专利名称：鞘脂激活蛋白原作为效应标志物在检测多氯联苯雄性生殖毒性的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及鞘脂激活蛋白原，尤其是涉及鞘脂激活蛋白原作为效应标志物在检测多氯联苯雄性生殖毒性的应用。
背景技术：
多氯联苯(Polychlorinated Biphenyls, PCBs)是一类人工合成的有机物。根据氯原子取代数和取代位置的不同共有209种同族异构体。由于PCBs具有良好的化学惰性、抗热性、不可燃性和高介电常数等优点，早期曾用于热介质、特殊润滑油、可塑剂、涂料、 防尘剂、油墨添加剂、杀虫剂及复写纸等的制造和在电容器、变压器等电力设备中作为绝缘油。随着PCBs的不断应用，在环境中的积累不断增加。而且PCBs—旦进入环境，极难降解， 在整个生态系统中循环传输，从而造成“全球性的环境污染”。由于PCBs脂溶性较高，易于在脂肪组织中蓄积，沿食物链逐级富集和放大，在含脂量的脏器中含量明显要高，在生物体内的富集系数高达105。人类暴露于PCBs主要是通过摄食含有PCBs的鱼类肉类和乳制品等，PCBs进入体内会通过血液转运到肝脏、肌肉和脂肪，并在那逐渐累积，产生积累性中毒， 严重影响人类健康。现有的研究表明，雄性生殖系统是PCBs作用的重要靶器官之一，PCBs对生精细胞、支持细胞和间质细胞均可产生明显的毒性效应。但现有的结果因为1)动物实验染毒剂量远远高于生物体和自然环境中的暴露剂量，无法估计真实的人群效应；2)PCBs各种睾丸毒性效应产生的分子机制模糊不清，大量人群流行病学调查得到的提示信息没有后续实验的支持；幻细胞、动物和人群3个层次的研究结果契合度不高。由于上述原因，目前尚未找到环境水平PCBs暴露对雄性动物生殖系统是否产生毒性作用的检测方法。生物标志物(biomarker)是用于监测和评价能够导致生物有机体的生物化学和生理学改变的化学污染物。生物标志物在亚个体和个体水平上既可以测定污染物暴露水平，也可以测定污染物效应的生理和生化指标。生物标志物是生物体受到严重损害之前， 在不同生物学水平(分子、细胞、个体等)上因受环境污染物影响而异常化的信号指标，它可以对严重毒性伤害提供早期警报。生物标志物从功能上一般分为接触(暴露)生物标志物；效应生物标志物；敏感性生物标志物([8]Biological markers in environmental health research. Committee on Biological Markers of the National Research Council [J], Environ Health Perspect，1987，74 :3_9)。作为生物标志物一般必须具有以下一些特性1)具有一定的敏感性，敏感性应高于一般生物检测指标，低剂量下就可测出， 可微量操作；2)具有反应的时间效应。反应要有一定的稳定时间，同时要快速；3)效应标志物在分子和生化水平上的效应要与高级生物学水平上的效应(如生长、繁殖)紧密相联，各级水平上的效应要有因果关系。化学物对生态系统的毒性效应是经过基因一分子一细胞一组织一器官一个体一群体一生态系统这个途径产生影响的。其中基因和生物大分子是化学物最早产生作用的靶标。污染物的直接化学检测虽然数值准确、针对性强，但工作量大，而且无法对污染物的生态毒理学效应做出预测。而污染物造成生物死亡、生长受阻或繁殖受影响、最终导致生态系统结构破坏，这些已是污染物造成的晚期影响。因此，迫切需要发展快速有效的生态毒理学研究手段和技术对污染物的影响做出更为准确的生态毒理学预测和早期报警。相对于传统的研究方法和技术寻找污染物的作用靶标，基因芯片技术具有诸多的优势1)基因是化学物产生毒性效应的第一级靶分子，较为敏感，也比较不易受到其他因素的影响，是用于检测痕量污染的首选指标([9]Afshari, C. A. ， E. F. Nuwaysir, and J. C. Barrett, Application of complementary DNA microarray technology to carcinogen identification, toxicology, and drug safety evaluation [J]. Cancer Res,1999,59(19) :4759-4760)； 2)基因芯片提供的信息多，符合综合分析和评价的要求([IO=Bartosiewicz, Μ.，et al.， Development of a toxicological gene array and quantitative assessment ofthis technology [J], Arch Biochem Biophys, 2000, 376 (1) :66-73)。但直接利用基因芯片评价化学物的毒性，预测有毒化学物对生物体的毒性效应，因操作程序复杂，所需费用高。因此， 利用基因芯片技术对污染物作用靶标进行筛查，结合其它生物技术进行验证，获得化学污染物的效应生物标志物成为污染物毒性效应检测的首选方法。鞘脂激活蛋白原(I^osaposin，psap)作为一种多功能的糖蛋白，存在于一些生物体液中，例如精液、乳汁、脑脊液([IllKishimoto, Y.，M. Hiraiwa, and J. S. 0' Brien, Saposins-structure，function, distribution, and molecular genetics[J]. J Lipid Res, 1992,33(9) :1255-1267)。对小鼠的Psap基因进行靶向突变能够引起雄性生殖系统的一系列异常，包括睾丸重量下降、精子数量减少以及前列腺、精囊腺和附睾的形态学变 it ([12]Morales, C. R.，et al.，Targeted disruption of the mouse prosaposin gene affects the development of the prostate gland and other male reproductive organs [J], JAndro 1,2000, 21 (6) :765-775)。基于 Psap 与生殖终点的生物学相关性，Psap 有可能作为检测PCBs雄性生殖毒性的效应标志物。
发明内容
本发明的目的是提供鞘脂激活蛋白原作为效应标志物在检测多氯联苯雄性生殖毒性的应用。所述鞘脂激活蛋白原(I^osaposin，简称I^ap)是一种多功能的糖蛋白，分子量为 70kD，存在于一些生物体液中。所述鞘脂激活蛋白原可采用以下方法筛选1)用不同剂量的多氯联苯对小鼠进行暴露后收集样本；所述不同剂量的多氯联苯可采用以下剂量0. 5 μ g/kg、5 μ g/kg、50 μ g/kg、500 μ g/kg ；所述收集样本，可在暴露 50天后收集样本；所述样本为附睾和肝脏样本。2)采用基因芯片技术进行样本差异表达基因的筛选，具体方法如下对步骤1)所收集的正常对照样本不同剂量的多氯联苯处理的附睾样本提取的总 RNA,以RNA为模板合成cDNA ；利用获得的cDNA合成cRNA，片段化荧光标记的cRNA ；标记的 cRNA经片段化处理后用于基因芯片杂交，基因芯片进行杂交、洗脱、染色及检测；对获得的检测数据进行归一化处理，使不同的样本数据具有可比性；
3)通过生物信息学统计和分析软件，实现对筛选的差异表达基因进行功能聚类， 获得与生殖功能相关的差异表达基因，具体方法如下对步骤2)获得的数据进行统计学分析，利用微阵列显著性分析算法 (Significance Analysis of Microarray, SAM)分析差异表达基因的显著性，利用分子注释系统(Molecular Annotation System，MAS)数据库，对差异表达基因以进行检索，并建立 PCB暴露于附睾功能变化间的相互关系；4)利用实时荧光定量PCR技术和免疫印迹法(Western Blot)在mRNA转录水平和蛋白表达水平上对获得的差异表达基因随着PCB暴露剂量以及暴露时间的增加而变化进行检测分析，具体方法如下将步骤2)提取的总RNA利用特异性引物进行实时荧光PCR，定量I^ap的mRNA转录水平，所述特异性引物具有如下序列引物 1 :5，-GCCAGAGGGCAGGAGCATT-3，引物 2 5，-CTGACCCAGGGACAGCAACA-3，样品在缓冲液中勻浆后，依次进行聚丙烯酰胺凝胶电泳和电转移，利用特异性抗体检测I3Sap的蛋白丰度。所述特异性抗体为鞘脂激活蛋白原(羊抗兔)多克隆抗体。5)进行精子参数的检测分析，具体方法如下将步骤1)取得的附睾尾部剪开，使用Chemicon公司HTF培养基(MR-070-D) 37°C 孵育30min，让精子游出，吸取10 μ 1新鲜精子悬液于载玻片上，40倍物镜下观察精子活力， 统计活动精子的总百分率，另取10 μ 1精子悬液制备精子涂片，固定后伊红染色，统计每200个精子中畸形精子的百分比。6)对效应标志物、体内多氯联苯水平以及精液指标之间的相关系数通过斯皮尔曼相关分析进行统计，具体方法如下通过气象色谱-电子捕获检测器检测步骤1)取得肝脏中PCB的富集，将PCB的富集与步骤4)的I^ap蛋白丰度，以及步骤幻的精子参数进行斯皮尔曼相关性分析。本发明的原理是利用基因芯片检测PCB对附睾表达谱的影响，结合生物信息学工具寻找附睾中对PCB暴露敏感的基因。通过实验研究将上述敏感基因的表达与PCB在生物体内的富集以及生殖终点建立相关性，以筛选和验证PCB暴露的特异性标志物。本发明提供了一种筛选PCB暴露标志物以及检测和评价PCB暴露的生殖毒性的方法。本发明涉及的生物学样品为非侵入性样品，对检测对象损伤小。与已有的PCB标志物相比，本发明所述的生物标志物不仅能够表征检测对象的PCB暴露，同是能够反映检测对象的生殖功能变化。
图1为Real-TimePCR验证I^ap在附睾中的表达。在图1中，横坐标为多氯联苯 (μ g/kg)，纵坐标为相对表达量；a为cDNA微阵列，b为实时定量PCR ；“*”表示与对照组有
显著差异。图2为Wfestern blot检测在不同暴露浓度下I3Sap在附睾中的表达。图3为I^ap在附睾中的相对表达值。在图3中，横坐标为多氯联苯(μ g/kg)，纵坐标为相对表达量；不同上标a，b，c表示相互间有显著差异。图4为Western blot检测在不同暴露浓度下Psap在精子中的表达。图5为Psap在精子中的相对表达值。在图5中，横坐标为多氯联苯(μ g/kg)，纵坐标为相对表达量；不同上标a，ab, c表示相互间有显著差异。图6为Western blot检测500yg/KgAroclor 1254暴露不同时间后Psap在精子中的表达。图7为Psap在对照组和暴露组精子中相对表达的比值。在图7中，横坐标为暴露天数，纵坐标为暴露组/对照组；不同上标a，a, ab, c表示相互间有显著差异。
具体实施例方式以下实施例将结合附图对本发明作进一步的说明。1.实验动物的暴露以C57BL/6品系健康青春期雄性小鼠为受试动物，平均体重15g，由厦门大学实验动物中心提供(SPF级)。实验温度控制在24 士 1 °C，昼夜周期为12 12h (早上08 00开灯)， 实验期间小鼠自由取食饮水。将雄小鼠随机分组，每组12只。根据环境中PCBs的浓度设计染毒浓度0. 5、5、50和500 μ g/kg。每3天对小鼠灌胃染毒一次，灌胃剂量为每克体重 5 μ L，对照组给予每克体重5 μ L生理盐水，暴露持续50天。取小鼠附睾用于步骤7或迅速放入液氮中保存。用于观察时间效应的雄性C57BL/6品系小鼠随机分成2组，分别暴露于对照溶剂和500 μ g/kg Aroclor 1254，饲养条件和操作方法如前所述。分别在暴露第7、14、28、50天取样。选用3个浓度梯度即0，5和500 μ g/kg暴露组的小鼠样品进行基因表达谱微阵列分析。2.总 RNA 提取2. 1 提取总 RNA用Invitrogen公司的TRIzol提取附睾总RNA。2. 2总RNA质量检测1)紫外检测检测260nm 和 0D280nm 处的吸光度，0D260/0D280 比值为 1. 8 2. 0，260nm 处一个 OD = 40 μ g/mL RNA02)电泳检测1. 5%琼脂糖凝胶电泳后，紫外灯下可见清晰明亮的28s、18s条带，28S rRNA条带的亮度应约为18S rRNA的1. 5 2. 0倍。3.基因表达谱微阵列样品的制备根据晶芯 cRNA扩增标记试剂盒的要求完成基因表达谱微阵列样品的制备。3. 1 合成 1 st-strand cDNA合成1 st-strand cDNA,使用晶芯 cRNA扩增标记试剂盒。1)取总RNA0. 1 5 μ g调整体积到10 μ 1。2)加入晶芯⑧基因表达谱外参(Cat. No. 360030) 1 μ 1。
3)加入 T7-01igo(dT) Primer 1 μ 1，调整体积到 12 μ 1。4)轻轻混勻溶液，70°C反应lOmin，反应结束后立即放入冰浴骤冷5min。5)配制反转录Master Mix,每个20 μ 1反应体系包含如下成分 10X First-strand Buffer 2 μ 1, dNTP Mix 4 μ 1, RNase Inhibitor 1 μ 1, CbcScript 1 μ 1，轻轻混勻，短暂离心将溶液收集于管底。上一步骤中反应完的每个样品管中加入上述 Master Mix 8 μ 1。6)轻轻混勻溶液，42°C反应2h。PCR仪的热盖温度42°C，反应完后冰浴5min。3. 2 合成 2nd_strand cDNA合成2nd_strand cDNA,使用晶芯 cRNA扩增标记试剂盒。反应系统见表1，16°C 反应2h。产物置于冰上钝化。表1合成2nd_strand cDNA的反应体系
权利要求
1.鞘脂激活蛋白原作为效应标志物在检测多氯联苯雄性生殖毒性的应用。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于所述鞘脂激活蛋白原是一种多功能的糖蛋白，分子量为70kD，存在于一些生物体液中。
3.如权利要求1所述的应用，其特征在于所述鞘脂激活蛋白原采用以下方法筛选1)用不同剂量的多氯联苯对小鼠进行暴露后收集样本；所述不同剂量的多氯联苯可采用以下剂量0. 5 μ g/kg、5 μ g/kg、50 μ g/kg、500 μ g/kg ；所述收集样本，可在暴露50天后收集样本；所述样本为附睾和肝脏样本；2)采用基因芯片技术进行样本差异表达基因的筛选，具体方法如下对步骤1)所收集的正常对照样本不同剂量的多氯联苯处理的附睾样本提取的总RNA， 以RNA为模板合成cDNA ；利用获得的cDNA合成cRNA，片段化荧光标记的cRNA ；标记的cRNA 经片段化处理后用于基因芯片杂交，基因芯片进行杂交、洗脱、染色及检测；对获得的检测数据进行归一化处理，使不同的样本数据具有可比性；3)通过生物信息学统计和分析软件，实现对筛选的差异表达基因进行功能聚类，获得与生殖功能相关的差异表达基因，具体方法如下对步骤i)获得的数据进行统计学分析，利用微阵列显著性分析算法分析差异表达基因的显著性，利用分子注释系统数据库，对差异表达基因以进行检索，并建立PCB暴露于附睾功能变化间的相互关系；4)利用实时荧光定量PCR技术和免疫印迹法在mRNA转录水平和蛋白表达水平上对获得的差异表达基因随着PCB暴露剂量以及暴露时间的增加而变化进行检测分析，具体方法如下将步骤2)提取的总RNA利用特异性引物进行实时荧光PCR，定量I^ap的mRNA转录水平，所述特异性引物具有如下序列引物 1 :5’ -GCCAGAGGGCAGGAGCATT-3’引物 2 :5’ -CTGACCCAGGGACAGCAACA-3’样品在缓冲液中勻浆后，依次进行聚丙烯酰胺凝胶电泳和电转移，利用特异性抗体检测hap的蛋白丰度；所述特异性抗体为鞘脂激活蛋白原多克隆抗体；5)进行精子参数的检测分析，具体方法如下将步骤1)取得的附睾尾部剪开，使用Chemicon公司HTF培养基(MR-070-D) 37°C孵育 30min，让精子游出，吸取10 μ 1新鲜精子悬液于载玻片上，40倍物镜下观察精子活力，统计活动精子的总百分率，另取10 μ 1精子悬液制备精子涂片，固定后1 %伊红染色，统计每200 个精子中畸形精子的百分比；6)对效应标志物、体内多氯联苯水平以及精液指标之间的相关系数通过斯皮尔曼相关分析进行统计，具体方法如下通过气象色谱-电子捕获检测器检测步骤1)取得肝脏中 PCB的富集，将PCB的富集与步骤4)的I^ap蛋白丰度，以及步骤幻的精子参数进行斯皮尔曼相关性分析。
全文摘要
鞘脂激活蛋白原作为效应标志物在检测多氯联苯雄性生殖毒性的应用，涉及鞘脂激活蛋白原。鞘脂激活蛋白原是多功能的糖蛋白，分子量为70kD，存在于一些生物体液中。鞘脂激活蛋白原的筛选方法用不同剂量的多氯联苯对小鼠进行暴露后收集样本；样本差异表达基因的筛选；对筛选的差异表达基因进行功能聚类，获得与生殖功能相关的差异表达基因；利用实时荧光定量PCR技术和免疫印迹法在mRNA转录水平和蛋白表达水平上对获得的差异表达基因随着PCB暴露剂量以及暴露时间的增加而变化进行检测分析；进行精子参数的检测分析；对效应标志物、体内多氯联苯水平以及精液指标之间的相关系数通过斯皮尔曼相关分析进行统计。
文档编号C12Q1/06GK102495214SQ20111039072
公开日2012年6月13日 申请日期2011年11月30日 优先权日2011年11月30日
发明者左正宏, 李博文, 王重刚, 蔡嘉力, 陈奕欣 申请人:厦门大学