专利名称：一种微生物饲料添加剂生产方法
技术领域：
本发明属于饲料添加剂领域，特别涉及含有多种活菌制剂的微生物饲料添加剂产品及其生产方法和应用。
背景技术：
目前我国奶牛存栏数约1000多万头，奶产量900多万吨，奶牛养殖业的迅速发展也促进和推动了我国饲料及添加剂行业的发展；但我国奶牛饲料仍停留在三大料 (即玉米、麸皮、饼粕)的简单混合上，造成配方中蛋白质饲料单一、氨基酸搭配不当，奶的产量和质量与欧美国家相比都有很大差距。研究开发高效生物活性饲料添加剂，对于提高我国奶牛生产的水平，改善牛奶的质量，减少奶牛胃肠疾病和乳房炎的发病率，降低粪尿的不良气味和粪尿氮的排除量，减少环境污染和充分提高饲料资源的有效利用(即提高廉价粗饲料的利用率，提高饲料中营养物质的利用率等)具有重要的实际应用价值。目前市场上流行的活菌制剂大多都是单一菌，而且主要应用在单胃动物饲料中，用于反刍动物(如奶牛)的产品目前只有美国和法国的2-3家的单一菌种制剂在我国宣传和做养殖推广实验。枯草芽孢杆菌、植物乳杆菌都是可以应用于饲料添加剂行业的益生菌，益生菌代谢产生的各种酶制剂及其有益代谢成分在促进消化、稳定肠道菌群环境、提高饲料利用率方面具有较好的效果；泡盛曲霉可以代谢产生包括葡聚糖酶在内的多种酶制剂，其培养物作为饲料添加剂可以有效提高饲料的消化吸收效果。研制开发具有科学配比，且效果明显的的含有多种有益微生物且酶活力强的复合饲料添加剂对于促进养殖业，特别是奶牛养殖业具有非常重要的意义。
发明内容
本发明解决的技术问题是提供一种微生物活性饲料添加剂产品生产方法。本发明产品的具体生产方法步骤如下1.微生物菌剂的培养制备分别扩培并干燥得到黑曲霉孢子、绿色木霉孢子、枯草芽孢杆菌、酿酒酵母和鼠李糖乳杆菌。(1)黑曲霉孢子制备斜面孢子悬浮液液接种到10° Brix麦芽汁固态培养基上， 30°C培养2天半至长满孢子，低温流化床干燥，粉碎干燥物。(2)绿色木霉孢子制备斜面孢子悬浮液液接种到10° Brix麦芽汁固态培养基上，30°C培养2天半至长满孢子，低温流化床干燥，粉碎干燥物。(3)枯草芽孢杆菌的制备斜面菌株经活化后，接入液体种子培养基，在37°C、 180rpm的摇床培养14h后接种至发酵罐中，在37°C、通风比1 1 (ν/ν)，400rpm培养2天至对数后期。发酵结束后，加入助滤剂轻质碳酸钙，经板框过滤，流化床干燥。(4)酿酒酵母的制备斜面菌种接入三角瓶，培养至对数期后转接入发酵罐中，控制温度为观°0，通风比为1 1.5 (ν/ν)，培养20小时左右至对数期。发酵结束后，加入助滤剂轻质碳酸钙，经板框过滤，流化床干燥。(5)鼠李糖乳杆菌的制备斜面菌种接入三角瓶，培养至对数期后转接入发酵罐中，控制温度为45，通风比为1 0.1 (ν/ν)，培养18小时左右至对数期。发酵完毕经板框过滤分离获得湿菌体，加入组成为10%脱脂奶、5%海藻糖、5%甘油的保护剂，通过冷冻干燥获得菌剂，水分含量低于10%。2、菌剂复配将上述各种菌按照比例进行复配，菌剂复配比例如下黑曲霉孢子 15-25份、绿色木霉孢子10-25份、枯草芽孢杆菌10-25份、酿酒酵母15-25份和鼠李糖乳杆菌25-40份。本发明采用的菌种如下黑曲霉(Aspergillusniger)CGMCC No. 3. 5269、绿色木霉(Trichoderma viride) CGMCC No. 3.四42、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtil is) CGMCC No. 1. 210购买于中国普通微
生物菌种保藏管理中心。酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae) CGMCC No. 44 菌种同专利申请名称为一株耐高渗酵母菌的应用中保藏菌种，专利申请号201110105966，
公开日为2011.09. 14。鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)CGMCC No. 4430菌株特点如下在显微镜下观察，该菌株为杆状，宽度小于1 μ m，2到3个杆菌易于连成连接在一起；在固体培养基上，该菌菌落为乳白色，表面光滑，湿润，粘稠，边缘较整齐。与原始菌相比，该诱变菌株在形态上明显小于出发菌株。出发菌株鼠李糖乳杆菌CGMCCNo. 1.2134购于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。本发明鼠李糖乳杆菌采用下述流程进行选育原始出发菌种一试管活化一高温驯化一硫酸二乙酯(DEQ诱变一高糖平板筛选一亚硝基胍(NTG)诱变筛选一高温菌筛选一摇瓶复筛一传代稳定性试验一5L发酵罐试验。将目的菌株CGMCC No. 4430做5L乳酸发酵罐实验，结果表明与出发菌株相比，CGMCC No. 4430葡萄糖耐受浓度可以达到270g/L，与原始菌相比提高了 95% ；发酵结束后，乳酸含量为60g/L，与原始菌相比提高了 158%。鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)CGMCC No. 4430保藏单位是中国普通微生物菌种保藏管理中心。地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101。上述四种菌种的保藏单位是中国普通微生物菌种保藏管理中心。地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101。本发明中黑曲霉孢子、绿色木霉孢子采用血球板计数法，其它菌种采用微生物平板计数方法检测活菌数。本发明中菌剂复配的较优比例为黑曲霉孢子15-20份、绿色木霉孢子10-20份、 枯草芽孢杆菌1020份、酿酒酵母15-20份和鼠李糖乳杆菌25-35份。由本方法得到生物饲料添加剂组成为黑曲霉孢子浓度1.0 9. OX IO8个/克、绿色木霉孢子浓度1.0 9.0父108个/ 克、枯草芽孢杆菌为1. 0 9. 0X IO8个/克、酿酒酵母1. 0 8. 5X IO8个/克、鼠李糖乳杆菌1.3 8. 5X IO8个/克。发明产品采用科学研究的菌剂复配比例技术有效确保产品中各种微生物菌剂的合理组成和比例，使得产品中微生物产生的酶在奶牛饲喂中可以有效促进饲料的消化吸收；复配技术使得产品在奶牛饲料的消化吸收率大幅提高，单位用量饲料的产出比例比对照有了显著提高，奶牛的产量和质量得以提高和保障。发明产品的性能稳定，使用安全，与其它饲料添加剂均无配合禁忌。本发明产品在质量稳定可控，无环境污染，而且可以提高免疫力能够提高养殖效益。产品完全符合绿色饲料添加剂的要求。有明显提高日增重和饲料转化率效果。本发明产品中鼠李糖乳杆菌和酿酒酵母对动物胃肠道的消化有辅助作用，酿酒酵母在瘤胃中为瘤胃微生物的生长繁殖提供了有益的氨基酸、B族维生素和其它微量元素，增加瘤胃微生物蛋白质的合成量，鼠李糖乳杆菌在奶牛的小肠释放，可以消耗动物肠道内的氧气，使肠道内有害的致病菌如好氧菌(主要是大肠杆菌、沙门氏菌等)受到抑制，还能抑制氨和胺的合成，益增强免疫力，达到改善奶牛胃肠道微生物生态平衡，有利于健康和提高生产性能的目的；枯草芽孢杆菌在肠道代谢产生的酶类和黑曲霉、绿色木霉发酵培养物中含有的有效剂量的纤维素酶、葡聚糖酶、木质素分解酶和淀粉酶有利于奶牛等反刍动物饲料中纤维类饲料的消化吸收，改善反刍动物肠道的微生态平衡，提高饲料利用率，提高奶牛产奶量，提高牛奶的品质，提高奶牛肌体免疫力，减少肠道疾病，净化饲养环境。该饲料添加剂可应用于奶牛养殖业，可以显著提高牛奶产量和质量。本发明产品能够提高奶牛肌体免疫力，减少隐性乳房炎、肠道疾病的发病率。目前，我国奶牛群中隐性乳房炎发病率是比较高的，奶牛一旦患有乳房炎就必须注射抗生素治疗，注射了抗生素的奶牛7天之内所产出的牛奶都不能出售(牛奶中会残留抗生素对人体有危害)。使用本发明产品可以降低奶牛隐性乳房炎发病率，饲喂试验表明本发明产品降低乳房炎发病率70% (与对照组比较)，明显减少奶牛乳房炎的发生，减少抗生素的使用和含抗生素奶的产出，间接提高了养殖者的效益。本发明产品对提高我国奶牛生产的水平，充分提高饲料资源的有效利用(即提高廉价粗饲料的利用率，提高饲科中营养物质的利用率等)等方面都具有很高的价值。本发明也适合其他反刍动物如肉牛、羊的饲喂。
具体实施例方式下面的实施例可以使本专业技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。例 1产品生产方法主要包括微生物饲料添加剂生产和复配工艺。微生物菌剂的生产黑曲霉和绿色木霉孢子的制备方法1.斜面培养方法斜面培养基IOmL加入试管，121°C，20min灭菌后，摆斜面，冷却，接种。30°C培养到黑色孢子铺满斜面.2. K式培养瓶孢子取10° Brix麦芽汁加入2%琼脂，装入500mL K式培养瓶，121°C，20min灭菌后， 铺斜面冷却。接入孢子悬浮液lmL，保证悬浮液接种于整个培养基表面；侧放入恒温箱， 30°C培养到黑色孢子铺满斜面。3.固态放大培养将K式瓶孢子制成孢子悬浮液，孢子浓度大于1. OX IO8个/mL。取200kg固态培养基(麸皮140kg、10° Brix麦芽汁60L)，充分混勻后放入浅盘，在121°C下灭菌1小时。 待放凉后，接入孢子悬浮液，搅拌均勻。培养温度控制在30°C，湿度80-90%，每隔10小时翻料一次，培养时间3大；待培养料长满孢子即可结束培养干燥粉碎发醇结束后，将浅盘放在流化床干燥，干燥温度控制在60°C，待物料水分含量将低于10%以下时，用粉碎机将固体培养料进行粉碎，物料粉碎孔径在100目以上。枯草芽孢杆菌的制备方法培养基组成(g/L)葡萄糖60，酵母提取物20，磷酸氢二钾0. 5，七水硫酸镁0. 5， ρΗ6· 8。(1) 一级种子培养500mL摇瓶装液量为lOOmL，灭菌后接入一环枯草芽孢杆菌，在摇床上，180转/分，培养温度37°C，培养时间M小时至对数期；(2) 二级种子培养将一级种子按照10% (ν/ν)的接种量接入30L的种子罐中，装液量21L，培养温度37°C，搅拌速度200转/分，通风量(V/V)l 0. 5，罐压0. 05Mpa，培养时间M小时至对数期。(3)发酵罐培养将种子罐中的种子以10% (ν/ν)接种量接入300L发酵罐，装液量210L，培养温度37°C，搅拌速度200转/分，通风量(V/V) 1 0. 5，罐压0. 05Mpa,培养时间M小时，培养结束菌浓度在5. OX IO9个/mL。(4)离心分离采用板框过滤分离获得菌体。(7)真空冷冻干燥添加保护剂后采用喷雾干燥工艺处理获得干粉菌剂；保护剂组成为脱脂奶10<%、乳糖5%、甘油5(%。酿酒酵母菌的制备方法从斜面转接酵母菌到液体摇瓶，液体摇瓶经三级扩培后转接入发酵罐进行扩大培养，培养完毕低温浓缩、与载体混合，流化床干燥工艺获得活性酵母菌剂。酵母细胞的培养采用斜面菌种逐级扩培获得酵母细胞；(1) 一级种子培养将酵母斜面菌种接入500mL摇瓶中，培养基装量lOOmL，旋转式摇床120转/分，培养温度30°C，培养时间18小时；(2) 二级种子培养将一级种子按照10的接种量接入500mL 二级种子摇瓶中，培养条件与一级种子相同；(3)三级种子培养将二级种子以10%接种量接入5000mL三级种子摇瓶中，培养基装量IOOOmL,旋转式摇床100转/分，培养温度30°C，培养时间18小时；(4) 一级种子罐培养将三级种子以5%接种量接入总容积为150L的一级种子罐， 发酵培养基装量100L，培养温度30°C，搅拌速度100转/分，通风量(V/V)l 0.5，罐压 0. 05Mpa，培养时间16小时；(5)发酵罐培养将一级种子罐菌种以5%接种量(ν/ν)接入总容积为3吨二级种子罐，发酵培养基装量2吨，培养条件培养温度30°C，搅拌速度100转/分，前期通风量(V/ V)1 0. 5，罐压0.05Mpa，前期培养时间12小时；后期罐压0.05Mpa，搅拌速度50转/分， 培养时间8小时，培养末期的酵母浓度达到3. 0X109f/mL。(6)浓缩发酵液经低温负压真空浓缩到原体积的45%，得到酵母菌浓缩液。(7)添加载体向酵母菌浓缩液中添加混合好的载体，混合均勻；浓缩液与载体的重量比为0. 5-0. 7 1，载体组成为=CaCO3 40份，糊精20份，玉米蛋白粉20份。(8)干燥流体床干燥，干燥温度50°C。培养基采用10%麦芽汁培养基或采用添加硫酸铵等无机盐的糖蜜培养基，具体培
6养生产工艺参见肖冬光《酿酒活性干酵母的生产与应用技术》。鼠李糖乳杆菌菌剂的制备斜面菌种接入三角瓶，培养至对数期后转接入发酵罐中，控制温度为45°C，通风比为1 0.1 (ν/ν)，培养18小时左右至对数期。发酵完毕经板框过滤分离获得湿菌体，加入组成为10%脱脂奶、5%海藻糖、5%甘油的保护剂，通过冷冻干燥获得菌剂，水分含量低于 10%。菌剂复配黑曲霉15份、绿色木霉孢子15份、枯草芽孢杆菌15份、酿酒酵母25份、 鼠李糖乳杆菌30份黑曲霉孢子浓度2. 5 X IO8个/克、绿色木霉孢子浓度3. OX IO8个/克、枯草芽孢杆菌为3. 5Χ IO8个/克、酿酒酵母3. OX IO8个/克、鼠李糖乳杆菌4. OX IO8个/克。实施例2 基本同例1菌剂复配将上述各种菌剂按照如下比例进行复配黑曲霉20份、绿色木霉孢子10份、枯草芽孢杆菌15份、酿酒酵母20份、鼠李糖乳杆菌；35份。产品组成如下黑曲霉孢子浓度2. OX IO8个/克、绿色木霉孢子浓度2. OX IO8个 /克、枯草芽孢杆菌为1. OX IO8个/克、酿酒酵母5. 5Χ IO8个/克、鼠李糖乳杆菌7. 5X IO8
个/克。实施例3 高效活性饲料添加剂产品菌剂复配将上述各种菌剂按照如下比例进行复配黑曲霉18份、绿色木霉孢子12份、枯草芽孢杆菌15份、酿酒酵母20份、鼠李糖乳杆菌30份。组成如下黑曲霉孢子浓度5 X IO8个/克、绿色木霉孢子浓度5. 0 X IO8个/克、枯草芽孢杆菌为5X IO8个/克、酿酒酵母6X IO8个/克、鼠李糖乳杆菌6X IO8个/克。产品效果实验试验牛的选择与试验设计试验于2010年9月7日-10月7日在宁夏吴忠金积奶牛场进行，本试验采取随机配对原则，将10头牛随机的分为试验组和对照组，每组20头牛， 在日粮中按每头每日添加产品40g，饲喂60天，结果表明实验组日增重972. 7g，对照组日增重746. 8g，差异极显著(P <0.01)。饲喂5天后，其粪便干物质和饲喂前相比，减少30%。使用高效生物活性饲料添加剂1个月后，发现牛奶产量比较稳定，(不喂的组下降幅度较大，因为试验生已过了泌乳高峰期)，乳脂率也增加了，效果很好。从奶牛外表来看， 喂高效生物活性饲料添加剂的奶牛的毛亮，食欲好，乳房炎发病率降低。
权利要求
1.一种微生物饲料添加剂生产方法，步骤如下1微生物菌剂的培养制备分别扩培并干燥得到黑曲霉孢子、绿色木霉孢子、枯草芽孢杆菌、酿酒酵母和鼠李糖乳杆菌；菌剂复配将上述各种菌按照比例进行复配，菌剂复配比例如下黑曲霉孢子15-25份、绿色木霉孢子10-25份、枯草芽孢杆菌10-25份、酿酒酵母 15-25份和鼠李糖乳杆菌25-40份。
2.如权1所述一种微生物饲料添加剂生产方法，其特征在于菌剂复配比例为黑曲霉孢子15-20份、绿色木霉孢子10-20份、枯草芽孢杆菌10-20份、酿酒酵母15-20份和鼠李糖乳杆菌25-35份。
3.如权1或2所述一种微生物饲料添加剂生产方法，其特征在于菌剂复配比例为黑曲霉15份、绿色木霉孢子15份、枯草芽孢杆菌15份、酿酒酵母25份、鼠李糖乳杆菌30份。
4.如权1-3所述一种微生物饲料添加剂生产方法，其特征在于所述鼠李糖乳杆菌为 CGMCCNo. 4430。
全文摘要
本发明公开了一种微生物饲料添加剂生产方法，属于饲料添加剂领域，解决了含有多种活菌制剂的高效生物饲料添加剂产品及其生产方法和应用的技术问题。涉及生物饲料添加剂组成为黑曲霉孢子浓度1.0～9.0×108个/克、绿色木霉孢子浓度1.0～9.0×108个/克、枯草芽孢杆菌为1.0～9.0×108个/克、酿酒酵母1.0～8.5×108个/克、鼠李糖乳杆菌1.3～8.5×108个/克。本饲料含有多种有益微生物且酶活力强，经实验验证本饲料对于奶牛产奶量及牛奶成分均有显著提高作用。
文档编号C12R1/885GK102488114SQ201110419959
公开日2012年6月13日 申请日期2011年12月15日 优先权日2011年12月15日
发明者张健飞, 李政, 李绩, 王玉 申请人:天津工业大学