜果腐霉菌所提取的毒素针对寄生在西瓜上的列当的防治，所述的防治列当的瓜果腐霉菌毒素提取工艺过程如下
将保存在斜面上的瓜果腐霉菌在PDA平板上活化40h，挑取菌块在PD培养基中摇培 84h后，收集菌丝，用乙酸乙酯溶液在HF-2B超声循环提取仪中萃取3次后旋蒸浓缩，将粗提物用8%NaHN03溶液萃取3次，然后转入乙醚溶液中，收取水相，调节pH至3. 05，将提取物用石油醚溶液萃取3次，收集水相将其用乙酸乙酯萃取4次，将乙酸乙酯相减压浓缩后甲醇定容即可。实施例8
与实施例4相比，本实施例的不同之处在于
利用所述防治列当的瓜果腐霉菌所提取的毒素针对寄生在辣椒上的列当的防治，所述的防治列当的瓜果腐霉菌毒素提取工艺过程如下
将保存在斜面上的瓜果腐霉菌在PDA平板上活化45h，挑取菌块在PD培养基中摇培后，收集菌丝，用乙酸乙酯溶液在HF-2B超声循环提取仪中萃取3次后旋蒸浓缩，将粗提物用5%NaHN03溶液萃取3次，然后转入乙醚溶液中，收取水相，调节pH至3. 0，将提取物用石油醚溶液萃取3次，收集水相将其用乙酸乙酯萃取3次，将乙酸乙酯相减压浓缩后甲醇定容即可。实施例9
与实施例4相比，本实施例的不同之处在于
利用所述防治列当的瓜果腐霉菌所提取的毒素针对寄生在西瓜上的列当的防治，所述的防治列当的瓜果腐霉菌毒素提取工艺过程如下
将保存在斜面上的瓜果腐霉菌在PDA平板上活化Mh，挑取菌块在PD培养基中摇培 6 后，收集菌丝，用乙酸乙酯溶液在HF-2B超声循环提取仪中萃取3次后旋蒸浓缩，将粗提物用6%NaHN03溶液萃取3次，然后转入乙醚溶液中，收取水相，调节pH至3. 0，将提取物用石油醚溶液萃取3次，收集水相将其用乙酸乙酯萃取3次，将乙酸乙酯相减压浓缩后甲醇定容即可。实施例10
与实施例4相比，本实施例的不同之处在于利用所述防治列当的瓜果腐霉菌所提取的毒素针对寄生在甜瓜上的列当的防治，所述的防治列当的瓜果腐霉菌毒素提取工艺过程如下
将保存在斜面上的瓜果腐霉菌在PDA平板上活化38h，挑取菌块在PD培养基中摇培 80h后，收集菌丝，用乙酸乙酯溶液在HF-2B超声循环提取仪中萃取3次后旋蒸浓缩，将粗提物用6%NaHN03溶液萃取3次，然后转入乙醚溶液中，收取水相，调节pH至3. 0，将提取物用石油醚溶液萃取3次，收集水相将其用乙酸乙酯萃取3次，将乙酸乙酯相减压浓缩后甲醇定容即可。实施例11
与实施例4相比，本实施例的不同之处在于
利用所述防治列当的瓜果腐霉菌所提取的毒素针对寄生在南瓜上的列当的防治，所述的防治列当的瓜果腐霉菌毒素提取工艺过程如下
将保存在斜面上的瓜果腐霉菌在PDA平板上活化40h，挑取菌块在PD培养基中摇培 9 后，收集菌丝，用乙酸乙酯溶液在HF-2B超声循环提取仪中萃取3次后旋蒸浓缩，将粗提物用5%NaHN03溶液萃取4次，然后转入乙醚溶液中，收取水相，调节pH至3. 0，将提取物用石油醚溶液萃取3次，收集水相将其用乙酸乙酯萃取3次，将乙酸乙酯相减压浓缩后甲醇定容即可。实施例12
与实施例4相比，本实施例的不同之处在于
利用所述防治列当的瓜果腐霉菌所提取的毒素针对寄生在豇豆上的列当的防治，所述的防治列当的瓜果腐霉菌毒素提取工艺过程如下
将保存在斜面上的瓜果腐霉菌在PDA平板上活化挑取菌块在PD培养基中摇培 50h后，收集菌丝，用乙酸乙酯溶液在HF-2B超声循环提取仪中萃取4次后旋蒸浓缩，将粗提物用6%NaHN03溶液萃取3次，然后转入乙醚溶液中，收取水相，调节pH至3. 0，将提取物用石油醚溶液萃取4次，收集水相将其用乙酸乙酯萃取4次，将乙酸乙酯相减压浓缩后甲醇定容即可。
权利要求
1.一种防治列当的生防菌株，其特征在于所述生防菌株为瓜果腐霉菌。
2.如权利要求1所述的防治列当的生防菌株，其特征在于所述的瓜果腐霉菌是从新疆自然死亡的列当植株上分离获得。
3.一种防治列当的瓜果腐霉菌毒素的提取工艺，其特征是提取工艺过程如下将保存在斜面上的瓜果腐霉菌在PDA平板上活化M 48h，挑取菌块在PD培养基中摇培48 后，收集菌丝，用乙酸乙酯溶液在超声循环提取仪中萃取3 4次后旋蒸浓缩，将粗提物用5% 8%NaHN03溶液萃取3 4次，然后转入乙醚溶液中，收取水相，调节pH 至2. 95 3. 05，将提取物用石油醚溶液萃取3 4次，收集水相将其用乙酸乙酯萃取3 4次，将乙酸乙酯相减压浓缩后甲醇定容即可。
4.如权利要求3所述的防治列当的瓜果腐霉菌毒素的提取工艺，其特征在于所述毒素为邻苯二甲酸二甲酯。
5.一种防治列当的生防菌株及其毒素的用途，其特征在于利用生防菌株即瓜果腐霉菌，及毒素即邻苯二甲酸二甲酯用于控制和防治根寄生性杂草列当的发生。
6.如权利要求5所述的防治列当的生防菌株及其毒素的用途，其特征在于所述的根寄生性杂草是指寄生在加工番茄、甜瓜、西瓜、籽瓜、南瓜、豇豆、向日葵、辣椒、哈密瓜中的一种。
全文摘要
本发明公开了一种防治列当的生防菌株为瓜果腐霉菌，以及瓜果腐霉菌毒素的提取工艺，即将保存在斜面上的瓜果腐霉菌在PDA平板上活化，挑取菌块在PD培养基中摇培后收集菌丝，用乙酸乙酯溶液在超声循环提取仪中萃取后旋蒸浓缩，将粗提物用NaHNO3溶液萃取，然后转入乙醚溶液中，收取水相，调节pH将提取物用石油醚溶液萃取，再收集水相并用乙酸乙酯萃取，将乙酸乙酯相减压浓缩后甲醇定容即可；还公开了所述生防菌株及其毒素的用途即用于控制和防治根寄生性杂草列当的发生。本发明适宜于新疆独特地理气候条件、有效地用于防治经济作物的根寄生性杂草列当的发生,所述提取工艺适于工业化规模生产、经济实用、成本低。
文档编号C12R1/645GK102517219SQ201110388820
公开日2012年6月27日 申请日期2011年11月30日 优先权日2011年11月30日
发明者丁丽丽, 姚兆群, 张学坤, 杜娟, 赵思峰 申请人:石河子大学