专利名称：一种紫贻贝g型溶菌酶基因及其重组蛋白和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及溶菌酶，具体的说是一种紫贻贝G型溶菌酶基因及其重组蛋白和应用。
背景技术：
溶菌酶(Lysozyme，EC 3.2.1.17)是无脊椎动物体内非常重要的非特异免疫因子之一，它主要通过切断肽聚糖中N-乙酰葡萄糖胺和N-乙酰胞壁酸之间的β -1，4糖苷键之间的联结，破坏肽聚糖支架，使细胞胀裂从而引起细菌裂解。溶菌酶在机体免疫应答过程中不仅能直接杀死细菌，还可诱导调节其他免疫因子的合成与分泌。溶菌酶按照其来源分为六类:C (chicken)型，G (goose)型，I (invertebrate)型，植物型，细菌型和T4嗤菌体型溶菌酶。动物界的溶菌酶包括前三种类型。C型溶菌酶大都来自于脊椎动物和节肢动物；6型溶菌酶主要存在于哺乳动物、鸟类和鱼类中；而I型溶菌酶只存在于无脊椎动物中。溶菌酶的主要功能是抗菌作用，早期研究发现多数C型溶菌酶通常只能溶解革兰氏阳性菌。最近研究发现，美洲牡蛎和文蛤I型溶菌酶，以及栉孔扇贝、牙鲆、大黄鱼、斜带石斑鱼和大菱鲆G型溶菌酶都具有溶解革兰氏阴性菌的功能。由于G型溶菌酶对各种病原菌具有较好的抗菌作用，在较低温度活性较高且具有较强的热稳定性，因此在开发作为水产饲料添加剂和水产品保鲜剂方面具有很好的应用前景。在海洋贝类中，仅在海湾扇贝和栉孔扇贝体内发现了 G型溶菌酶，并进行了较为系统的研究。目前国内外关于紫贻贝G型溶菌酶及其抗菌活性的研究较少
发明内容
本发明目的在于提供一种紫贻贝G型溶菌酶基因及其重组蛋白和应用。为实现上述目的，本发明采用的技术方案为:一种紫贻贝G型溶菌酶基因，G型溶菌酶基因如序列表SEQ ID N0.1中的碱基序列所示。紫贻贝G型溶菌酶基因编码蛋白，G型溶菌酶基因编码蛋白如序列表SEQ ID N0.2中的氨基酸序列所示。紫贻贝G型溶菌酶基因重组蛋白的应用，所述G型溶菌酶基因重组表达产物可制备为抗菌药物、水产品保鲜剂或水产饲料添加剂。所述G型溶菌酶基因重组表达产物可作为制备革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌的抑菌药物。紫贻贝重组溶菌酶对革兰氏阳性菌为巴氏葡萄球菌或金黄色葡萄球菌；革兰氏阴性菌为溶藻弧菌、阴沟肠杆菌、恶臭假单胞菌、奇异变形杆菌、产气肠杆菌或副溶血弧菌。所述G型溶菌酶基因重组表达产物可作为制备恶臭假单胞菌的抑菌药物。与现有技术相比，本发明的优点在于:本发明紫贻贝G型溶菌酶，包括从感染病菌的紫贻贝中提取总RNA、mRNA纯化、cDNA模板溶液制备、G型溶菌酶基因筛选、基因克隆、重组质粒构建、重组基因表达和重组蛋白纯化步骤得到该G型溶菌酶，该G型溶菌酶的氨基酸序列如序列表SEQ ID N0.2所示；该G型溶菌酶属于一类新颖的紫贻贝溶菌酶，对海洋来源的多种革兰氏阳性和阴性病原微生物均具有很强的抑制活性，具有开发为食品保鲜剂、遗传选育和饲料添加剂等方面的应用价值；该G型溶菌酶的制备方法，通过总RNA提取、mRNA纯化、cDNA模板溶液制备、G型溶菌酶基因筛选、基因克隆、重组质粒构建、重组基因表达和重组蛋白纯化步骤，能得到纯度较高的重组紫贻贝G型溶菌酶。
具体实施例方式以下结合实施例对本发明作进一步详细描述。本发明还提供了紫贻贝G型溶菌酶的制备方法和应用，该制备方法能得到纯度较高的重组紫贻贝G型溶菌酶，具体可以在开发食品保鲜剂和饲料添加剂中得到应用。本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为:紫贻贝G型溶菌酶，包括从感染病菌的紫贻贝提取总RNA、mRNA纯化、cDNA模板制备、G型溶菌酶基因筛选、基因克隆、重组质粒构建、重组基因表达和重组蛋白纯化步骤得到该G型溶菌酶，该G型溶菌酶的氨基酸序列如序列表SEQ ID N0.2所示。紫贻贝G型溶菌酶的制备方法，包括下述步骤:I)总RNA提取:用Trizol试剂从感染鳗弧菌的紫贻贝血淋巴中提取总RNA，存于_80°C备用；提取方法依Invitrogen公司的Trizol试剂说明书进行；2)mRNA纯化:用Oligotex mRNA纯化试剂盒将上述总RNA纯化得到mRNA ;纯化方法依据QIAGENE公司的Oligotex mRNA纯化试剂盒说明书进行；3) cDNA模板制备:用cDNA Synthesis Kit试剂盒(购于Stratagene公司)将上述mRNA逆转录并酶切为酶切片段，具体操作方法依试剂盒说明书进行:包括双链cDNA经末端补平、EcoR I接头连接、EcoR I末端磷酸化、Xho I内切酶酶切等，用QIAEX II AgaroseGel Extraction Kit纯化试剂盒(购于QIAGEN公司)对大于IOObp的酶切片段进行回收，回收的酶切片段与Un1-ZAP XR载体(购于Invetrogen公司)连接,得到是cDNA质粒,用ZAP-cDNA Gigapack III Gold Cloning Kit 试剂盒(购于 Stratagene 公司)对 cDNA质粒进行噬菌体包装、滴度测定、噬菌体文库扩增，扩增后的噬菌体文库加入体积百分终浓度为7%的二甲基亚砜(DMSO)，得到含G型溶菌酶基因的cDNA模板溶液，存于_80°C ;具体包装、测定和扩增方法依试剂盒说明书进行；4)基因克隆:对上述含G型溶菌酶基因的cDNA模板进行PCR扩增得到PCR产物，PCR扩增的上游引物的核苷酸序列为:(正向引物序列:5’-CGTCGAATACTGTGAAGCA-3’，反向引物的核苷酸序列为:5’ -GACCCTTCTACATACTACCAA-3’，)PCR产物用胶回收试剂盒(购于上海中科开瑞生物芯片公司)进行回收和纯化得到PCR纯化产物，将所述PCR纯化产物与PMD-18T载体(购于大连宝生物工程有限公司)连接得到克隆质粒，克隆质粒转入大肠杆菌TOPlOF感受态细胞(购于北京全氏金生物技术有限公司)中，挑选阳性克隆质粒提取，得到G型溶菌酶基因的克隆质粒；3’端PCR扩增的反应体系和反应条件为:10XPCR缓冲溶液2.5 μ l、25mM氯化镁溶液Ι.ομ 1、2.5mM的dNTP 2.0 μ 1 、10 μ M的所述正向引物溶液I μ 1、10 μ M的通用引物T7溶液I μ 1、浓度为5U/ μ I的Taq DNA聚合酶0.2 μ 1，所述cDNA模板溶液I μ 1，用PCR水定容到25 μ I ;反应在ABI Veriti PCR仪(购于ABI公司)中进行，反应条件为首先94°C预变性5分钟，然后进入下列循环:94°C变性30秒，60°C退火30秒，72°C延伸60秒，共进行34个循环，最后72°C延伸10分钟；5’端PCR扩增反应体系和反应条件为:10XPCR反应缓冲液2.5 μ l、25mM氯化镁溶液1.0 μ 1、2.5mM的dNTP溶液2.0 μ 1、10 μ M的所述反向引物溶液I μ 1、10 μ M的通用引物Τ3溶液I μ 1、浓度为5U/μ I的Taq DNA聚合酶0.2 μ I，所述cDNA模板溶液I μ 1，用PCR水定容到25 μ 1，反应在ABIVeriti PCR仪中进行，反应条件为首先94°C预变性5分钟，然后进入下列循环:94°C变性30秒，60°C退火30秒，72°C延伸60秒，共进行34个循环，最后72°C延伸10分钟；上述PCR缓冲溶液、dNTP、PCR水、Taq DNA聚合酶均购自Promega公司，通用引物T7、通用引物T3购自上海生工科技有限公司。5)重组质粒构建:对G型溶菌酶基因的克隆质粒进行扩增反应，扩增反应正向引物为含有Nde I酶切位点的核苷酸序列(5 ’ -CATATGGCGAACTATAATTGTCATGG-3 ’，其中划线上的序列表示Nde I酶切位点)，反向引物为含Xho I酶切位点和6个His纯化标签的5，-CTCGAGCTA |GTGGTGGTGGTGGTGGTG| CCAATGATAATGGCTAA-3'下划线为 Xho I 酶切位
点，方框为His纯化标签)核苷酸序；将扩增片段纯化回收，导入pMD18-T simple (购于大连宝生物工程有限公司)载体，构建亚克隆质粒，转入大肠杆菌T0P10感受态细胞(购于北京全式金生物技术有限公司)中，筛选阳性亚克隆质粒，提取阳性亚克隆质粒，用Nde I和Xho I (均购于NEB公司)双酶切亚克隆质粒，用胶回收纯化试剂盒(大连宝生物工程有限公司)对酶切产生的目的片段纯化回收，得到编码重组蛋白的G型溶菌酶重组基因，测序该G型溶菌酶重组基因，该G型溶菌酶重组基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID N0.1所示，将该G型溶菌酶重组基因导入经同样双酶切的表达载体pET_21a(购于Novagen公司)，得到重组质粒；重组质粒构建具体依《分子克隆第三版》操作方法:扩增反应条件为首先94°C预变性5分钟，然后进入下列循环:94°C变性30秒，60°C退火30秒，72°C延伸30秒，共进行30个循环，最后72°C延伸10分钟；6)紫贻贝 G型溶菌酶重组基因表达:将上述重组质粒转入表达宿主菌BL21 (DE3) -plysS (北京全式金生物技术有限公司)，筛选阳性重组质粒，测序确认，挑取单克隆重组质粒,将单克隆重组质粒接种于200ml LB(上海生工科技有限公司)培养基中，220rpm，37°C培养至0D_ = 0.5-0.7，加入异丙基-β -D-硫代半乳糖苷(IPTG)，使终浓度达到0.6mmol/ml，继续培养5小时，4°C，5000rpm,离心10分钟，收集菌液；7)重组蛋白纯化:对上述菌液超声破碎、离心获得包涵体，并对包涵体进行洗涤、溶解、镍柱亲和层析纯化。最后对重组蛋白进行透析复性得到具有抗菌活性的重组蛋白，即本发明的紫贻贝G型溶菌酶，经测序，该重组蛋白的氨基酸序列如序列表SEQ ID N0.2所示，具体纯化方法依蛋白纯化试剂盒的说明书操作。实施例紫贻贝G型溶菌酶的制备:一、用Trizol试剂提取感染鳗弧菌的紫贻贝血淋巴中的总RNA，得到总RNA，提取方法依Invitrogen公司的Trizol试剂说明书进行:取紫贻贝仔血淋巴50ml,2000g离心10分钟,弃上清，向沉淀细胞中加入20ml的TRIZOL (Invitrogen),用高速分散器将细胞分散，室温下剧烈震荡10秒；加入4ml氯仿，剧烈震荡30秒；4°C，10，OOOg高速离心10分钟；吸取上清液于一个新离心管中，加入冰浴过的等体积异丙醇(约15ml)，置于-20°C静置I小时以上；4°C，10，OOOg高速离心10分钟；小心弃去上清液；用5ml 70%的乙醇清洗沉淀；4°C，10，OOOg高速离心10分钟，小心弃去上清液；真空干燥5分钟，用约600 μ I无RNA酶水溶解RNA，待完全溶解后储存于-80°C备用。二、用Oligotex mRNA纯化试剂盒将上述总RNA纯化得到mRNA，具体纯化方法依QIAGENE公司的Oligotex mRNA纯化试剂盒说明书进行:包括在37°C水浴加热Oligotex悬液，震荡混匀，室温放置；70°C水浴加热OEB缓冲液；向500 μ I总RNA溶液(RNA含量约为2mg)中加入:0ΒΒ缓冲液650μ 1，Oligotex悬液135 μ 1，无RNA酶水650 μ 1，70°C加热体系3分钟；取出反应体系后,室温下放置10分钟，15，OOOg离心2分钟，小心吸走上清液,用600 μ I 0W2重悬Oligotex-mRNA沉淀，剧烈震荡。然后将悬浊液移入放在1.5ml离心管中的离心柱内，15，OOOg离心I分钟，将离心柱转移到一个新的1.5ml离心管中，加入600 μ IOff2,15，OOOg离心I分钟，将进入离心管的液体丢弃，将离心柱转移到另一新的1.5ml离心管中；向离心柱中加入50 μ I已经加热到70°C的OEB缓冲液，轻轻混匀，15，OOOg离心I分钟；向离心柱再加入50 μ I OEB缓冲液，混匀后15，OOOg离心I分钟；回收离心管中的mRNA溶液约100 μ I。三、用cDNA Synthesis Kit试剂盒将上述mRNA逆转录并酶切为酶切片段，具体操作依试剂盒说明书进行:包括双链cDNA末端补平、EcoR I接头连接、EcoR I末端磷酸化、Xho I内切酶酶切等,用QIAEX II Agarose Gel Extraction Kit纯化试剂盒对大于IOObp的酶切片段进行回收，回收的酶切片段与Un1-ZAP XR载体连接，得到cDNA质粒，用ZAP-cDNA Gigapack III Gold Cloning Kit试剂盒对cDNA质粒进行噬菌体包装、滴度测定和噬菌体文库扩增，具体方法参照说明书进行，扩增后的文库加入终浓度为7%的二甲基亚砜溶液，得到cDNA模板溶液，存于_80°C备用。逆转录方法包括一链cDNA合成:在无RNA酶的200 μ I离心管中依次加入试剂混匀，然后加入30μ1 poly (A)引物和RNA (5 μ g),混匀，室温下放置10分钟后，向体系中加入1.5 μ I的一链合成酶StrataScript RT (50U/ μ I)，终体积达到50 μ 1，轻轻混匀反应体系，离心数秒，42°C温育I小时。二链合成:在冰上依次向含有一链cDNA的离心管中加入需用反应物反应，再向反应体系中加入2μ I核糖核酸酶H(1.5U/μ I)，11 μ I DNA聚合酶I (9.0U/μ I),轻轻混匀反应体系,离心数秒，16°C放置2.5小时后立即将反应体系置于冰上。补平cDNA末端:向二链合成体系中加入需用反应物，快速震荡反应体系离心后，于72°C反应30分钟；加入200μ I酚-氯仿[I: I (ν/ν)]，震荡混匀体系，室温下高速离心2分钟，转移上清至新的离心管中；加入等体积的氯仿，震荡混匀，室温下高速离心2分钟，然后转移上清至新管中；加入下列试剂使cDNA沉淀，并震荡体系:3M乙酸钠20μ 1，100% (ν/ν)酒精400 μ 1，_20°C沉淀过夜；4°C高速离心60分钟，小心弃去上清，保留沉淀；加入500 μ I的70%乙醇轻轻洗涤沉淀，室温高速离心2分钟；轻轻吸去乙醇，在真空离心机中干燥沉淀；用9 μ I含有EcoR I接头的溶液溶解沉淀并于4°C放置至少30分钟。EcoR I接头的连接:向体系中加入下列成分μ I 10Χ连接酶缓冲液，I μ I IOmM rATP，I μ I T4 DNA连接酶(4υ/μ I)，离心后8°C放置过夜；70°C 30分钟灭活连接酶。磷酸化EcoR I末端:离心反应物2秒，室温放置5分钟冷却，加入下列反应物用于磷酸化接头:I μ I 10Χ连接酶缓冲液，2 μ I IOmM rATP, 5 μ I灭菌水，2 μ I Τ4多聚核苷酸激酶(5U/ μ I)，37°C温育30分钟，700C 30分钟灭活激酶， 离心2秒后室温放置5分钟冷却。Xho I内切酶酶切:向体系中加入下列成分:28 μ 1 Xho I缓冲液，3 μ I Xho Ι(40υ/μ 1)，37°C温育1.5小时，加入125μ 1的100% (ν/ν)乙醇，-20°C放置过夜，4°C离心60分钟，弃去上清，完全干燥沉淀，用50 μ 1灭菌双蒸水溶解沉淀。cDNA片段回收方法:从浓度为1.0%的琼脂糖凝胶上将DNA带切下，将大约250mg的胶块放入1.5ml离心管中，加入相当于3倍胶块体积的QXl缓冲液，将QIAEX II剧烈震荡30秒，充分混匀，向含有胶块的QXl缓冲液中加入60 μ I QIAEX II，50°C加热10分钟，溶解胶块；每2分钟震荡一次，保持溶液始终为黄色；13，OOOrpm离心30秒，吸去上清液；用500 μ 1 QXl缓冲液清洗沉淀，重悬沉淀，13，OOOrpm离心30秒并吸去上清液；用500 μ I PE缓冲液清洗沉淀2次，重悬沉淀，13，OOOrpm离心30秒，弃上清液，真空干燥15分钟至沉淀变白，加入20 μ I IOmM Tris-HCl溶液(ρΗ8.5)室温下溶解5分钟。cDNA与Un1-ZAP XR载体(Invetrogen)连接:在另一干净的200 μ I离心管中依次加入下列试剂:2.5μ1重悬cDNA(> 100ng)，0.5yl 10 X连接酶缓冲液，0.5 μ I IOmMrATP (ρΗ7.5)，1.0 μ I Un1-ZAP XR 载体(I μ g)，0.5 μ I Τ4 DNA 连接酶(4U/ μ I)。12V放置过夜。噬菌体文库的包装:从_80°C冰箱中取出包装蛋白，迅速用手握住融化，立即加入4 μ I重组cDNA，用微量移液器吸头混匀体系(不要产生气泡)，离心5秒，室温(22°C )温育2小时,加入500 μ I的SM缓冲液和20 μ I氯仿,轻轻混匀反应体系。快速离心数秒，沉淀蛋白碎片，转移上清至新管中。包装反应的滴度测定:在含有氨苄青霉素的LB固体培养基(I升培养基含有氯化钠10g，胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，琼脂粉15g，pH7.5)上将大肠杆菌菌株XLl-Blue MRF’划线培养，37°C过夜培养；用LB液体培养基(I升培养基含有氯化钠10g，胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，pH7.5)培养单克隆菌落，30°C，200rpm摇床培养过夜；4°C，IOOOg下离心10分钟沉淀细菌。用25ml IOmM硫酸镁溶液重悬细菌；用IOmM MgSO4重悬XLl-Blue MRF’细胞，使浓度达到OD6tltl = 0.5 ;将包装产物按下列比例与宿主菌混合:(I) I μ I包装产物和200 μ IXLl-Blue MRF’ (OD600 = 0.5) ； (2) 0.1 μ I 包装产物和 200 μ I XLl-Blue MRF’ (OD600 = 0.5)；将混合体系置于37°C温育15分钟使噬菌体充分附着在宿主细胞表面；加入3ml融化状态下约48°C的NYZ上层培养基(I升培养基含有氯化钠5g，MgSO4.7H20 2g，NZ胺10g，酵母提取物5g，琼脂糖7g，pH7.5);迅速铺在干燥预热过的NYZ琼脂培养基(I升培养基含有氯化钠5g，七水硫酸镁2g，NZ胺10g，酵母提取物5g，琼脂粉15g，pH7.5)上，静置10分钟后，倒置于37°C过夜培养；8小时后可见噬菌斑；分别计数两个平板上的噬菌斑数目，计算其滴度(每毫升生长的噬菌斑数目，pfu/ml)。而后在30°C，200rpm条件下，用LB液体培养基过夜培养XLl-Blue MRF’细胞50ml ;1OOOg离心宿主细胞10分钟；用251111 IOmM硫酸镁溶液重悬细胞，测定600纳米可见光下菌液吸光度，然后用IOmM硫酸镁将菌液稀释至浓度为OD6tltl = 0.5 ;将含有大约5X 104pfu噬菌体颗粒的悬浊液与600 μ I浓度为OD6tltl = 0.5的XLl-Blue MRF’细胞混合，置于FaIcon 2059聚丙烯管中，37°C温育混合液15分钟，使噬菌体充分附着在宿主菌表面；将混合液加入约48°C的6.5ml液态NZY上层培养基中，混匀后倒入新鲜的150mm NZY琼脂糖培养基平板上，静置平板十分钟，倒转平板置于37°C约8小时(噬菌斑直径不超过2_);在每块平板上倒入大约1Oml SM缓冲液(1升缓冲液中含有5.8g氯化钠，2.0g七水硫酸镁，50.0mlIM Tris-HCl [pH 7.5]，5.0ml 2% [w/v]白明胶)，4°C放置过夜；将所有平板上的SM缓冲液回收入新的聚丙烯管中，每块平板再用2ml SM缓冲液清洗一次并回收上清液；向回收液中加入终浓度为5% (ν/ν)的氯仿，室温下放置15分钟，混匀，500g离心10分钟去除细胞碎片，将上清液转移至新聚丙烯管中，并重复步骤8、9至上清液澄清，加入终浓度为7% (v/v)DMSO，储存于80°C。测定扩增文库滴度(方法同前)。四、cDNA模板溶液中溶菌酶基因的确认:用Exassist Helper Phage和SOLR菌株(均购于Stratagene公司)从Un1-ZAP XR载体上体外切割pBluescript卩遼菌粒(进行体外切割；然后质粒cDNA的大规模提取和测序分析获得目的EST序列，对上述EST测序结果，用BLASTn和BLASTx程序分析，根据相似性分析结果寻找出溶菌酶基因片段五、对上述含溶菌酶基因的cDNA模板溶液进行PCR扩增得到PCR产物，PCR扩增的(正向引物序列:5 ’ -CGTCGAATACTGTGAAGCA-3 ’，反向引物的核苷酸序列为:5’ -GACCCTTCTACATACTACCAA-3’)，PCR产物用胶回收试剂盒进行回收和纯化得到PCR纯化产物，将所述PCR纯化产物与pMD-18T载体连接得到克隆质粒，克隆质粒转入大肠杆菌T0P10F感受态细胞中，挑选阳性克隆质粒提取，得到溶菌酶基因的克隆质粒；3’端PCR扩增的反应体系和反应条件为=IOXPCR缓冲液2.5 μ l、25mM氯化镁溶液Ι.Ομ 1、2.5mM的dNTP 2.0 μ 1、10 μ M的正向引物I μ 1、10 μ M的通用引物T7 I μ 1、浓度为5υ/μ I的Taq酶
0.2 μ 1，cDNA模板(文库)I μ 1，用PCR水定容到25 μ I ;反应在ABI Veriti PCR仪中进行，反应条件为首先94°C预变性5分钟，然后进入下列循环:94°C变性30秒，60°C退火30秒，72°C延伸60秒，共进行34个循环，最后72°C延伸10分钟；5’端PCR扩增反应体系和反应条件为:10XPCR 缓冲液 2.5 μ l、25mM MgCl2 溶液 1.0 μ 1、2.5mM 的 dNTP 溶液 2.0μ 1、10 μ M的反向引物溶液1.0 μ 1、10 μ M的通用引物Τ3溶液I μ 1、浓度为IU/μ I的Taq酶
0.2 μ 1，所述cDNA模板溶液I μ 1，用PCR水定容到25 μ 1，反应在ABI Veriti PCR仪中进行，反应条件为首先94°C预变性5分钟，然后进入下列循环:94°C变性30秒，60°C退火30秒，72 °C延伸60秒， 共进行34个循环，最后72°C延伸10分钟；六、对G型溶菌酶基因的克隆质粒再进行扩增反应，(扩增反应正向引物为含有Nde I酶切位点的核苷酸序列:5’-CATATGGCGAACTATAATTGTCATGG-3’，反向引物为含Xho I酶切位点和6个His纯化标签的核苷酸序列:5’ -CTCGAGCTAGTGGTGGTGGTGGTGGTGCCAATGATAATGGCTAA-3’);将扩增片段纯化回收，导入pMD18_T载体，构建亚克隆质粒，转入大肠杆菌T0P10F'感受态细胞中，筛选阳性亚克隆质粒，提取阳性亚克隆质粒，用Nde I和Xho I双酶切亚克隆质粒，用胶回收纯化试剂盒对酶切产生的目的片段纯化回收，得到编码重组蛋白的G型溶菌酶重组基因，测序该G型溶菌酶重组基因，该G型溶菌酶重组基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID N0.1所示，将该G型溶菌酶重组基因导入经同样双酶切的表达载体pET-21 (a)，得到重组质粒；重组质粒构建具体依《分子克隆第三版》操作方法。扩增反应条件为首先94°C预变性5分钟，然后进入下列循环:94°C变性30秒，60°C退火30秒，72°C延伸30秒，共进行30个循环，最后72°C延伸10分钟；七、将上述重组质粒转入表达宿主菌BL21(DE3)plysS，(购于北京全式金生物技术有限公司)中，筛选阳性重组质粒，测序确认，挑取单克隆重组质粒，将单克隆重组质粒接种于200ml LB液体培养基中，220rpm，37°C培养至OD6tltl = 0.5-0.7，加入IPTG，使终浓度达到0.6mM,继续培养5h，4°C，5000rpm,离心10分钟，收集菌液；
八、对上述菌液超声破碎、离心获得包涵体，并对包涵体进行洗涤、溶解、镍柱亲和层析纯化。最后对重组蛋白进行透析复性得到具有抗菌活性的重组蛋白，即本发明的紫贻贝G型溶菌酶，经测序，该重组蛋白的氨基酸序列如序列表SEQ ID N0.2所示；在收集的菌体沉淀中，加入适量的菌体裂解液(0.5M氯化钠，IOmM Tris-HCl,0.5% Triton X-1OOpH
8.5)重悬沉淀，超声波处理，条件为:300W，处理200次，每次5秒，间隔15秒；菌体裂解液在4°C下IOOOOrpm离心20分钟收集包涵体；包涵体沉淀分别用洗液I (0.5M氯化钠，IOmMTris-HCl, 0.5% Triton X_100，2M 尿素 pH 8.5)和洗液 II (0.5M 氯化钠，IOmM Tris-HCl,
0.5% Triton X-100，2%脱氧胆酸钠pH 8.5)洗涤一次后用8M尿素溶液(20mM磷酸缓冲液PBS，0.5M氯化钠，8M尿素，20mM咪唑pH 7.4)溶解；经镍柱亲和层析纯化后的重组蛋白采用逐渐降低尿素浓度的方法进行透析复性，透析缓冲液成分如下:IOOmM Tris-HCl，50mM氯化钠，ImM EDTA，2mM还原型谷胱甘肽，0.02mM氧化型谷胱甘肽，10%甘油，I %甘氨酸，尿素(6M，4M，3M，2M，0M)，pH 9.2。.透析缓冲液依次降低尿素的浓度，每次于4°C透析12小时，最后在TBS缓冲液(50mM Tris_HCl，IOOmM氯化钠，pH 9.2)中透析两次。重组蛋白浓度测定采用碧云天生物公司的BCA法测定蛋白浓度试剂盒(P0012)。具体操作依试剂盒说明书进行:根据样品数量，按50体 积BCA试剂A加I体积BCA试剂B (50: I)配制适量BCA工作液，充分混匀；完全溶解蛋白标准品，取10 μ I用PBS稀释至100 μ 1，使终浓度为0.5mg/ml ；将标准品按0，1，2，4，8，12，16，20 μ I加到96孔板的标准品孔中，用PBS溶液补足到20 μ I ；加适当体积样品到96孔板的样品孔中并用PBS补足到到20 μ I ;各孔加入200 μ I BCA工作液，37 °C放置30分钟；测定A562，根据标准曲线计算出蛋白浓度为0.4lmg/mL。紫贻贝G型溶菌酶基因的cDNA序列全长701bp，含有621bp的开放阅读框，编码206个氨基酸，5’非编码区长12bp，3’非编码区长68bp，有多聚腺苷酸尾巴。利用pET21(a)表达载体在大肠杆菌BL21(DE3)plysS中重组表达了该蛋白，表达产物对多种革兰氏阳性和阴性病原菌均有一定的抑制作用，其中对恶臭假单胞菌的作用最为显著，最小抑菌浓度为2.39-4.79ymol/L0序列表SEQ ID N0.1tactgtgaag caatgaaaac gtttttcctt ttatttgctg taatttttgc aactgatgcagcgaactata attgtcatgg tgatgtgaca cagcttcatc caacaggaat gggcagtgcatatggaggta tggcaggttc gcaccaggct attgatcagg atattgctga gatcaataaacgaaagtctt gttatgtaca agcaggagct gcgaactgta tacatcctgc agttattgctggtcttgcta gtcgggaatc tcgcgccgga aagcttttat atagtacaag cggctggggtgatcatcata acgcatacgg tatcatgcag tgtgacatca atgctaaccc actacatagtattcataaaa catgtacatc ttaccactgg gacagctgtg cccacataaa cgctatgacagcgcatgtcc tagttccaaa tatacaaggt gttaaacgca agcatcattc gtggtcggatgcgcaagcgt tacaaggtgg agtagctgca tacaactttg gtttaggcaa tgtacagagttggggcggat tggatgtggg atcaacacat aatgactaca gcaacgacgt aattgcacgtgctcaatggc taattagcca ttatcattgg tagtatgtag aagggtcatc ctttaaacacacaaataaat aacttgtacc gagagaaaaa aaaaaaaaaa a(a)序列特征 长度:701bp(13-633bp) 类型:碱基序列
链型:单链 拓扑结构:线性(b)分子类型:双链DNA(c)假设:否(d)反义:否(e)最初来源:紫贻贝(f)特异性名称:cDNA序列表SEQ ID N0.2Met Lys Thr Phe Phe Leu Leu Phe Ala Val He Phe Ala Thr AspAla Ala Asn Tyr Asn Cys His Gly Asp Val Thr Gln Leu His ProThr Gly Met Gly Ser Ala Tyr Gly Gly Met Ala Gly Ser His GlnAla He Asp Gln Asp He Ala Glu He Asn Lys Arg Lys Ser CysTyr Val Gln Ala Gly Ala Ala Asn Cys He His Pro Ala Val IleAla Gly Leu Ala Ser Arg Glu Ser Arg Ala Gly Lys Leu Leu TyrSer Thr Ser Gly Trp Gly Asp His His Asn Ala Tyr Gly He MetGln Cys Asp He Asn Ala Asn Pro Leu His Ser He His Lys ThrCys Thr Ser Tyr His Trp Asp Ser Cys Ala His He Asn Ala MetThr Ala His Val Leu Val Pro Asn He Gln Gly Val Lys Arg LysHis His Ser Trp Ser Asp Ala Gln Ala Leu Gln Gly Gly Val AlaAla Tyr Asn Phe Gly Leu Gly Asn Val Gln Ser Trp Gly Gly LeuAsp Val Gly Ser Thr His Asn Asp Tyr Ser Asn Asp Val He AlaArg Ala Gln Trp Leu He Ser His Tyr His Trp(a)序列特征 长度:206aa(l7_206aa) 类型:氨基酸序列籲链型:单链 拓扑结构:线性(b)分子类型:双链DNA(c)假设:否(d)反义:否(e)最初来源:紫贻贝(f)特异性名称:蛋白质该紫贻贝G型溶菌酶编码蛋白具有SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列，分子量为22.4kDa，等电点为6.96，其中编码序列的1_16位氨基酸为信号肽序列，成熟肽为190个氨基酸，该成熟蛋白分子量为20.6kDa，理论等电点为7.04，有I个净负电荷。
应用例:将上述所得紫贻贝G型溶菌酶加入试管中制成浓度为0.41mg/mL作用液共9管，分别接种产气肠杆菌、奇异变形杆菌、巴氏葡萄球菌、金黄色葡萄球菌、副溶血弧菌、溶藻弧菌、阴沟肠杆菌及恶臭假单胞菌各5 μ 1，使每管最终菌液浓度约为5X105CFU/ml，培养24小时后，利用酶标仪测定600nm的光吸收值，确定MIC值，得到如表I所示的结果，从表I中可以看出，紫贻贝G型溶菌酶对上述革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌都有效，说明本发明的紫贻贝G型溶菌酶具有广谱抗菌性，且效果较好。其中产气肠杆菌，奇异变形杆菌，阴沟肠杆菌，巴氏葡萄球菌及金黄色葡萄球菌37°C培养；副溶血弧菌，恶臭假单胞菌和溶藻弧菌28°C培养；具体步骤:调节各囷至OD6tl。为I后,稀释1000倍备用。在96孔板中每孔中加入100 μ I LB液体培养基，再在每一行第一个孔中加入100 μ I G型溶菌酶，混匀后从第一个孔中吸出100 μ I加到第二个空中，混匀后吸出100 μ I加到第三个孔中，依此类推,第10个孔中吸出的100 μ I不再加到第11孔中。每行1-11孔中都接种稀释好的相应菌种5 μ 1，第12孔为只含培养基的对照。培养24h以上，测定吸光值，并计算相应MIC。最终测得:紫贻贝G型溶菌酶对以上各种菌都有一定的抑制作用，其中对恶臭假单胞菌的作用最为显著，最小抑菌浓度均为
2.39-4.79 μ mol/L。表1:紫贻贝G型溶菌酶抗菌素疗效表
权利要求
1.一种紫贻贝G型溶菌酶基因，其特征在于:G型溶菌酶基因如序列表SEQ ID N0.1中的喊基序列所不。
2.—种权利要求1所述的紫贻贝G型溶菌酶基因编码蛋白，其特征在于:G型溶菌酶基因编码蛋白如序列表SEQ ID N0.2中的氨基酸序列所示。
3.—种权利要求1所述的紫贻贝G型溶菌酶基因重组蛋白的应用，其特征在于:所述G型溶菌酶基因重组表达产物可制备为抗菌药物、水产品保鲜剂或水产饲料添加剂。
4.按权利要求3所述的紫贻贝G型溶菌酶基因重组蛋白的应用，其特征在于:所述G型溶菌酶基因重组表达产物可作为制备革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌的抑菌药物。
5.按权利要求4所述的紫贻贝G型溶菌酶基因重组蛋白的应用，其特征在于:紫贻贝重组溶菌酶对革兰氏阳性菌为巴氏葡萄球菌或金黄色葡萄球菌；革兰氏阴性菌为溶藻弧菌、阴沟肠杆菌、恶臭假单胞菌、奇异变形杆菌、产气肠杆菌或副溶血弧菌。
6.按权利要求5所述的紫贻贝G型溶菌酶基因重组蛋白的应用，其特征在于:所述G型溶菌酶基因重组表达产物可作为制备恶臭假单胞菌的抑菌药物。
全文摘要
本发明涉及溶菌酶，具体的说是一种紫贻贝G型溶菌酶基因及其重组蛋白和应用。G型溶菌酶基因如序列表SEQ ID NO.1中的碱基序列所示。通过PCR技术，扩增编码G型溶菌酶成熟肽的基因片断并将其克隆到pET21(a)表达载体中，在大肠杆菌BL21(DE3)plysS中实现了原核体外重组表达。重组产物经镍柱亲和层析纯化和透析复性后，对多种革兰氏阳性和阴性病原菌都有一定的抑制作用，其中恶臭假单胞菌的作用最为显著，最小抑菌浓度为2.39-4.79μmol/L。本发明可为进一步研究经济贝类免疫防御机制提供基础，并为水产动物的病害防治、遗传选育和饲料添加剂奠定基础。
文档编号C12N15/56GK103160525SQ201110420479
公开日2013年6月19日 申请日期2011年12月15日 优先权日2011年12月15日
发明者赵建民, 吴惠丰, 王清, 张林宝 申请人:中国科学院烟台海岸带研究所