专利名称：一种胶体金融合乳胶法半定量检测盐酸克伦特罗的检测试剂、试剂条和试剂盒及其制备方法
技术领域：
本发明涉及一种盐酸克伦特罗的检测试剂，具体地说是一种胶体金融合乳胶法半定量检测盐酸克伦特罗的检测试剂、试剂条和试剂盒及其制备方法，属于盐酸克伦特罗检测试剂领域。
背景技术：
盐酸克伦特罗(Clenbuterol，CL)，又名瘦肉精，分子式为C12H18C12N2q · HC1，药品名为克喘素、氨哮素等，为白色或类白色的结晶粉末，无臭、味苦，易溶于水、甲醇、乙醇，微溶于丙酮、氯仿，不溶于乙醚和苯，化学性质稳定；它是一种人工合成的肾上腺素受体激动剂，具有扩张支气管的作用，常用来防治哮喘、肺气肿等肺部疾病。当其应用剂量达到治疗量的5 10倍时，又具有能量重分配作用，可使肌肉合成增加，脂肪沉积减少，因此将其俗称为“瘦肉精”，在养猪业中一些非法使用者将其作为一种生长促进剂添加到饲料中，用以改善胴体的品质，但同时也造成了猪肉中盐酸克伦特罗的残留。当人们食用含有盐酸克伦特罗残留的肉品后，常常造成心动过速，低血钾，低磷酸盐血症，肌肉震颤，头晕，口干，失眠甚至于瘫痪等中毒症状，对心脏病患者更有生命危险。国家农业部农牧发[2002] 1号文 《关于发布食品动物禁用的兽药及其他化合物清单的通知》中，盐酸克伦特罗被列为所有食品动物禁止使用。
目前已有多种方法用于对CL的残留分析，主要包括酶联免疫检测法(ELISA)、化学发光法(CLIA)、高效液相色谱法(HPLC)、气相色谱-质谱联用法(GC/MS)、液相色谱-质谱联用法(LC/MS)等。CLIA对单个样本的检测速度快，灵敏度和自动化程度高，但试剂稳定性差、价格高、需要多次定标，不能重复检测，易受环境干扰，检测精度不高。ELISA最大优势在于避免了对环境的污染和人体的危害，但酶的纯度和反应过程易受环境因素的影响， 导致稳定性不高。色谱技术对CL的检测分离效率高、回收率高等自身优势，但操作繁琐费时，从样品预处理到得出检测结果至少需要2天时间，另外这种检测方法还需要价格昂贵的仪器设备，且需专业人员操作，每次只能检测一个样品，严重阻碍了这种检测方法的普及推广，更无法实现现场检测。近年来，随着胶体金免疫层析技术的发展，用胶体金竞争抑制免疫层析法检测样本中的盐酸克伦特罗已成为现实，但是与乳胶法相比，胶体金法检测成本高，同时在检测临界样本时，胶体金法检测结果不稳定。发明内容
为了解决上述问题，本发明设计了一种胶体金融合乳胶法半定量检测盐酸克伦特罗的检测试剂、试剂条和试剂盒及其制备方法，该检测试剂克服了胶体金竞争抑制免疫层析法检测临界样本显色慢、显色不均一的缺陷，同时采用该方法制备的试剂成本低、可多水平半定量检测盐酸克伦特罗的含量，且使用方便，操作简单。
本发明的技术方案为一种胶体金融合乳胶法半定量检测盐酸克伦特罗的检测试剂，所述试剂的制备方法包括以下步骤(1)胶体金的制备制备质量分数为0. 01%的氯金酸和0. 02%的柠檬酸三钠的混合水溶液；(2)胶体金标记物的制备和纯化将上述步骤(1)中制备的胶体金IOOml调节pH值至8.0，加入抗盐酸克伦特罗单克隆抗体1. 5mg，再逐滴加入25mg/ml聚乙二醇^il，离心弃上清液，离心沉淀用含0. 4mg/mlPEG 的PBS缓冲液IOml清洗2次，再将清洗后得到的沉淀用含体积分数为2% BSA的PBS缓冲液5ml溶解，然后将溶解液用无菌过滤器过滤，得到胶体金-抗体结合物，4°C保存；(3)乳胶颗粒的标记取乳胶颗粒用MES缓冲液透析盐酸克伦特罗单克隆抗体；将盐酸克伦特罗单克隆抗体和体积分数为1%的Tween-20溶液加入到乳胶颗粒中，并补充MES缓冲液，使盐酸克伦特罗单克隆抗体浓度大于5mg/ml，乳胶颗粒浓度为25mg/ml ；超声混勻并室温震荡；加入体积分数为1. 2%的60mg/ml的NHS溶液和体积分数为1. 2%的100mg/ml的EDAC溶液，室温震荡； 加入体积分数为20%的100mg/ml BSA溶液封闭，室温震荡；离心纯化标记后的乳胶颗粒，去上清，用体积分数为20%的lOOmg/mL的BSA溶液悬浮沉淀，得到乳胶_抗体结合物，并稀释到体积分数为10%后，分装；(4)胶体金和乳胶标记物的固相化将上述步骤(2)中制备的胶体金-抗体结合物和步骤(3)中制备的乳胶-抗体结合物溶液，分别固相于玻璃纤维和聚酯膜上；(5)包被硝酸纤维素膜5. 1将CL-BSA偶联物稀释成三个不同浓度，例如为1. 0mg/mL、3. Omg/mL、10mg/mL,呈横带状间隔喷于硝酸纤维素膜上；5. 2将羊抗鼠IgG单克隆抗体稀释到0. 5mg/mL,喷于上述步骤5. 1制得的硝酸纤维素膜上；5. 3将上述步骤5. 2制得的固定有偶联物和抗体的硝酸纤维素膜置37°C烘箱中干燥， 得到检测试剂产品。
一种盐酸克伦特罗检测试剂条，所述试剂条包括上述方法制备的胶体金融合乳胶法半定量检测盐酸克伦特罗的硝酸纤维素膜检测试剂；所述试剂条的制备方法，具体包括以下步骤(1)在支持板的中间位置粘贴上述检测试剂的方法制备的胶体金融合乳胶法半定量检测盐酸克伦特罗的检测试剂硝酸纤维素膜；(2)在支持板固定上述硝酸纤维素膜位置的上方，粘贴吸水垫，吸水垫覆盖硝酸纤维素膜边沿0. 5-1. 5毫米；(3)在支持板固定上述硝酸纤维素膜位置的下方粘贴上述检测试剂的制备方法中步骤 (4)制备的标有胶体金-抗体结合物的玻璃纤维样品垫以及标有乳胶-抗体结合物的聚酯膜；所述聚酯膜下方粘贴所述玻璃纤维样品垫覆盖聚酯膜0. 5-1. 5毫米；(4)将上述步骤(3)得到的产品压平整后，切成条。
一种盐酸克伦特罗的检测试剂盒，包括检测条和检测卡，其中，所述检测条为上述方法制备的盐酸克伦特罗检测试剂条，包括底板；5所述底板分为手柄区、观察区、标记区和加样区； 所述手柄区的底板上设有用来吸水的滤纸支撑层；所述观察区的底板上设有上述方法制备的硝酸纤维素膜，所述硝酸纤维素膜靠近手柄区的一端设有包被羊抗鼠抗体的对照线，另一端设有包被CL-BSA偶联物的3条检测线； 所述标记区的底板上标记有CL单克隆抗体； 所述加样区的底板上设有玻璃纤维样品垫。
进一步地，所述检测卡包括卡盖和盒状卡体；所述卡盖的一端设有用来滴加测试样品的漏斗状的加样孔，所述状加样孔与所述底板的加样区的位置相对应；所述卡盖的中间部位设有用来观察测试结果的条形的观测孔，所述观测孔与所述底板的观察区的位置相对应；所述卡盖的底面上设有若干个用来固定卡盖和卡体的定位销，所述卡体上设有与定位销配合的定位槽；所述检测条设置在卡盖与卡体之间。
作为上述技术方案的再一种优选方案，所述卡盖的底部设有固定柱和块状凸起； 所述卡体上也设有块状凸起。
作为上述技术方案进一步的优选方案，所述卡体上设有用来固定检测条水平位置的卡位突起。
作为上述技术方案的另一种优选方案，所述卡盖上对应对照线的一侧标注有字母 “C”，对应检测线的一侧标注有字母“T”。
检测样的处理方法(1)尿液样本用干燥、洁净的离心管或容器采集尿液；如果不立即检测，可将尿样冷冻保存；短期可进行冷藏保存，注意避免腐败造成失效或污染；如果尿样出现沉淀或浑浊物，要离心后再检测。
(2)血清样本抽取待检动物血液，离心或静置，取透明的上清液血清层，若血清有过度溶血现象，将血清以蒸馏水稀释一倍后再检测；(3)饲料样本样品粉碎后过20目筛，得试样。取2g试样于50ml离心管中，加入IOmL 的水提取液，混勻，置于超声波水浴中超声30分钟，其间每10分钟取出混勻1次，然后取出恢复至室温，4000转/分钟，离心5分钟，取上清液检测；(4)肌肉或内脏样本样品完全勻浆后，称取4.Og置于离心管中，加入50mmol/L盐酸溶液20mL，充分振荡混勻5min或超声混勻5min，再静置10分钟；或者加入盐酸后直接摇床振摇30min ；称取6. Og完全均质的样品，置于另一个离心管中，加入2mol/L的NaOH溶液 125 μ 1，混勻5min之后4000rpm或更高速离心20min，离心温度保持在10°C左右，吸取上清直接用于检测；检测方法测试过程中向加样孔中用吸管吸取待检样本，滴加3滴待检样本于加样孔中，样本沿样品垫缓慢上移，在加样后5-10分钟判读结果。
检测结果判断通过计算显色条带数量的多少，从而确定样本中CL的含量，色带数量越少，样本中CL含量越高。
如果出现四条红色条带，不管色带深浅如何，都表明结果为阴性；如果第一条带不显红色，后三条显红色，结果为阳性，含量Ing/mL;如果第一、二条带不显红色，后两条带显红色含量为3. Ong/mL;如果第一、二、三条带不显红色，仅第四条带显红色含量彡 100ng/mL。
本发明检测试剂采用纳米级胶体金和乳胶颗粒作为标记示踪物，应用CL-BSA偶联物，结合单克隆抗体，依据免疫竞争法原理，检测样本中的盐酸克伦特罗抗体。
本发明采用竞争抑制免疫层析的原理，检测CL抗体时，将CL单克隆抗体分别固相于聚酯膜的乳胶和玻璃纤维的胶体金上，再将不同浓度的CL-BSA (牛血清白蛋白)偶联物喷于硝酸纤维素膜上，滴加样本后，由于毛细管作用，如果样本中存在CL，CL在流动过程中与胶体金和乳胶标记的特异性抗体结合，抑制了抗体与固相载体膜上的CL-BSA偶联物的结合，通过计算显色条带数量的多少，从而确定样本中CL的含量，色带数量越少，样本中CL 含量越高，使用方便，操作简单。
本发明的优点在于1、成本低不需特殊仪器及其他试剂，使现场检测一步到位，见效快；成本主要取决于原料，乳胶和所标抗体用量仅为胶体金和所标抗体用量的一半，乳胶法原料成本仅为胶体金法的1/5 1/6，在达到同样灵敏度、特异性和稳定性的情况下，成本大大降低；2、准确性高、稳定性强采用本发明所的技术方案，显示条带越少，浓度越高，实现了多水平半定量式检测；在盐酸克伦特罗标准品浓度为0. Ing/mL时，胶体金融合乳胶法的检测结果有199例出现阳性，胶体金法的检测结果有197例出现阳性，说明两种检测方法的灵敏度均能达到0. Ing/mL，但是胶体金融合乳胶法的稳定性要强于胶体金法；3、显色更快、更均一、更稳定采用了胶体金融合乳胶法生产检测条，由于乳胶标记除了被动吸附，还可以用共价结合，因此在临界样本时，胶体金融合乳胶法显色更快、更均一、 更稳定；4、使用方便，操作简单减少了许多繁琐的程序，方便、快捷、直观，易操作，全过程只需 10分钟，能够满足食品安全、饲料、屠宰企业及政府检测机构的检测需求，具有较高的社会价值和经济价值；5、真正达到复杂原理与简易操作的有机统一，同时该试剂盒具有保存方便，有效期长的特点。
胶体金法和乳胶法是免疫层析法中根据标记物不同而出现的两种检测技术，它们在竞争法中的特点对比如下表所示表1胶体金法、乳胶法及胶体金融合乳胶法检测对比
权利要求
1.一种胶体金融合乳胶法半定量检测盐酸克伦特罗的检测试剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤(1)胶体金的制备制备质量分数为0. 01%的氯金酸和0. 02%的柠檬酸三钠的混合水溶液；(2)胶体金标记物的制备和纯化将上述步骤(1)中制备的胶体金IOOml调节pH值至8. 0，加入抗盐酸克伦特罗单克隆抗体1. 5mg,再逐滴加入25mg/ml聚乙二醇^il，离心弃上清液，离心沉淀用含0. 4mg/mlPEG 的PBS缓冲液IOml清洗2次，再将清洗后得到的沉淀用含体积分数为2% BSA的PBS缓冲液5ml溶解，然后将溶解液用无菌过滤器过滤，得到胶体金-抗体结合物，4°C保存；(3)乳胶颗粒的标记取乳胶颗粒用MES缓冲液透析盐酸克伦特罗单克隆抗体；将盐酸克伦特罗单克隆抗体和Tween-20溶液加入到乳胶颗粒中，并补充MES缓冲液，使盐酸克伦特罗单克隆抗体浓度大于5mg/ml，乳胶颗粒浓度为25mg/ml ；超声混勻并室温震荡；加入体积分数为1. 2%的 60mg/ml的NHS溶液和体积分数为1. 2%的100mg/ml的EDAC溶液，室温震荡；加入体积分数为20%的100mg/ml BSA溶液封闭，室温震荡；离心纯化标记后的乳胶颗粒，去上清，用BSA 溶液悬浮沉淀，得到乳胶-抗体结合物，并稀释到体积分数为10%后，分装；(4)胶体金和乳胶标记物的固相化将上述步骤(2)中制备的胶体金-抗体结合物和步骤(3)中制备的乳胶-抗体结合物溶液，分别固相于玻璃纤维和聚酯膜上；(5)包被硝酸纤维素膜5. 1将CL-BSA偶联物稀释成三个不同浓度，呈横带状间隔喷于硝酸纤维素膜上；5. 2将羊抗鼠IgG单克隆抗体稀释到0. 5mg/mL,喷于上述步骤5. 1制得的硝酸纤维素膜上；5. 3将上述步骤5. 2制得的固定有偶联物和抗体的硝酸纤维素膜置37°C烘箱中干燥， 得到检测试剂产品。
2.一种盐酸克伦特罗检测试剂条的制备方法，其特征在于，包括以下步骤(1)在支持板的中间位置粘贴上述权利要求1所述的方法制备得到的盐酸克伦特罗检测试剂硝酸纤维素膜；(2)在支持板固定上述步骤(1)所述硝酸纤维素膜位置的上方，粘贴吸水垫，吸水垫覆盖硝酸纤维素膜边沿0. 5-1. 5毫米；(3)在支持板固定上述步骤(2)所述硝酸纤维素膜位置的下方粘贴上述权利要求1所述方法步骤(4)制备的标有胶体金-抗体结合物的玻璃纤维样品垫以及标有乳胶-抗体结合物的聚酯膜；所述聚酯膜下方粘贴所述玻璃纤维样品垫覆盖聚酯膜0. 5-1. 5毫米；(4)将上述步骤(3)得到的产品压平整后，切成条。
3.—种盐酸克伦特罗的检测试剂盒，包括检测条和检测卡，其特征在于所述检测条为上述权利要求2所述的方法制备的盐酸克伦特罗检测试剂条，所述检测条包括底板；所述底板分为手柄区、观察区、标记区和加样区；所述手柄区的底板上设有用来吸水的滤纸支撑层；所述观察区的底板上设有上述权利要求1所述的方法制备得到的盐酸克伦特罗检测试剂硝酸纤维素膜，所述硝酸纤维素膜靠近手柄区的一端设有包被羊抗鼠抗体的对照线， 另一端设有包被CL-BSA偶联物的3条检测线；所述标记区的底板上标记有CL单克隆抗体；所述加样区的底板上设有玻璃纤维样品垫。
4.根据权利要求3所述的盐酸克伦特罗的检测试剂盒，其特征在于所述检测卡包括卡盖和盒状卡体；所述卡盖的一端设有用来滴加测试样品的漏斗状的加样孔，所述状加样孔与所述底板的加样区的位置相对应；所述卡盖的中间部位设有用来观察测试结果的条形的观测孔，所述观测孔与所述底板的观察区的位置相对应；所述卡盖的底面上设有若干个用来固定卡盖和卡体的定位销，所述卡体上设有与定位销配合的定位槽；所述检测条设置在卡盖与卡体之间。
5.根据权利要求4所述的盐酸克伦特罗的检测试剂盒，其特征在于所述卡盖的底部设有固定柱和块状凸起；所述卡体上也设有块状凸起。
6.根据权利要求5所述的盐酸克伦特罗的检测试剂盒，其特征在于所述卡体上设有用来固定检测条水平位置的卡位突起。
全文摘要
本发明公开了一种胶体金融合乳胶法半定量检测盐酸克伦特罗的检测试剂、试剂条和试剂盒及其制备方法，包括胶体金的制备、胶体金标记物的制备和纯化、乳胶颗粒的标记、胶体金和乳胶标记物的固相化、包被硝酸纤维素膜、试剂条的制备以及检测试剂盒的制备；本发明的优点在于成本低，准确性高、稳定性强，显色更快、更均一、更稳定，使用方便，操作简单，真正达到复杂原理与简易操作的有机统一，同时该试剂盒具有保存方便，有效期长的特点。
文档编号G01N33/577GK102520180SQ20111041454
公开日2012年6月27日 申请日期2011年12月13日 优先权日2011年12月13日
发明者付伟光, 单永德, 杨致亭, 王增祺, 王好玉 申请人:青岛汉唐生物科技有限公司