专利名称：含有增强子Hr3和启动子IE1的转基因干扰载体及其制备方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物基因领域，特别涉及家蚕的转基因技术。
背景技术：
家蚕是具有重要经济价值的鳞翅目昆虫，在很多发展中国家，养蚕业是农民经济收入的一个重要来源。但是，每当养蚕业遭遇病毒侵害时，蚕业生产必将受到不可挽回的巨大损失。家蚕核型多角体病毒(BmNPV)是对养蚕业危害最为严重的一种病原。已有研究结果表明，破坏病毒的某些必需基因，病毒将不能进行增殖。利用转基因技术抑制病毒关键基因的表达是培育家蚕抗病品种的有效策略。RNA干扰(RNAi )是指通过反义RNA和正链RNA形成双链RNA( dsRNA)分子，在mRNA 水平关闭相应序列基因的表达或使其沉默，即序列特异性的转录后基因沉默技术。RNA干扰是最近十年发展起来的操控基因表达的新的强有力的实验方法。因为RNA干扰技术利用了 dsRNA能够特异的介导靶标基因表达沉默这一在生物界本身存在的基因表达调节机制，故与其他调控基因表达的手段相比，具有高效、快速且特异性好的特点。此外，由于RNA干扰是生物体固有的古老而天然的抗病毒机制，所以RNA干扰技术用于抗病毒治疗是最直接的运用。利用转基因和RNA干扰相结合的转基因干扰技术，构建转基因干扰载体，在转基因家蚕体内持续表达能够抑制BmNPV病毒增殖的dsRNA，是制备家蚕抗病毒品种的有效方法。目前已有研究者利用IEl或者A4等组成型启动子来构建转基因干扰载体，制备转基因家蚕系统。但是，不管是否有病毒侵染，这些转基因家蚕系统体内都会有等量的dsRNA存在。因此，最优的转基因干扰载体应该是，制备的转基因家蚕在正常情况下有适量的dsRNA 表达，在病毒侵染以后，家蚕体内的dsRNA量随着病毒侵入而诱导上调表达。目前已经报道的少量关于家蚕转基因干扰抗BmNPV的研究中，都是利用组成性启动子构建转基因干扰载体，通过注射实验室用非滞育品种制备转基因家蚕系统。目前还没有利用组成诱导型启动子构建转基因干扰载体，制备家蚕实用品种转基因干扰系统的报道。
发明内容
本发明的目的之一在于提供增强子Hr3联合启动子IEl的应用，该应用为家蚕转基因干扰载体的构建提供了新思路。本发明的目的之二在于提供一种转基因干扰载体，其能提高滞育家蚕品种对BmNPV病毒的抗性。本发明的目的之三在于提供上述转基因干扰载体的制备方法，该方法操作简单，稳定性高。本发明家蚕转基因干扰载体的优化方法及其应用，依次通过以下步骤实现
(1)利用转座载体pBac[3XP3-EGFPafm]构建包含病毒IEl启动子、gp64基因正向片段、家蚕肌动蛋白基因Actin 3内含子、gp64基因反向片段和终止信号序列SV40片段的转基因干扰载体 pBac [IElP-gp64S-A3intron-gp64A-SV40-3XP3-EGFPafm] (pb-IGG)，包含家蚕A4启动子、gp64基因正向片段、家蚕肌动蛋白Actin 3内含子、gp64基因反向片段和终止信号序列SV40片段的转基因干扰载体pBac[A4P-gp64S-A3intron-gp64A-SV40-3XP3 -EGFPafm] (pb-AGG)和包含病毒Hr3增强子、IEl启动子、gp64基因正向片段、家蚕肌动蛋白Actin 3内含子、gp64基因反向片段和终止信号序列SV40片段的转基因干扰载体pBac [Hr3-IElP-gp64S-A3intron-gp64A-SV40-3 X P3-EGFPafm] (pb-HIGG)。(2)将家蚕932品种通过15°C低温催青解除滞育，将产下的非滞育蚕卵收集好，在蚕卵产后池-池用显微注射仪内将3-如1、总浓度为400ng/ul的混合质粒(增量表达载体和辅助质粒按1:1混合)注射进蚕卵，然后用无毒胶水将注射孔封住。(3)将完成注射的蚕卵在35%的甲醛蒸汽中消毒^iin后，置于25°C、相对湿度为 80%的环境中进行催青直到孵化，将孵化的蚁蚕置于标准条件中饲养，将当代(GO)的蚕蛾进行自交或者回交，将滞育性的Gl代蚕卵即时浸酸解除滞育，胚胎发育第六天在荧光显微镜下面筛选转基因阳性个体，将获得的转基因个体单蛾区正常饲养，继代扩大群体数量。(4)将转基因系统IGG、HIGG、AGG和正常932(非转基因932)经口添食感染BmNPV 病毒，设置不添食的转基因和正常932对照，连续10天统计死亡率。不同剂量病毒添食后的死亡率统计结果显示转基因系统HIGG对BmNPV病毒的抗性效果最好。(5)在攻毒后48h，IGG、HIGG、AGG和正常932各随机抽取10头蚕提取总DNA，通过荧光定量PCR检测BmNPV病毒的拷贝数，证明HIGG中的病毒含量确实远低于正常932品种。(6)调查IGG、HIGG、AGG和正常932的经济性状，各系统雌雄各随机抽取15颗茧，分别称取每颗茧的全茧量和茧壳量，计算茧层率，确定转基因系统的经济性状没有受到影响。为实现上述三种目的，本发明的技术方案为
1增强子Hr3和启动子IEl在转基因干扰载体中的联合应用，所述增强子Hr3如SEQ ID NO: 1的核苷酸序列所示，所述启动子IEl如SEQ ID NO:2的核苷酸序列所示。2所述转基因干扰载体为以BmNPV病毒为靶标的干扰载体。3含有增强子Hr3和启动子IEl的转基因干扰载体，所述转基因干扰载体的基础载体为转座载体pBaC[3XP3-EGFPafm]，所述基础载体上依次含有增强子Hr3、启动子IE1、 目的基因正向片段、单链区、目的基因反向片段和终止信号序列SV40。4根据3所述的转基因干扰载体，所述目的基因为gp64基因，gp64基因的正向片段如SEQ ID NO: 3的核苷酸序列所示，gp64基因的反向片段如SEQ ID NO:4的核苷酸序列所示。5根据4所述的转基因干扰载体，所述转基因干扰载体为pBac [Hr3-IElP-gp64S-A 3intron-gp64A-SV40-3 X P3_EGFPafm]，转基因干扰载体以转座载体 pBac [3 X P3-EGFPafm] 为基础载体，并依次含有病毒Hr3增强子、IEl启动子、gp64基因正向片段、家蚕肌动蛋白基因Actin 3内含子(A3 intron)、gp64基因反向片段和终止信号序列SV40片段。6所述的转基因干扰载体的制备方法，具体包括以下步骤 A.目的基因的正、反向片段的构建设计目的基因正向片段，其上游引物为 5' ccggaattcccgattaaacgtaaagtcgagcacc 3，，其下游弓I物为5，cgcggatccgcggggcaataaacgaccaacc 3，；设计目的基因反向片段, 其上游弓I物为 5，cccaagcttggggggcaataaacgaccaacc 3，，其下游弓|物为 5，tgctc tagagcaattaaacgtaaagtcgagcacc 3'；利用BmNPV病毒基因组为模板进行PCR扩增，分别得如SEQ ID N0:3所示的目的基因正向片段和如SEQ ID N0:4所示的目的基因反向片段；
B.pMD-19-gp64S-A3intron-gp64A 的构建
将所述目的基因正向片段用I称BamH I进行双酶切，同时用I和 BamH /双酶切包含家蚕肌动蛋白Actin 3内含子的pMD_19载体，连接酶切片段，得 pMD-19-gp64S-A3intron载体；将所述目的基因反向互补片段和pMD-19-gp64S_A3intron 载体分别用HindIim Xba I进行双酶切并连接，得到pMD-19-gp64S-A3intron-gp64A载体；
C.1180-IElP-gp64S-A3intron-gp64A-SV40 载体的构建
将含有IEl启动子和SV40终止信号的L4440载体和pMD-19-gp64S_A3intron-gp64A 分别用EcoR /和损a /进行双酶切并连接，得L4440-IElP-gp64S-A3intron-gp64A-S V40 载体，其核苷酸序列如 SEQ ID NO:5 ；将 L4440-IElP-gp64S-A3intron-gp64A_SV40 和 pSLfallSOfa载体分别用5 / I热Bgl #进行双酶切，回收目的条带后连接转化，筛选阳性克隆，得到 1180-IElP-gp64S-A3intron-gp64A-SV40 载体；
D.1180-Hr3-IElP-gp64S-A3intron-gp64A-SV40 载体的构建
将 1180-IElP-gp64S-A3intron-gp64A-SV40 载体和所述增强子 Hr3 分别用 Afco I 进行单酶切，并连接，得1180-Hr3-IElP-gp64S-A3intron-gp64A-SV40载体，其核苷酸序列如 SEQ ID NO:6 所示；
E.pBac[Hr3-IElP-gp64S-A3intron-gp64A-SV40-3XP3-EGF Pafm]载体的构建
用限制性内切酶Asc /分别酶切步骤D所得1180-Hr3-IElP-gp64S-A3intron-gp64A -SV40 载体，得 Hr3-IElP-gp64S-A3intron-gp64A-SV40 片段；同时用内切酶 Asc I 单酶切 piggyBac [3 X p3 EGFP afm]，得 piggyBac [3 Xp3 EGFP afm]线性片段；将 Hr3_IElP-gp64S -A3intron-gp64A-SV40 片段和 piggyBac[3Xp3 EGFP afm]连接，得重组载体 pBac [Hr3_IE lP-gp64S-A3intron-gp64A-SV40-3 X P3-EGF Pafm]。步骤A中，PCR反应条件均为94°C预变性4分钟，然后94°C变性40秒、52°C退火 40秒、72°C延伸40秒，共30个循环，最后72°C延伸10分钟；
7根据6所述的转基因干扰载体的制备方法，步骤中E中，对获得piggyBaC[3Xp3 EGFP afm]线性片段 5，端去磷酸化后，将 Hr3-IElP-gp64S-A3intron-gp64A_SV40 片段和 piggyBac [3 Xp3 EGFP afm]连接，得重组载体pBac [Hr3-IElP-gp64S-A3intron-gp64A_SV4 0-3XP3-EGF Pafm]。本发明的有益效果在于本发明家蚕转基因干扰载体的优化方法及其应用，通过对转基因干扰载体进行优化，提高滞育家蚕品种对BmNPV病毒的抗性。与其他方法相比，本发明具有以下优势①使家蚕在发育的各个时期均能持续表达靶标基因的dsRNA，BmNPV病毒一旦侵染进入家蚕细胞就会受到抑制；②巧妙的利用IEl启动子和增强子Hr3的组合， 使转基因家蚕在正常情况下表达适量的dsRNA ；当BmNPV侵染家蚕后，利用病毒增殖产生的 IEl蛋白激活Hr3增强子来大量表达dsRNA，使靶标基因的dsRNA表达量随着病毒量的增加而增加，所以能最大程度减少表达dsRNA对家蚕正常生理活动和经济性状的影响，同时还能显著提高家蚕的抗性；③和非滞育品种相比，滞育性转基因系统不需要连续饲养，保存和管理方便，而且品种资源丢失的风险低；④和传统育种手段相比，本发明通过转基因制备抗性品种不但效果好而且周期短。
图 1 为构建转基因干扰载体 pBac [IElP-gp64S-A3intron-gp64A-SV40_3 X P3-EGF P afm], pBac[A4P-gp64S-A3intron-gp64A-SV40-3XP3-EGFP afm]和 pBac[Hr3_IElP-gp6 4S-A3intron-gp64A-SV40-3 X P3-EGFP afm]的结构示意图。图2为在3龄起蚕以3 X IO5个病毒多角体/头的剂量经口单头添食感染BmNPV病毒后，转基因系统IGG、AGG、HIGG和正常932的死亡率统计结果。图3为在3龄起蚕以5 X IO5 /头的剂量经口单头添食感染BmNPV病毒后，转基因系统IGG、AGG、HIGG和正常932的死亡率统计结果。图4为攻毒后48h，转基因系统IGG、AGG、HIGG和正常932各系统体内BmNPV病毒拷贝数检测结果。932的病毒含量被设置为100%，各转基因系统的病毒含量被换算成相应的百分比。图5为转基因系统IGG、AGG、HIGG和正常932的茧重统计结果。图6为转基因系统IGG、AGG、HIGG和正常932茧层率分析图。
具体实施例方式就分子生物学领域中，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中为注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆实验室指南(New YorkiCold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。
实施例1 转基因干扰载体的制备
本发明以BmNPV基因作为靶标基因为例，构建转基因干扰载体。同理，本发明不限于以BmNPV基因作为靶标基因，也可采用其它已报道或未报道的基因。以已经报道的BmNPV gp64基因序列，设计正向片段(gp64S)扩增引物 gp64senseF 5' ccggaattcccgattaaacgtaaagtcgagcacc 3' , gp64senseR: 5' cgcggatccgcggggcaataaacgaccaacc 3',以及反向片段(gp64A)扩增弓丨物 gp64antiF: 5' cccaagcttggggggcaataaacgaccaacc 3' ， gp64antiR: 5' tgctctagagcaattaaacgtaa agtcgagcacc 3'。利用BmNPV病毒基因组为模板进行PCR扩增，，PCR反应条件为94°C预变性4分钟，然后94°C变性40秒、52°C退火40秒、72°C延伸40秒，共30个循环，最后72°C 延伸10分钟；PCR产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定并回收，然后与pMD19-T simple载体连接， 连接反应在T4 DNA连接酶作用下，16°C过夜连接，然后转化Dffia感受态细胞，获得阳性克隆后送往上海生工生物技术有限公司测序，测序结果表明本实施例成功克隆了基因的正反向片段序列。gp64基因的正向片段如SEQ ID NO: 3的核苷酸序列所示，gp64基因的反向片段如SEQ ID N0:4的核苷酸序列所示。将如SEQ ID N0:3所示的正向片段gp64S用/和/进行双酶切，经琼脂糖电泳鉴定并回收，得gp64S酶切片段；同时用/和及 /7/双酶切已经包含家蚕肌动蛋白基因Actin 3内含子(A3 intron)的pMD_19载体，经琼脂糖电泳鉴定并回收，得 PMD-19载体酶切片段，将gp64S酶切片段和pMD-19载体酶切片段进行连接转化，筛选阳性克隆，得到pMD-19-gp64S-A3intron载体。另外，将如SEQ ID NO:4所示的反向互补片段 gp64A和pMD-19-gp64S-A3intron载体分别用HindIim Xba I进行双酶切，回收目的条带后连接转化，筛选阳性克隆，得到pMD-19-gp64S-A3intr0n-gp64A载体。将已经包含IEl启动子和SV40终止信号的L4440载体(该载体为本实验之前的其他实验所构建)和pMD-19-gp64S-A3intron-gp64A载体分别用EcoR I和损a I进行双酶切，回收目的条带后连接转化，筛选阳性克隆，得到L4440-IElP-gp64S-A3intron-gp64A-S V40 载体，如 SEQ ID NO: 5 ；将 L4440-IElP-gp64S-A3intron-gp64A_SV40 和 pSLfall80fa 载体分别用Sal I和Bgl #进行双酶切，回收目的条带后连接转化，筛选阳性克隆，得到1180 -IElP-gp64S-A3intron-gp64A-SV40 载体。将L4440-IElP-gp64S-A3intron-gp64A-SV40 和家蚕肌动蛋白基因 Actin 4 (A4) 启动子分别用i^oT /和5 / /进行双酶切，回收目的条带后连接转化，筛选阳性克隆，得到 L4440-A4P-gp64S-A3intron-gp64A-SV40 载体；将 L4440-A4P-gp64S-A3intron-gp64A-SV40和pSLfallSOfa载体分别用Sal I和勒·/ #进行双酶切，回收目的条带后连接转化， 筛选阳性克隆，得到1180-A4P-gp64S-A3intron-gp64A-SV40载体，其核苷酸序列如SEQ ID N0:7所示。(5)将 1180-IElP-gp64S-A3intron-gp64A-SV40 载体和本实验室的 Hr3 序列分别用Afc0 /进行单酶切，回收目的条带后连接转化，筛选阳性克隆，得到1180-Hr3-IElP-gp64 S-A3intron-gp64A-SV40 载体，其核苷酸如 SEQ ID N0:6 所示。(6)用限制性内切 MAsc I 分别酶切 1180-IElP-gp64S-A3intron-gp64A-S V40、1180-A4P-gp64S-A3intron-gp64A-SV40 禾P 1180-Hr3-IElP-gp64S_A3intron-gp 64A-SV40载体，琼脂糖凝胶电泳鉴定并回收，得IElP-gp64S-A3intron-gp64A-SV40、 A4P-gp64S-A3intron-gp64A-SV40 禾口 Hr3-IElP-gp64S-A3intron-gp64A-SV40 片段； 同时用内切酶 Asc / 单酶切 piggyBac[3Xp3 EGFP afm],得 piggyBac[3Xp3 EGFP afm]线性片段，然后对获得piggyBaC[3Xp3 EGFP afm]线性片段5’端去磷酸化，将 IElP-gp64S-A3intron-gp64A-SV40 片段和 piggyBac [3Xp3 EGFP afm]进行连接，转化后筛选阳性克隆，得到重组载体 pBac[IElP-gp64S-A3intron-gp64A-SV40-3XP3-EGFP afm] (pb-IGG)；将 A4P-gp64S-A3intron-gp64A-SV40 片段和 piggyBac[3Xp3 EGFP afm]连接转化，筛选阳性克隆，得到重组载体 pBac[A4P-gp64S-A3intron-gp64A-SV40-3XP3-EGF Pafm] (pb-AGG)；将 Hr3_IElP-gp64S-A3intron-gp64A-SV40 片段和 piggyBac [3 X p3 EGFP afm]连接转化，筛选阳性克隆，得到重组载体pBac [Hr3-IElP-gp64S-A3intron-gp64A_SV4 0-3XP3-EGF Pafm] (pb-HIGG)上述转基因载体如图1所示。实施例2 转基因显微注射和阳性个体的筛选
将家蚕932品种蚕卵浸酸(所用盐酸比重为1. 073，温度为46°C，时间为5分钟)解除滞育以后，放于15°C和80%湿度的黑暗环境中催青30天左右直至孵化，将蚁蚕收好置于标准环境中饲养(温度25°C，湿度80%)，化蛾以后将雌雄蚕蛾交配4小时，拆对后产下的蚕卵为非滞育蚕卵，用于下一步的显微注射；
将产下的蚕卵在干净的载玻片上排列整齐，在蚕卵产后2小时用Eppendorf显微注射仪将实施例1所得Pb-IGG重组载体和辅助质粒A3H，一起注射进97粒932蚕卵中，用无毒胶水封口以后置于25°C、相对湿度80%的环境中催青10天左右孵化，将孵化的25头GO代蚁蚕用桑叶收集饲养至化蛾，GO代蚕蛾通过自交或回交共获得8蛾圈Gl代蚕卵，用Olympus 电动宏观荧光显微镜观察Gl胚胎筛选并获得1个阳性蛾圈，即1个IEl启动子介导的gp64 dsRNA表达的转基因家蚕系统，简称IGG转基因系统，转化效率为12. 50% ；将实施例1所得 Pb-AGG重组载体和辅助质粒A3H，一起注射进103粒932蚕卵中，共孵化沈头GO代蚁蚕， 获得9蛾圈Gl代蚕卵，筛选得到1个阳性蛾圈，S卩1个A4启动子介导的gp64 dsRNA表达的转基因家蚕系统，简称AGG转基因系统，转化效率为11. 11% ；将实施例1所得pb-HIGG重组载体和辅助质粒A3H，一起注射进IM粒932蚕卵中，共孵化38头GO代蚁蚕，获得15蛾圈Gl代蚕卵，筛选得到2个阳性蛾圈，即2个Hr3+IE1启动子介导的gp64 dsRNA表达的转基因家蚕系统，简称HIGG转基因系统，转化效率为13. 33% ； 实施例3 转基因系统的抗性检测
将实施例2获得的一个IGG阳性蛾圈、一个AGG阳性蛾圈和随机选择的一个HIGG阳性蛾圈各自单蛾圈饲养，继代扩大。取转基因系统IGG、HIGG、AGG和正常932品种，在3龄起蚕时期单头经口添食 BmNPV病毒，4个系统各设置3个重复区，每个重复区100头蚕，同时每个系统设置3个不攻毒对照区，连续10天统计死亡率。对IGG、HIGG AGG和正常932品种的死亡率进行统计。抗性检测结果显示，当以 3 X IO5 /头的剂量进行添食时，其死亡率结果如图2所示，转基因系统HIGG的死亡率最低， 具体为49. 06%, AGG的死亡率为50. 70%, IGG的死亡率为76. 62%, 932的死亡率为62. 91%。 当感染病毒的剂量提高到5 X IO5 /头时，其死亡率结果如图3所示，转基因系统HIGG的死亡率为67. 06%, AGG的死亡率为71. 83%, IGG的死亡率为96. 03%, 932的死亡率为77. 38%。根据抗性检测结果证实利用IE1+Hr3启动子的转基因干扰系统抗性效果优于利用A4和IEl启动子的转基因干扰系统。需要说明的是，根据之前的文献报道，BmNPV病毒极早期基因iel作为干涉靶标的抗病毒效果优于BmNPV病毒晚早期基因gp64。本发明主要是对转基因干涉载体的启动子进行优化，所以没有选择iel作为干涉靶标。可以预见的是利用IE1+Hr3启动子，以iel基因作为靶标的家蚕转基因干涉系统的抗性效果会更好。
实施例4 定量PCR检测攻毒后各系统中BmNPV病毒的含量
将实施例3的蚕在攻毒后48h，IGG、HIGG、AGG和正常932每个系统各取10头蚕提取总 DNA0每个DNA模板各取20 ng，以BmNPV病毒甜“基因的特异引物进行定量PCR检测，引物为 GP41 F: 5 'cgtagtagtagtaatcgccgcS' , GP41 R: 5 ^agtcgagtcgcgtcgctttS',(试剂盒为 SYBR Premix Ex Taq Kit，TaKaRa ；定量PCR检测仪器为 ABI StepOnePlus Real-Time PCR System,Applied Biosystems ；按照试剂盒和仪器使用说明书进行操作；以家蚕看家基因彻为内参，引物为 BmGAPDHF: 5 ‘ gctgcctccttgaccttttgc3，，BmGAPDH R: 5 ‘cattccgcgtccctgttgctaat 3'。定量PCR的结果如图4所示在食下病毒量一致的情况下，在攻毒后48h，正常932 体内的BmNPV病毒拷贝数被设置为100%;IGG系统的病毒含量为114%左右，略高于正常 932 ；而HIGG系统的病毒含量仅为正常932中的45%左右；AGG系统的病毒含量为左右， 高于IGG而低于正常932。BmNPV病毒拷贝数的检测结果说明，HIGG系统明显抑制了 BmNPV病毒在其体内的复制增殖，所以HIGG的抗性效果最好。实施例5 调查转基因系统的经济性状
实施例2获得的IGG、HIGG、AGG和正常932各系统雌雄各自随机抽取15颗茧，分别称取每颗茧的全茧量和茧壳量。统计的全茧量结果如图5所示IGG、HIGG、AGG和正常932的全茧量分别为 1. 30g、l. 58g、l. 30g、l. 36g (雌)，和 1. 20g、1. 36g、1. 15g、1. 06g (雄)。结果显示转基因系统和正常932之间没有明显区别。计算出的茧层率结果如图6所示IGG、HIGG、AGG和正常932的全茧量分别为 17. 51%,20. 05%,20. 70%、19. 69% (雌)，和 22. 65%,22. 33%,25. 55%,23. 68 % (雄)。结果也
显示转基因系统和正常932之间没有明显区别。以上调查结果显示转基因干扰系统在提高家蚕抗性的同时不会影响家蚕的经济性状。最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过参照本发明的优选实施例已经对本发明进行了描述，但本领域的普通技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离所附权利要求书所限定的本发明的精神和范围。
权利要求
1.增强子Hr3和启动子IEl在制备转基因干扰载体中的联合应用，所述增强子Hr3如 SEQ ID NO: 1的核苷酸序列所示，所述启动子IEl如SEQ ID NO:2的核苷酸序列所示。
2.根据权利要求1所述的联合应用，其特征在于所述转基因干扰载体为以BmNPV病毒为靶标的干扰载体。
3.含有增强子Hr3和启动子IEl的转基因干扰载体，其特征在于所述转基因干扰载体的基础载体为转座载体pBaC[3XP3-EGFPafm]，所述基础载体上依次含有增强子Hr3、启动子IE1、目的基因正向片段、单链区、目的基因反向片段和终止信号序列SV40。
4.根据权利要求3所述的转基因干扰载体，其特征在于所述目的基因为gp64基因， gp64基因的正向片段如SEQ ID N0:3的核苷酸序列所示，gp64基因的反向片段如SEQ ID NO:4的核苷酸序列所示。
5.根据权利要求4所述的转基因干扰载体，其特征在于所述转基因干扰载体为PBa c [Hr3-IElP-gp64S-A3intron-gp64A-SV40-3XPS-EGFI^afm]，转基因干扰载体以转座载体 pBac[3XP3-EGFPafm]为基础载体，并依次含有病毒Hr3增强子、IEl启动子、gp64基因正向片段、家蚕肌动蛋白基因Actin 3内含子、gp64基因反向片段和终止信号序列SV40片段。
6.权利要求3所述的转基因干扰载体的制备方法，其特征在于，具体包括以下步骤A.目的基因的正、反向片段的构建设计目的基因正向片段，其上游引物为 5' ccggaattcccgattaaacgtaaagtcgagcacc 3，，其下游弓I物为5，cgcggatccgcggggcaataaacgaccaacc 3，；设计目的基因反向片段, 其上游弓I物为 5，cccaagcttggggggcaataaacgaccaacc 3，，其下游弓|物为 5，tgctc tagagcaattaaacgtaaagtcgagcacc 3'；利用BmNPV病毒基因组为模板进行PCR扩增，分别得如SEQ ID N0:3所示的目的基因正向片段和如SEQ ID N0:4所示的目的基因反向片段；B.pMD-19-gp64S-A3intron-gp64A 的构建将所述目的基因正向片段用EcoR I和BamH I进行双酶切，同时用EcoR I和BamH I 双酶切包含A3 intron的pMD-19载体，连接酶切片段，得pMD-19-gp64S_A3intron载体；将所述目的基因反向片段和pMD-19-gp64S-A3intr0n载体分别用HindIim Xba I进行双酶切并连接，得到 pMD-19-gp64S-A3intron-gp64A 载体；C.1180-IElP-gp64S-A3intron-gp64A-SV40 载体的构建将含有IEl启动子和SV40终止信号的L4440载体和pMD-19-gp64S_A3intron-gp64A 分别用EcoR /和损a /进行双酶切并连接，得L4440-IElP-gp64S-A3intron-gp64A-S V40 载体，其核苷酸序列如 SEQ ID NO:5 ；将 L4440-IElP-gp64S-A3intron-gp64A_SV40 和 pSLfallSOfa载体分别用5 / I热Bgl #进行双酶切，回收目的条带后连接转化，筛选阳性克隆，得到 1180-IElP-gp64S-A3intron-gp64A-SV40 载体；D.1180-Hr3-IElP-gp64S-A3intron-gp64A-SV40 载体的构建将 1180-IElP-gp64S-A3intron-gp64A-SV40 载体和所述增强子 Hr3 分别用 Afco I 进行单酶切，并连接，得1180-Hr3-IElP-gp64S-A3intron-gp64A-SV40载体，其核苷酸序列如 SEQ ID NO:6 所示；E.pBac[Hr3-IElP-gp64S-A3intron-gp64A-SV40-3XP3-EGFPafm]载体的构建用限制性内切酶Asc /分别酶切步骤D所得1180-Hr3-IElP-gp64S-A3intron-gp64A -SV40 载体，得 Hr3-IElP-gp64S-A3intron-gp64A-SV40 片段；同时用内切酶 Asc I 单酶切piggyBac [3 X p3 EGFP afm]，得 piggyBac [3 Xp3 EGFP afm]线性片段；将 Hr3_IElP-gp64S -A3intron-gp64A-SV40 片段和 piggyBac[3Xp3 EGFP afm]连接，得重组载体 pBac [Hr3_IE lP-gp64S-A3intron-gp64A-SV40-3 X P3-EGFP afm]。
7.根据权利要求6所述的转基因干扰载体的制备方法，其特征在于，步骤E中，对获得 piggyBac [3 Xp3 EGFP afm]线性片段 5，端去磷酸化后，将 Hr3-IElP-gp64S_A3intron-gp6 4A-SV40 片段和 piggyBac [3 X p3 EGFP afm]连接，得重组载体 pBac [Hr3-IElP-gp64S_A3in tron-gp64A-SV40-3 X P3-EGF Pafm]
8.根据权利要求6所述的转基因干扰载体的制备方法，其特征在于，步骤A中，PCR反应条件均为94°C预变性4分钟，然后94°C变性40秒、52 °C退火40秒、72 °C延伸40秒，共 30个循环，最后72°C延伸10分钟。
全文摘要
本发明涉及家蚕的转基因技术，主要为增强子Hr3和启动子IE1在制备转基因干扰载体中的联合应用；转基因干扰载体的基础载体为转座载体pBac[3×P3-EGFPafm]，依次含有增强子Hr3、IE1基因启动子、目的基因正向片段、家蚕肌动蛋白Actin3(A3)内含子、目的基因反向片段和终止信号序列SV40；运用本技术，BmNPV病毒一旦侵染进入家蚕细胞就会受到抑制；本发明巧妙的利用IE1启动子和增强子Hr3的组合，使转基因家蚕在正常情况下表达适量的dsRNA；当BmNPV侵染家蚕后，利用病毒增殖产生的IE1蛋白激活Hr3增强子来大量表达dsRNA，使靶标基因dsRNA的表达量随着病毒量的增加而增加，最大程度减少表达dsRNA对家蚕正常生理活动的影响，并显著提高家蚕的抗性。
文档编号C12N15/66GK102492711SQ20111042328
公开日2012年6月13日 申请日期2011年12月16日 优先权日2011年12月16日
发明者夏庆友, 徐汉福, 王根洪, 程廷才, 蒋亮 申请人:西南大学