专利名称：微生物混合发酵提高漆酶产量的方法
技术领域：
本发明涉及提高漆酶产量的发酵方法。
背景技术：
田彦六郎(1883)在漆树的树液中发现能使“树漆”氧化硬化的酶，后来贝特兰德 (G. E. Bertrand, 1894)详细地研究了东南亚产的漆中的酶，命名为漆酶。漆酶分布于微生物、菌类中，是一种铜蛋白质，蓝色，分子量约12万，含4原子铜，因此漆酶是一种含有铜的多酚氧化酶。漆酶在碱性环境中不稳定、易失活。漆酶可降解多种难降解的有机污染物和一些有毒物质，能在体外氧化PAH;而且，漆酶可存活于空气中，发生反应后唯一的产物就是水， 因此本质上是一种环保型酵素。随着环保意识逐渐被人所重视，因此近年来漆酶也成为众多学者的研究对象。利用白腐菌微生物混合培养产漆酶存在很大的随机性和不确定性，所以，目前都是采用单一白腐菌“强化”的方法提高其漆酶的产量。
发明内容
本发明要解决目前都是采用单一白腐菌“强化”的方法提高其漆酶的产量，而利用白腐菌微生物混合培养产漆酶存在很大的随机性和不确定性的问题，而提供的微生物混合发酵提高漆酶产量的方法。本发明第一种微生物混合发酵提高漆酶产量的方法按以下步骤实施一、混合发酵微生物菌株活化，混合发酵的微生物为青顶拟多孔菌和灵芝菌；二、将活化的青顶拟多孔菌和灵芝菌接种于液体发酵培养基中，然后在温度为28士 1°C、摇床转速为120士 lOr/min 条件下发酵培养10天；三、分离纯化漆酶，即完成提高漆酶产量的微生物混合发酵；步骤二中青顶拟多孔菌的接种量为每升液体发酵培养基接种0. 0225 0. 027g ； 步骤二中灵芝菌的接种量为每升液体发酵培养基接种0. 0225 0. 027g ；步骤二中液体发酵培养基每 1 升由 20g麸皮、0. 44g 氯化铵、0. 2g KH2PO4、0.05g MgS04、0. Olg CaCl2、l. Og 吐温80、ImL无机溶液、0. 5mL维生素溶液和余量的蒸馏水组成。本发明第二种微生物混合发酵提高漆酶产量的方法按以下步骤实施一、混合发酵微生物菌株活化，混合发酵的微生物为青顶拟多孔菌和糙皮侧耳菌；二、将活化的青顶拟多孔菌和糙皮侧耳菌接种于液体发酵培养基中，然后在温度为28士 1°C、摇床转速为 120士 lOr/min条件下发酵培养20天；三、分离纯化漆酶，即完成提高漆酶产量的微生物混合发酵；步骤二中青顶拟多孔菌的接种量为每升液体发酵培养基接种0. 0225 0. 027g ； 步骤二中糙皮侧耳菌的接种量为每升液体发酵培养基接种0. 0225 0. 027g ；步骤二中液体发酵培养基每 1 升由 20g 麸皮、0. 44g 氯化铵、0. 2g ΚΗ2Ρ04、0· 05g MgS04、0· Olg CaCl2, 1. Og吐温80、ImL无机溶液、0. 5mL维生素溶液和余量的蒸馏水组成。
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本发明第三种微生物混合发酵提高漆酶产量的方法按以下步骤实施一、混合发酵微生物菌株活化，混合发酵的微生物为青顶拟多孔菌、糙皮侧耳菌和偏肿拟栓菌；二、将活化的青顶拟多孔菌、糙皮侧耳菌和偏肿拟栓菌接种于同一液体发酵培养基中，然后在温度为28士 1°C、摇床转速为120士 lOr/min条件下发酵培养14天；三、分离纯化漆酶，即完成提高漆酶产量的微生物混合发酵；步骤二中青顶拟多孔菌的接种量为每升液体发酵培养基接种0. 015 0. OlSg ；步骤二中糙皮侧耳菌的接种量为每升液体发酵培养基接种0. 015 0. OlSg ；步骤二中偏肿拟栓菌的接种量为每升液体发酵培养基接种0. 015 0. OlSg ；步骤二中液体发酵培养基每1 升由 20g 麸皮、0. 44g 氯化铵、0. 2g KH2PO4、0.05g MgS04、0. Olg CaCl2、1. Og 吐温 80、ImL 无机溶液、0. 5mL维生素溶液和余量的蒸馏水组成。本发明三种方法步骤二液体发酵培养基中的无机溶液都是按以下比例配制的每升无机溶液由 3. Og MgSO4 · 7Η20、0· 5g MnSO4U. Og NaCl、0. Ig FeSO4 · 7Η20、0· Ig CoSO4, 0. 082gCaCl2、0. Ig ZnSO4,0. Olg CuSO4 · 5Η20、0· Olg KAl (SO4) 2、0· Olg Η3Β03、0· Olg NaMoO4 和余量的去离子水组成。本发明三种方法步骤二液体发酵培养基中的维生素溶液都是按以下比例配制的每升维生素溶液由 0. 005g VBUO. 005g VB2、0. 002g 生物素、0. 002g 叶酸、0. Olg VB6、 0. 005g烟酸和和余量的蒸馏水组成。本发明中所用的灵芝菌(Ganoderma lucidum)为灵芝科灵芝属(Ganoderma Karst)真菌。本发明第一种微生物混合发酵提高漆酶产量的方法步骤二发酵培养10天漆酶产量达到峰值，漆酶产量为42. 89U/mL。本发明第二种微生物混合发酵提高漆酶产量的方法步骤二发酵培养20天漆酶产量达到峰值，漆酶产量为50. 45U/mL。本发明第三种微生物混合发酵提高漆酶产量的方法步骤二发酵培养14天漆酶产量达到峰值，漆酶产量为75. 98U/mL。活化后采用本发明步骤二的发酵培养条件，单独培养发酵青顶拟多孔菌，发酵培养14天漆酶产量达到峰值，漆酶产量为24. 49U/mL。活化后采用本发明步骤二的发酵培养条件，单独培养发酵灵芝菌，发酵培养6天漆酶产量达到峰值，漆酶产量为10. 72U/mL。活化后采用本发明步骤二的发酵培养条件，单独培养发酵糙皮侧耳菌，发酵培养4 天漆酶产量达到峰值，漆酶产量为8. 01U/mL。活化后采用本发明步骤二的发酵培养条件，单独培养发酵偏肿拟栓菌，发酵培养 10天漆酶产量达到峰值，漆酶产量为20. 98U/mL。活化后采用本发明步骤二的发酵培养条件，培养发酵青顶拟多孔菌和偏肿拟栓菌 (青顶拟多孔菌和偏肿拟栓菌的接种量都为每升液体发酵培养基接种0. 0225 0. 027g)， 发酵培养8天漆酶产量达到峰值，漆酶产量为16. 42U/mL。活化后采用本发明步骤二的发酵培养条件，培养发酵青顶拟多孔菌、糙皮侧耳菌和灵芝菌(青顶拟多孔菌、糙皮侧耳菌和灵芝菌的接种量都为每升液体发酵培养基接种 0. 015 0. 018g)，发酵培养10天漆酶产量达到峰值，漆酶产量为35. 94U/mL。
本发明的三种微生物混合发酵方法可以显著的提高漆酶的产量。本发明中漆酶活性的测定方法①利用Lac氧化ABTS，用紫外-可见分光光度计测定420nm处0-210s内吸光度值随时间的变化，从而得知酶反应速率，进而推算酶活。具体用等体积5mmol/LABTS溶液和酶液反应，测定反应前210s内420nm处吸光值的增加。定义每Imin氧化1 μ mol ABTS所需的酶量为1个酶活单位。②酶活测定所需试剂5mmol/L ABTS ；0. 2mol/L醋酸-醋酸钠缓冲溶液(pH = 5.0)以及一定量的粗酶液(9000r/min离心5min，上清液即为粗酶液)。③酶活测定步骤空白样(4mL):2mL0. 2mol/L 缓冲液 _0· 4mLABTS_l. 6mL 去离子水样品(4mL):2mL0. 2mol/L 缓冲液-0. 4mLABTS_l. 2mL 去离子水 _0· 4mL 酶液用紫外-可见分光光度计检测420nm处吸收值变化，30s间隔读数，记录210s内吸
收值变化。
AA V0 1 — g m AA 1④酶活计算公式为 ..v.
Lac 酶活(U/mL)=若测得酶活较小，则可采用U/L为单位。
AA v 1At
艮口 · ^^}舌(U/L)- it Ayisk "V [
式中根据测得的吸收值变化即可绘制吸收值 时间关系曲线，即为斜率 V0为测定酶活的反应混合物的总体积，4mL ； ε为反应产物的吸光介质常数，θβΟΟπιοΓ^πΓ1 ； b为比色皿的厚度，Icm;
V为测定酶活的反应混合物中粗酶液的体积，单位为HlL ； 6. 667为公式推导计算出来的系数。
具体实施例方式本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式
，还包括各具体实施方式
间的任意组合。
具体实施方式
一本实施方式微生物混合发酵提高漆酶产量的方法按以下步骤实施一、混合发酵微生物菌株活化，混合发酵的微生物为青顶拟多孔菌和灵芝菌；二、将活化的青顶拟多孔菌和灵芝菌接种于液体发酵培养基中，然后在温度为28士 1°C、摇床转速为 120士 lOr/min条件下发酵培养10天；三、分离纯化漆酶，即完成提高漆酶产量的微生物混合发酵；步骤二中青顶拟多孔菌的接种量为每升液体发酵培养基接种0. 0225 0. 027g ； 步骤二中灵芝菌的接种量为每升液体发酵培养基接种0. 0225 0. 027g ；步骤二中液体发酵培养基每1升由20g麸皮、0.44g氯化铵、0. 2g KH2P04、0. 05g MgS04、0. Olg CaCl2U. Og吐温80、ImL无机溶液、0. 5mL维生素溶液和余量的蒸馏水组成。本实施方式步骤二液体发酵培养基中的无机溶液是按以下比例配制的每升无机
6溶液由 3. Og MgSO4 · 7Η20、0· 5g MnSO4U. Og NaCl、0. Ig FeSO4 · 7Η20、0· Ig CoS04、0. 082g CaCl2,0. Ig ZnSO4,0. Olg CuSO4 · 5Η20、0· Olg KAl (SO4) 2、0· Olg Η3Β03、0· Olg NaMoO4 和余量的去离子水组成。本实施方式步骤二液体发酵培养基中的维生素溶液是按以下比例配制的每升维生素溶液由 0. 005g VBUO. 005g VB2、0. 002g 生物素、0. 002g 叶酸、0. Olg VB6、0. 005g 烟酸和和余量的蒸馏水组成。保持本实施方式步骤二中液体发酵培养基的自然pH，不必调节液体发酵培养基的 pH。本实施方式的青顶拟多孔菌购买得到，本实施方式的灵芝菌购买得到。本实施方式中所用的灵芝(Ganoderma lucidum)为灵芝科灵芝属(Ganoderma Karst)真菌。本实施方式步骤三采用硫酸铵盐析、DEAE Sepharose Fast Flow柱层析和 Sephadex GlOO凝胶柱层析对漆酶液体发酵培养基进行分离纯化，得到电泳纯漆酶(“灵芝TR6号漆酶的分离纯化及性质研究”，韩君莉，郭丽琼，郑晓冰等，应用与环境生物学报，2008 (1) 99-103)，本实施方式步骤二发酵培养10天漆酶产量达到峰值，漆酶产量为 42. 89U/mL。
具体实施方式
二 本实施方式与具体实施方式
一的不同点是步骤一中混合发酵微生物菌株的活化按以下步骤进行将混合发酵微生物菌株分别接种于固体培养基后放入28°C环境中活化3天；然后再分别接种于扩大固体培养基，25°C环境中培养7天，即完成混合发酵微生物菌株的活化；固体培养基每1升由200 300g 土豆浸出液、20g葡萄糖、20g琼脂、3. Og KH2PO4, 1. 5gMgS04和余量的蒸馏水组成；扩大固体培养基每1升由200 30(^土豆浸出液、2(^葡萄糖、2(^琼脂、3.(^ KH2PO4U. 5g MgSO4和余量的蒸馏水组成。其它步骤及参数与实施方式一相同。本实施方式中的土豆浸出液由200g 土豆和800mL蒸馏水煮制30min获得。
具体实施方式
三本实施方式微生物混合发酵提高漆酶产量的方法按以下步骤实施一、混合发酵微生物菌株活化，混合发酵的微生物为青顶拟多孔菌和糙皮侧耳菌；二、 将活化的青顶拟多孔菌和糙皮侧耳菌接种于液体发酵培养基中，然后在温度为28士 1°C、摇床转速为120士 lOr/min条件下发酵培养20天；三、分离纯化漆酶，即完成提高漆酶产量的微生物混合发酵；步骤二中青顶拟多孔菌的接种量为每升液体发酵培养基接种0. 0225 0. 027g ； 步骤二中糙皮侧耳菌的接种量为每升液体发酵培养基接种0. 0225 0. 027g ；步骤二中液体发酵培养基每1升由20g麸皮、0.44g氯化铵、0. 2g KH2P04、0. 05g MgS04、0. Olg CaCl2U. Og吐温80、ImL无机溶液、0. 5mL维生素溶液和余量的蒸馏水组成。本实施方式步骤二液体发酵培养基中的无机溶液是按以下比例配制的每升无机溶液由 3. Og MgSO4 · 7Η20、0· 5g MnSO4U. Og NaCl、0. Ig FeSO4 · 7Η20、0· Ig CoS04、0. 082g CaCl2,0. Ig ZnSO4,0. Olg CuSO4 · 5Η20、0· Olg KAl (SO4) 2、0· Olg Η3Β03、0· Olg NaMoO4 和余量的去离子水组成。本实施方式步骤二液体发酵培养基中的维生素溶液是按以下比例配制的每升维生素溶液由 0. 005g VBUO. 005g VB2、0. 002g 生物素、0. 002g 叶酸、0. Olg VB6、0. 005g 烟酸
和和余量的蒸馏水组成。保持本实施方式步骤二中液体发酵培养基的自然pH，不必调节液体发酵培养基的 pH。本实施方式的青顶拟多孔菌和糙皮侧耳菌购买得到。本实施方式步骤三采用硫酸铵盐析、DEAE Sepharose Fast Flow柱层析和 Sephadex GlOO凝胶柱层析对漆酶液体发酵培养基进行分离纯化，得到电泳纯漆酶，本实施方式步骤二发酵培养20天漆酶产量达到峰值，漆酶产量为50. 45U/mL。
具体实施方式
四本实施方式与具体实施方式
三的不同点是步骤一中混合发酵微生物菌株的活化按以下步骤进行将混合发酵微生物菌株分别接种于固体培养基后放入28°C环境中活化3天；然后再分别接种于扩大固体培养基，25°C环境中培养7天，即完成混合发酵微生物菌株的活化；固体培养基每1升由200 300g 土豆浸出液、20g葡萄糖、20g琼脂、3. Og KH2PO4, 1. 5gMgS04和余量的蒸馏水组成；扩大固体培养基每1升由200 30(^土豆浸出液、2(^葡萄糖、2(^琼脂、3.(^ KH2PO4U. 5g MgSO4和余量的蒸馏水组成。其它步骤及参数与实施方式三相同。本实施方式中的土豆浸出液由200g 土豆和800mL蒸馏水煮制30min获得。
具体实施方式
五本实施方式微生物混合发酵提高漆酶产量的方法按以下步骤实施一、混合发酵微生物菌株活化，混合发酵的微生物为青顶拟多孔菌、糙皮侧耳菌和偏肿拟栓菌；二、将活化的青顶拟多孔菌、糙皮侧耳菌和偏肿拟栓菌接种于同一液体发酵培养基中，然后在温度为28士 1°C、摇床转速为120士 lOr/min条件下发酵培养14天；三、分离纯化漆酶，即完成提高漆酶产量的微生物混合发酵；步骤二中青顶拟多孔菌的接种量为每升液体发酵培养基接种0. 015 0. OlSg ；步骤二中糙皮侧耳菌的接种量为每升液体发酵培养基接种0. 015 0. OlSg ；步骤二中偏肿拟栓菌的接种量为每升液体发酵培养基接种0. 015 0. OlSg ；步骤二中液体发酵培养基每1升由20g麸皮、0.44g氯化铵、0. 2g KH2P04、0. 05g MgS04、0. Olg CaCl2U. Og吐温80、ImL无机溶液、0. 5mL维生素溶液和余量的蒸馏水组成。本实施方式步骤二液体发酵培养基中的无机溶液是按以下比例配制的每升无机溶液由 3. Og MgSO4 · 7Η20、0· 5g MnSO4U. Og NaCl、0. Ig FeSO4 · 7Η20、0· Ig CoS04、0. 082g CaCl2,0. Ig ZnSO4,0. Olg CuSO4 · 5Η20、0· Olg KAl (SO4) 2、0· Olg Η3Β03、0· Olg NaMoO4 和余量的去离子水组成。本实施方式步骤二液体发酵培养基中的维生素溶液是按以下比例配制的每升维生素溶液由 0. 005g VBUO. 005g VB2、0. 002g 生物素、0. 002g 叶酸、0. Olg VB6、0. 005g 烟酸和和余量的蒸馏水组成。保持本实施方式步骤二中液体发酵培养基的自然pH，不必调节液体发酵培养基的 pH。本实施方式的青顶拟多孔菌、糙皮侧耳菌和偏肿拟栓菌购买得到。本实施方式步骤三采用硫酸铵盐析、DEAE Sepharose Fast Flow柱层析和 Sephadex GlOO凝胶柱层析对漆酶液体发酵培养基进行分离纯化，得到电泳纯漆酶，本实施方式步骤二发酵培养14天漆酶产量达到峰值，漆酶产量为75. 98U/mL。
具体实施方式
六本实施方式与具体实施方式
五的不同点是步骤一中混合发酵微生物菌株的活化按以下步骤进行将混合发酵微生物菌株分别接种于固体培养基后放入28°C环境中活化3天；然后再分别接种于扩大固体培养基，25°C环境中培养7天，即完成混合发酵微生物菌株的活化；固体培养基每1升由200 300g 土豆浸出液、20g葡萄糖、20g琼脂、3. Og KH2PO4, 1. 5g MgSO4和余量的蒸馏水组成；扩大固体培养基每1升由200 30(^土豆浸出液、2(^葡萄糖、2(^琼脂、3.(^ KH2PO4U. 5g MgSO4和余量的蒸馏水组成。其它步骤及参数与实施方式五相同。本实施方式中的土豆浸出液由200g 土豆和800mL蒸馏水煮制30min获得。
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权利要求
1.微生物混合发酵提高漆酶产量的方法，其特征在于微生物混合发酵提高漆酶产量的方法按以下步骤实施一、混合发酵微生物菌株活化，混合发酵的微生物为青顶拟多孔菌和灵芝菌；二、将活化的青顶拟多孔菌和灵芝菌接种于同一液体发酵培养基中，然后在温度为 28士 1°C、摇床转速为120士 lOr/min条件下发酵培养10天；三、分离纯化漆酶，即完成提高漆酶产量的微生物混合发酵；步骤二中青顶拟多孔菌的接种量为每升液体发酵培养基接种0. 0225 0. 027g ；步骤二中灵芝菌的接种量为每升液体发酵培养基接种0. 0225 0. 027g ；步骤二中液体发酵培养基每1升由20g麸皮、0.44g氯化铵、0. 2g KH2P04、0.05g MgSO4,0.Olg CaCl2U. Og吐温80、ImL无机溶液、0. 5mL维生素溶液和余量的蒸馏水组成。
2.根据权利要求1所述的微生物混合发酵提高漆酶产量的方法，其特征在于步骤一中混合发酵微生物菌株的活化按以下步骤进行将混合发酵微生物菌株分别接种于固体培养基后放入28°C环境中活化3天；然后再分别接种于扩大固体培养基，25°C环境中培养7天，即完成混合发酵微生物菌株的活化； 固体培养基每1升由200 30(^土豆浸出液、2(^葡萄糖、2(^琼脂、3.(^ KH2PO4,1.5gMgS04和余量的蒸馏水组成；扩大固体培养基每1升由200 300g 土豆浸出液、20g葡萄糖、20g琼脂、3. Og KH2PO4, 1. 5g MgSO4和余量的蒸馏水组成。
3.微生物混合发酵提高漆酶产量的方法，其特征在于微生物混合发酵提高漆酶产量的方法按以下步骤实施一、混合发酵微生物菌株活化，混合发酵的微生物为青顶拟多孔菌和糙皮侧耳菌；二、将活化的青顶拟多孔菌和糙皮侧耳菌接种于液体发酵培养基中，然后在温度为28士 1°C、摇床转速为120士 lOr/min条件下发酵培养20天；三、分离纯化漆酶，即完成提高漆酶产量的微生物混合发酵；步骤二中青顶拟多孔菌的接种量为每升液体发酵培养基接种0. 0225 0. 027g ；步骤二中糙皮侧耳菌的接种量为每升液体发酵培养基接种0. 0225 0. 027g ；步骤二中液体发酵培养基每1升由20g麸皮、0.44g氯化铵、0. 2g KH2P04、0.05g MgSO4,0.Olg CaCl2U. Og吐温80、ImL无机溶液、0. 5mL维生素溶液和余量的蒸馏水组成。
4.根据权利要求3所述的微生物混合发酵提高漆酶产量的方法，其特征在于步骤一中混合发酵微生物菌株的活化按以下步骤进行将混合发酵微生物菌株分别接种于固体培养基后放入28°C环境中活化3天；然后再分别接种于扩大固体培养基，25°C环境中培养7天，即完成混合发酵微生物菌株的活化； 固体培养基每1升由200 30(^土豆浸出液、2(^葡萄糖、2(^琼脂、3.(^ KH2PO4,1.5gMgS04和余量的蒸馏水组成；扩大固体培养基每1升由200 300g 土豆浸出液、20g葡萄糖、20g琼脂、3. Og KH2PO4, 1. 5g MgSO4和余量的蒸馏水组成。
5.微生物混合发酵提高漆酶产量的方法，其特征在于微生物混合发酵提高漆酶产量的方法按以下步骤实施一、混合发酵微生物菌株活化，混合发酵的微生物为青顶拟多孔菌、 糙皮侧耳菌和偏肿拟栓菌；二、将活化的青顶拟多孔菌、糙皮侧耳菌和偏肿拟栓菌接种于同一液体发酵培养基中，然后在温度为28士 1°C、摇床转速为120士 lOr/min条件下发酵培养 14天；三、分离纯化漆酶，即完成提高漆酶产量的微生物混合发酵；步骤二中青顶拟多孔菌的接种量为每升液体发酵培养基接种0. 015 0. OlSg ；步骤二中糙皮侧耳菌的接种量为每升液体发酵培养基接种0. 015 0. OlSg ；步骤二中偏肿拟栓菌的接种量为每升液体发酵培养基接种0. 015 0. OlSg ；步骤二中液体发酵培养基每1升由20g麸皮、0.44g氯化铵、0. 2g KH2P04、0.05g MgSO4,.0.Olg CaCl2U. Og吐温80、ImL无机溶液、0. 5mL维生素溶液和余量的蒸馏水组成。
6.根据权利要求5所述的微生物混合发酵提高漆酶产量的方法，其特征在于步骤一中混合发酵微生物菌株的活化按以下步骤进行将混合发酵微生物菌株分别接种于固体培养基后放入28°C环境中活化3天；然后再分别接种于扩大固体培养基，25°C环境中培养7天，即完成混合发酵微生物菌株的活化；固体培养基每1升由200 300g 土豆浸出液、20g葡萄糖、20g琼脂、3. Og KH2PO4U. 5g MgSO4和余量的蒸馏水组成；扩大固体培养基每1升由200 300g 土豆浸出液、20g葡萄糖、20g琼脂、3. Og KH2PO4,.1.5g MgSO4和余量的蒸馏水组成。
全文摘要
微生物混合发酵提高漆酶产量的方法，它涉及提高漆酶产量的发酵方法。它要解决目前都是采用单一白腐菌“强化”的方法提高其漆酶的产量，而利用白腐菌微生物混合培养产漆酶存在很大的随机性和不确定性的问题。方法一、活化；二、发酵培养；三、分离纯化漆酶。本发明方法可应用于微生物发酵生产漆酶。
文档编号C12R1/645GK102443575SQ201110409210
公开日2012年5月9日 申请日期2011年12月9日 优先权日2011年12月9日
发明者孟瑶, 梁红, 高大文 申请人:东北林业大学