专利名称：毕赤酵母制备人白细胞介素32β的方法
技术领域：
本发明涉及一种毕赤酵母制备重组人白细胞介素32β的方法及其重组工程菌。 属于生物工程领域。
背景技术：
人白细胞介素32 (human interleukin 32，hIL-32)是近年新发现的一种细胞因子，其生物学活性主要表现为促炎症性细胞因子的特点，在多种自身免疫性疾病和炎症性疾病呈高表达状态，并与疾病的严重程度相关(Dinarello CA, Kim SH. (2006)IL-32, a novel cytokine with a possible role in disease. Ann Rheum Dis,65(Suppl III) 61-64)。hIL-32的产生细胞有多种，由IL-2活化的NK细胞或用丝裂原激活的T细胞均可产生IL-32，用IFN-Y刺激单核细胞和上皮细胞也可诱导IL-32的产生。人IL-32的基因定位于16号染色体(16pl3. 3)上，含有8个外显子，可编码表达 IL-32 蛋白的 6 种剪接变异体IL-32 α、IL-32 β、IL-32 γ、IL-32 δ、IL-32 ε 和 IL-32 ζ， 目前已报告了蛋白结构的有IL-32 α、IL-32 β、IL-32 γ和IL-32 δ，组成这4种剪接变异体肽链的氨基酸残基数分别为131、188、234和178个。通过Northern blot实验发现，在人的脾、胸腺、白细胞、小肠、结肠、前列腺、卵巢、睾丸均有IL-32的mRNA表达(Goda C5Kanaji T,Kanaji S, et al. (2006)Involvement of IL_32in activation-induced cell death in T cells. Int Immunol,18(2) :233-240)。近年已发现，人IL-32的表达与多种炎症性疾病及自身免疫性疾病相关，在类风湿关节炎、肠炎、结核病、甲型流感、骨髓增生异常综合征和慢性骨髓单核细胞白血球过多症、人体免疫缺陷症等疾病患者中，都检测到IL-32mRNA的表达水平升高。鉴于hIL-32的多种生物学效应，尤其是其生物学作用与炎症性疾病及自身免疫病性疾病的相关性，并参与细胞凋亡过程的作用，提示hIL-32及其受体有可能成为炎症性疾病及自身免疫病性疾病的治疗靶点，而针对hIL-32或其受体的相关生物工程制品有可能成为开发抗炎症药物治疗自身免疫病性疾病药物的新方向，由此显现出IL-32潜在的临床应用前景。
发明内容
本发明的目的是提供一种利用酵母表达重组人白细胞介素32 β (hIL_32i3)的制备方法及其酵母工程菌。本发明提供的技术方案如下(1)本发明的第一方面，提供一种hIL_32i3的重组真核表达载体，该载体是将 pPIC9K(Invitrogen公司)与本发明所述的hIL_32 β编码基因(SEQ ID No 1)经过重组而获得，该重组真核表达载体为PPIC9K-hIL-32i3，如图1所示。(2)本发明的第二方面，提供一种表达人IL-32 β的重组酵母工程菌GS115/ hIL-32i3，该工程菌是毕赤酵母GS115anvitrogen公司)被本发明所述的重组真核表达载体pPIC9K-hIL-32 β转化而获得，而且pPIC9K中的信号肽基因序列与hIL_32 β的编码基因均已整合到该工程菌的基因组中，因此该工程菌可分泌性表达hIL-32 β至培养液中。(3)本发明的第三方面，提供一种制备重组hIL-32i3的方法，该方法包括以下步骤a)培养上述重组酵母工程菌，于培养液中添加0.5 (ν/ν)的甲醇为诱导剂， 诱导重组酵母工程菌表达重组hIL-32 β ；b)离心培养液去除菌体和不溶物，收集培养液上清经过超滤浓缩和透析除盐处理；c)除盐后的培养上清用弱阴离子交换层析柱分离纯化培养液中的重组 hIL-32 β，收集含有重组hIL-32 β的洗脱液；d)将含有重组hIL-32 β的洗脱液用分子筛层析方法进一步纯化；e)用 SDS-PAGE 和 ^festern blotting 方法分析鉴定纯化的重组 hIL_32 β。
图1为重组真核表达质粒pPIC9K-hIL_32i3的构建图谱图2为人IL-32 β编码基因的PCR扩增结果图3为重组真核表达质粒pPIC9K-hIL_32 β的双酶切鉴定结果
具体实施例方式以下结合具体实施例，进一步阐述本发明的操作方法，这些实施例仅用于详细说明本发明，而不用于限制本发明的范围。下述实施例中，所有PCR引物的合成和DNA序列的测定均由上海生工生物工程技术服务有限公司完成；所用的培养基如无特别说明均按毕赤酵母表达手册anvitrogen公司)的配方进行配制。实施例一、人IL_32i3编码基因的克隆1.设计和合成PCR引物根据GenBank中的人IL-32基因序列和pPIC9K载体的多克隆位点序列，用Oligo 7软件设计一对特异性引物如下上游引物5，-CGGAATTCATGTGCTTCCCGAAGGTCC-3，下游引物5，-ATTTTGCGGCCGCTCATTTTGAGGATTGGGGTTC-3，；在上游引物中加入了限制性内切酶EcoR I识别位点(GAATTC)，下游引物中加入了 Not I位点(GCGGCCGC)，扩增产物的大小约560bp。2.人IL-32 β编码基因的克隆用RNA提取试剂Trizol (BBI公司)按说明书操作，从健康中国人外周血单个核细胞(PBMC)提取细胞总RNA ；取提取的总RNA 1 μ L作为模板，用反转录试剂盒(TaKaKa公司) 按说明书操作，经反转录扩增得到IL-32 β前体的cDNA ；反转录结束后，取反应液5 μ L作为模板，用上述特异性引物进行PCR扩增IL-32i3的编码基因，反应条件如下94°C 2min, 94°C 30s —61°C 30s-72°C lmin，30个循环，最后72°C延伸lOmin。扩增产物经琼脂糖凝胶电泳分析，结果如图2所示；用EZ-10柱式DNA回收试剂(BBI公司)回收纯化约560bp的目的基因片段；将纯化的目的基因片段于克隆载体PUCm-T (BBI公司)相连，构建为重组质粒并命名为pUCm-32 ；将重组质粒pUCm-32转化感受态大肠杆菌JM109，接种于含IPTG和 X-gaL的氨苄青霉素LB培养板，37°C培养16h，挑取阳性菌落接种液体LB培养基扩增，提取重组质粒进行测序，测序结果如SEQ ID No :1所示；测序结果经Oligo 7软件分析，连接到重组质粒pUCm-32中的目的基因序列与GenBank中的人IL-32 β的cDNA序列一致。实施例二、构建表达人IL_32i3的重组真核表达载体取质粒pUCm-32和载体pPIC9K (Invitrogen公司)分别用限制性内切酶EcoR I和 Not I进行双酶切，回收约560bp的目的基因片段和载体PPIC9K的大片段，用T4DNA连接酶 (BBI公司)于16°C水浴连接16h，将连接产物转化感受态大肠杆菌JM109，接种于含卡那霉素的LB培养板，37°C培养过夜，挑取阳性菌落接种液体LB培养基扩增，提取重组真核表达质粒并命名为pPICTK-hIL-32 0 ；用EcoR I和Not I对重组真核表达质粒pPIC9K_hIL_32 β 进行双酶切鉴定，同时进行测序鉴定，双酶切鉴定结果如图3所示，酶切出的大片段和小片段分别与载体PPIC9K和目的基因的大小相符合，测序结果证实pPIC9K-hIL-32 β中的人 IL-32 β编码基因序列与pUCm-32中的完全一致。实施例三、重组真核表达质粒转化酵母GS115及其高拷贝重组工程菌的筛选提取经测序鉴定的PPIC9K-hIL-32i3，用限制性内切酶Ml I酶切后，用0. 7%的琼脂糖凝胶电泳分离并回收线性化的pPIC9K-hIL-32 β ；将线性化的pPIC9K_hIL_32 β与酵母GS115感受态细胞混合后，按照毕赤酵母表达手册anvitrogen公司)的方法进行电转化。将转化产物涂布于不含His的MD培养板，30°C培养2 3天，挑选MD平板上生长旺盛的优势菌落接种于含0. 5mg/mL G418的YPD平板，30°C培养2 3天，挑选生长旺盛的优势菌落接种于含lmg/mL G418的YPD平板，30°C培养2 3天，如此重复培养并依次增加 G418浓度至％ig/mL，从含％ig/mL G418的YPD平板筛选得到高拷贝整合的毕赤酵母重组工程菌 GS115/hIL-32 3。实施例四、重组人IL-32 β的诱导表达、纯化及分析将重组工程菌GS115/hIL-32 0接种BMGY培养基，于30°C、250rpm/min条件下振荡培养至菌液0D600为1 3时，转换为BMMY培养基继续培养，每隔24h加入终浓度为1 %的甲醇诱导表达，连续培养96h，离心收集培养上清，先用SDS-PAGE检测培养上清中hIL-32i3的表达情况，然后用羊抗人IL-32多克隆抗体(R&D公司)进行Western blotting鉴定表达的hIL-32 β。将培养上清先用截流分子量为IOkDa的超滤膜浓缩，再用 DEAE-Sepharose Fast Flow离子交换层析和kphadex G_75凝胶过滤层析纯化，纯化产物经SDS-PAGE检测和Wfestern blotting鉴定，SDS-PAGE结果显示纯化的重组hIL_32 β为单一蛋白条带，其分子量为22kDa，Wfestern blotting结果显示单一反应条带。
权利要求
1.一种人白细胞介素32β (hIL-32i3)的重组真核表达载体，其特征在于，所述的重组真核表达载体中插入了 hIL-32i3的编码基因。
2.如权利要求1所述的重组真核表达载体中的hIL-32i3的编码基因，其DNA的核苷酸序列对应于序列表中的SEQ IDNO :1。
3.如权利要求1所述的重组真核表达载体中的hIL-32i3的编码基因，其编码产物的氨基酸序列对应于序列表中的SEQ ID NO :2。
4.一种重组毕赤酵母工程菌，其特征在于，所述的重组毕赤酵母的染色体中整合有权利要求1所述的hIL-32i3的编码基因，并且分泌表达重组hIL-32i3至培养液中。
5.一种制备重组hIL-32i3的方法，其特征在于，包括步骤(1)用适当的培养液，培养权利要求4所述的重组毕赤酵母工程菌；(2)在培养液中添加适当的诱导剂，诱导重组毕赤酵母工程菌分泌表达重组 hIL-32 3 ；(3)从培养液中分离纯化出重组毕赤酵母分泌表达的重组hIL-32β。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤(1)所用的培养液为BMGY培养液和 BMMY培养液；步骤(2)所用的诱导剂为甲醇，添加甲醇的终浓度为培养液体积的0. 5 1%; 步骤(3)所用的分离纯化重组hIL-32i3的方法为先用弱阴离子型离子交换层析分离培养液中的重组hIL-32 β，再用凝胶过滤层析得到纯化的重组hIL-32 β。
全文摘要
本发明提供了一种重组人白细胞介素32β的制备方法及表达重组hIL-32β的毕赤酵母工程菌。本发明的具体制备方法包括以下步骤1)人工合成引物；2)从健康人外周血单个核细胞经反转录PCR得到hIL-32β的编码基因；3)构建含有hIL-32β编码基因的重组真核表达载体，融合于毕赤酵母表达调控元件获得重组毕赤酵母工程菌；4)培养重组毕赤酵母工程菌，于培养液添加甲醇诱导毕赤酵母工程菌表达重组hIL-32β；5)采用离子交换层析和分子筛层析从培养液上清纯化重组hIL-32β。本发明构建的重组毕赤酵母工程菌可进行高密度培养并且分泌型表达重组hIL-32β，适用于工业化制备重组人白细胞介素32β。
文档编号C12N1/19GK102392043SQ201110413360
公开日2012年3月28日 申请日期2011年12月13日 优先权日2011年12月13日
发明者吴静, 来丽丽, 邬敏辰, 郁心, 郑海军, 陈伟 申请人:江南大学