专利名称：盐芥ThPER42基因的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域中盐芥ThPER42基因的应用。
背景技术：
盐生植物盐芥为十字花科(Brassicaceae)、盐芥属CThellungiella)植物，生于土壤盐渍化的农田旁、水沟边和山区，分布于蒙古、西伯利亚和北美，在我国主要分布于山东、河北、江苏、新疆、内蒙古、吉林、天津和河南等地。在盐渍环境下生长的盐芥，不仅具有作为模式生物的基本特征，而且与拟南芥近缘。由于拟南芥作为模式植物，其许多方面研究已十分清楚，为进行盐芥基因水平上的研究提供了有利条件。已有的研究结果表明，盐芥在响应非生物胁迫中有许多基因所编码的蛋白质的功能未知，对未来的遗传学研究来说，它是一种具有丰富遗传资源的植物。因此，作为一种具有应用前景的植物耐盐模式系统，盐芥现已被国际、国内许多实验室采纳用于植物抗逆生理生化和分子机制的研究。植物受到环境胁迫(如高盐、低温等)，体内存在着活性氧(Reactive Oxygen Species,R0S)平衡体系就会受到破坏。活性氧的积累，对活性氧敏感的磷脂膜及脂肪酸首先受损，导致生物膜中脂质的过氧化，干扰镶嵌于生物膜系统上的多种酶的空间构型，导致膜的孔隙变大、通透性增加、代谢紊乱，使植物受到伤害，生长抑制，衰老和加速死亡。在长期适应进化中，植物体内形成了一套有效的ROS清除机制，分为酶促和非酶促两类。其中酶促保护系统主要有超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase, SOD)、过氧化氢酶(Catalase， CAT)、抗坏血酸过氧化物酶(Ascorbate Peroxidase，APX)、过氧化物酶(Peroxidase，P0D) 和谷胱甘肽过氧化物酶(Glutathione Peroxidase，GPX)等。高等植物中过氧化物酶Class III(POD)属于大家族，在水稻中有138个成员，在拟南芥中有73个成员，在应答内部和外部各种胁迫中，各成员各自表达发挥特殊的作用， 其中有部分编码POD的基因在正常条件和高盐胁迫下表达丰度较高，而且在NCBI中登录的盐芥的ESTs文库中也检索到相关编码POD基因。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种培育转基因植物的方法。本发明所提供的培育转基因植物的方法，是将序列表中序列2所示蛋白的编码基因转入出发植物中，得到耐逆性高于所述出发植物的转基因植物。上述方法中，所述蛋白的编码基因为如下1)-4)中任一所述的基因1)其核苷酸序列是序列表中序列1 ；2)其编码序列是序列表中序列1第59-10M位核苷酸所示；3)在严格条件下与1)或2、的基因杂交且编码所述蛋白的基因；4)与1)或2)或3)的基因具有90%以上的同源性且编码所述蛋白的基因。上述方法中，所述耐逆性为耐盐性。
上述方法中，所述蛋白的编码基因是通过重组表达载体导入出发植物中；所述重组表达载体为在载体PPZP212的多克隆位点间插入所述蛋白的编码基因得到的重组表达载体。上述方法中，所述目的植物为双子叶植物或单子叶植物；所述双子叶植物具体为烟草、盐芥或拟南芥。含有序列表中序列2所示蛋白的编码基因的表达盒、重组载体、转基因细胞系或重组菌也属于本发明的保护范围。所述重组载体为在载体PPZP212的多克隆位点间插入序列表中序列2所示蛋白的编码基因得到的重组表达载体。所述蛋白的编码基因为如下1)-4)中任一所述的基因1)其核苷酸序列是序列表中序列1 ；2)其编码序列是序列表中序列1第59-10M位所示；3)在严格条件下与1)或2、的基因杂交且编码所述蛋白的基因；4)与1)或2)或3)的基因具有90%以上的同源性且编码所述蛋白的基因。序列表中序列2所示蛋白的编码基因和/或上述的表达盒、重组载体、转基因细胞系或重组菌在培育耐逆植物中的应用也属于本发明的保护范围。上述应用中，所述耐逆植物为耐盐植物；所述植物为双子叶植物或单子叶植物； 所述双子叶植物具体为烟草、盐芥或拟南芥。上述应用中，所述蛋白的编码基因为如下1)-4)中任一所述的基因1)其核苷酸序列是序列表中序列1 ；2)其编码序列是序列表中序列1第59-10M位所示；3)在严格条件下与1)或2、的基因杂交且编码所述蛋白的基因；4)与1)或2)或3)的基因具有90%以上的同源性且编码所述蛋白的基因。序列表中序列2所示蛋白也属于本发明的保护范围。本发明采用农杆菌介导方法将ThPER42转入烟草中，获得的转基因烟草耐盐性提高。获得的转基因烟草在150mmol -L^NaCl胁迫下能够正常生长，根系发育正常，而野生型烟草生长受到抑制，说明转ThPER42烟草提高了植株的耐盐性。
图1为盐胁迫下盐芥不同组织中ThPER42半定量表达分析。图2为双酶切鉴定ThPER42与载体连接。其中A为双酶切鉴定ThPER42与pGEM_T载体连接；B为双酶切鉴定ThPER42与 PPZP212载体连接。图3为转化农杆菌EHA105后的菌液PCR检验目的片段。图4为烟草无菌苗的培养与转ThPER42烟草抗生素抗性植株筛选。图5为转ThPER42基因烟草的鉴定。图6为转ThPER42烟草与载体对照型烟草与在含有NaCl的MS平板上的生长状况。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1、盐芥ThPER42的全长序列的获取一、盐芥HiPER42全长序列的获取总RNA 的提取。盐芥(Thellungiella，Shandong Ecotype)在混合土中种植 6 周后，转入装有新的珍珠岩m 蛭石m(l 1)育苗介质中，300mmol · L-1NaCl处理24h后取样，采用Trizol法提取总RNA，具体操作按照说明书进行。cDNA 的合成。取植株总 RNA 2μ g,2y L Oligo (dT)，1 μ L RNasin，补充 DEPC 水至总体积14. 5 μ L，放于65°C变性处理lOmin，取出后冰浴5min。力卩4 μ L5 X buffer, 2 μ L dNTP，M-MLV逆转录酶0. 5 μ L，混勻。37°C保温1. 5h，然后于95°C IOmin终止反应。盐芥ThPER42全长序列的获得。根据在NCBI上登录的盐芥ESTs序列，检索到与 AtPER42同源的ESTs序列，根据保守序列设计引物，用于扩增盐芥ThPER42基因的cDNA的中间片段。将得到的PCR产物在1.0%的琼脂糖凝胶中电泳分离，回收目的片段进行测序。 根据已测序的基因部分序列，按照SMART RACE试剂盒的要求设计引物。3’和5’RACE按照 SMART RACE试剂盒说明书进行。将RACE得到的PCR产物在1. 0%的琼脂糖凝胶中电泳分离，回收目的片段进行克隆测序。用DNAMAN软件进行序列对比分析，拼接得到全长cDNA序列。在ORF两端设计引物，以cDNA为模板进行RT-PCR，获得包含完整ORF的盐芥ThPER42 基因的cDNA序列。所涉及的引物序列分别为用于ThPER42基因片段扩增引物序列5 ’ -TCAAGAGTGGTGTTGTGAG-3’，5， -GGGTCAGGGATCGAGTCAG-3，；用于ThPER42基因3，末端扩增引物序列5’ -AGGTGCGATGATGGTGGCGATAC-3，；用于ThPER42基因5，末端扩增引物序列5’ -TGGGTCAGGGATCGAGTCAGGAC-3，；用于ThPER42基因全长扩增引物序列5， -GCAACTCAAGAGTGGTGTTG-3,5’ -TTCGATTCCACCATTCACTTATC-3，。ThPER42的全长cDNA序列由1似9个碱基组成，如序列表中序列1所示，第1 58 位为5，-讥1 ，第59 1(^4位为01^，第1055 1似9位为3，-^^，并带有441444和？017(八) 序列。序列表中序列1第59到IOM位编码具有序列表中序列2的氨基酸序列的蛋白，将该蛋白命名为ThPER42。序列表中序列2由331个氨基酸残基组成，分子量为37454Da，pi 为 7. 64。二、盐芥ThPER42的半定量RT-PCR表达分析所用植物材料及种植方法步骤一相同。待盐芥生长至6周时，进行盐胁迫处理 24h, NaCl浓度为100、200、300、400和500mmol · 分别取地上部和根组织，提取总RNA0 以盐芥tubulin为内参基因，并选取25个循环为PCR循环数，进行ThPER42的RT-PCR扩增。扩增结果如图1所示。从图1以看出，正常条件下ThPER42在地上部组织和根组织中都表达，经过盐胁迫，地上部组织和根组织中的ThPER42的表达量增加，其中地上部组织在IOOmmol · L—1下表达量最高；而根组织中在200mmol · L—1下表达量最高。实施例2、转基因植物的获得及其检测一、转基因植物的获得1、重组表达载体构建载体 pPZP212 的参考文献Peter Hajdukiewicz, Zora Svab and Pal Maliga, The small, versatilepPZP family of Agrobacterium binary vectors for plant transformation, Plant Molecular Biology Volume 25, Number 6,989-994, DOI 10. 1007/BF00014672。公众可以通过 Addgene (http://www. addgene. org/)免费获取该载体。设计如下引物含XbaI 酶切位点引物序列为5，-TGCTCTAGAATGGGAGGAAAAGGTG-3’ ；含&ic I 酶切位点引物序列为5，-CGAGCTCTCAGTGGATCTTG-3’。以人工合成的序列表中序列1所示的ThPER42基因为模板，进行PCR扩增，获取含酶切位点ThPER42全长序列。回收产物后与pGEM-T easy Vector (pGEM-T easy Vector 购自Promega公司，产品目录号为A1360)连接，转化大肠杆菌Ε. coli DH5 α (Ε. coliDH5a 购自天根生化科技有限公司，产品目录号为CB10102)，进行抗性筛选，挑取阳性克隆，将阳性克隆进行液体培养，提取阳性克隆质粒，进行酶切鉴定。以^CbaI和Mc I双酶切 pGEM-T-ThPER42重组载体，结果如图2中A所示，图2中A的泳道1、2、3皆为双酶切结果，小片段约为IOOObp左右，与ThPER42片段长度相符，大片段约为3000bp左右，为pGEM_T easy Vector。进一步将菌液进行测序，测序结果表明在pGEM-T Vector载体中插入了序列表中序列1中第59-10M位核苷酸所示的ThPER42基因片段，证明HiPER42片段和T-vector已经连接。以)(ba I和Mc I对PPZP212质粒进行双酶切，回收载体大片段。将载体大片段与HiPER42基因连接，将连接产物转化E. coli DH5 α感受态细胞，复苏后涂布于LB (Spec， IOOyg- mL—1)平板上进行筛选。挑取菌斑接种到5mL LB(Spec, IOOyg- mL—1)培养液中 37°C振荡培养过夜；菌液PCR，1 %琼脂糖电泳检测。提取质粒，以)(bal和Mc I对连接产物质粒进行双酶切鉴定。结果如图2中B所示，图2中B的泳道2为双酶切产物，大片段长度约为101Λ，小片段大小约为lOOObp，证明ThPER42已经与pPZP212载体大片段连接。测序结果表明在pPZP212载体的)(baI和Mc I酶切位点间插入了序列表中序列 1中第59-10M位核苷酸所示的ThPER42基因片段，证明HiPER42片段已经连接到pPZP212 载体上。将制备得到的重组质粒命名为pPZP212-ThPER42。2、转基因植物获得将步骤1获得的重组质粒pPZP212_ThPER42采用冻融法转化感受态农杆菌 EHA105。对经过遗传转化的农杆菌菌液进行PCR检验目的片段，结果见图3。图3中泳道1 4均显示有目的基因ThPER42，约为IOOObp左右，证明目的基因已经转入了农杆菌EHA105中。分别将带有pPZP212-ThPER42的农杆菌EHA105接种于200mL含抗生素 (100 μ g · nrtif，100μ g · mL^Spec)的 LB 液体培养基中，培养至 0D600 = 0. 8 1. 0， 40C，5000rpm离心lOmin，去上清，沉淀菌体悬浮于200mL渗透液(含有50g · L—1的蔗糖和 200 μ L · Γ1的表面活性剂Silwet-77)中。
叶盘法转化烟草。烟草(K326)接种于MS培养基，置于 25°C光照培养箱， 每天光照16h，黑暗他，生长6周。取烟草无菌苗的叶片，去主脉，切成0.5 IcmXO. 5 Icm的烟草叶盘，加入含有pPZP212-ThPER42的农杆菌EHA105菌液中，浸泡lOmin。接种在培养基Tl (MS+1. Omg Γ'Θ-ΒΑ+Ο. Img .L4NAA)上，暗培养3天，转移到筛选培养基T2 (M S+100mg L_1Kan+400mg 'L^Cef+l. Omg 'L-16-BA+0. Img 'T1NAA)中，24°C光照培养2 周。再用含500mg · L^1Cef无菌水冲洗一次，转至筛选培养基中。待获得具有Kan抗性芽至2cm时， 转至生根培养基(l/2MS+100mg .I^Kar^^Omg .L-1Cef)，5d IOd后长出不定根，移栽到由营养土 珍珠岩蛭石(质量比为2 1 1)组成的介质中生长，获得待检测的烟草植株 (图 4)。转ThPER42基因烟草的鉴定。采用CTAB法提取5株待鉴定转ThPER42烟草叶片基因组DNA，以基因组DNA为模板，进行对目的基因ThPER42的PCR扩增，电泳检测，检测结果见图5中A，图5中A显示编号为1-5的5株待鉴定转ThPER42烟草的PCR扩增产物电泳后均有目的条带出现，大小约为IlOObp左右，有可能转入了 ThPER42。取经初步鉴定为阳性(编号为1-5)的转ThPER42基因烟草，采取Trizol法提取其叶片总RNA，进行RT-PCR，电泳结果见图5中B，其中，泳道1_5分别为上述编号为1_5的阳性转ThPER42基因烟草的RT-PCR检测结果，CK为阴性对照，从图中可见，在转录水平上， 编号为1、3和4的烟草植株中含有目的基因ThPER42。将鉴定阳性的转基因烟草培养得到种子在含卡那霉素的培养基中培养，长出绿叶和根系的苗为转基因烟草Tl代。按照获得转 ThPER42基因烟草的方法，将空载体PPZP212转化烟草植株，得到转空载体对照烟草。二、抗逆性检测将鉴定为转ThPER42基因的Tl代烟草和转空载体对照(Vector control)烟草分别播种于MS培养基和含有Kan的MS培养基上，生长3周之后转入150mmol · L^1NaCl的 MS平板上，培养条件为每天光照16h，黑暗》!;23°C 25°C ；胁迫3_4周后，观察表型，结果见图6。图6中A和B平板的左侧为载体对照型烟草，右侧为转ThPER42烟草；A 生长 2周的植株；B 生长4周的植株；图6中C为150mmol · L^1NaCl胁迫4周后转ThPER42烟草(左侧4株)和载体对照烟草(右侧4株)的幼苗生长对比。从图中可见，相同生长条件下，载体对照烟草生长受到抑制，幼苗较小；转ThPER42烟草生长正常，幼苗较大。分别测定幼苗萌发后生长5周后的5株幼苗的生长量，结果表明，转ThPER42烟草的平均鲜重 (Fresh weight, Fff)为 0. 445 士 0. 067(g)，平均根长 12. 680 士 4. 075 (cm)，平均侧根数量为 12. 250 士 3. 500(条)，载体对照烟草的平均鲜重(Fresh weight, Fff)为 0. 151 士 0. 077 (g)， 平均根长6. 030 士 2. 441 (cm)，平均侧根数量为5. 500 士 1. 265 (条)。转ThPER42烟草的鲜重(FW)、根长和侧根数量分别为载体对照烟草的2. 94倍、2. 10倍和2. 23倍。野生型烟草与转空载体对照烟草的结果一致。
权利要求
1.一种培育转基因植物的方法，是将序列表中序列2所示蛋白的编码基因转入出发植物中，得到耐逆性高于所述出发植物的转基因植物。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述蛋白的编码基因为如下1)-4)中任一所述的基因1)其核苷酸序列是序列表中序列1；2)其编码序列是序列表中序列1第59-10M位核苷酸所示；3)在严格条件下与1)或幻的基因杂交且编码所述蛋白的基因；4)与1)或2)或3)的基因具有90%以上的同源性且编码所述蛋白的基因。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于所述耐逆性为耐盐性。
4.根据权利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于所述蛋白的编码基因是通过重组表达载体导入出发植物中；所述重组表达载体为在载体PPZP212的多克隆位点间插入所述蛋白的编码基因得到的重组表达载体。
5.根据权利要求1-4中任一所述的方法，其特征在于所述目的植物为双子叶植物或单子叶植物；所述双子叶植物具体为烟草、盐芥或拟南芥。
6.含有序列表中序列2所示蛋白的编码基因的表达盒、重组载体、转基因细胞系或重组菌。
7.根据权利要求6所述的重组载体，其特征在于所述重组载体为在载体PPZP212的多克隆位点间插入序列表中序列2所示蛋白的编码基因得到的重组表达载体。
8.序列表中序列2所示蛋白的编码基因和/或权利要求6所述的表达盒、重组载体、转基因细胞系或重组菌在培育耐逆植物中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于所述耐逆植物为耐盐植物；所述植物为双子叶植物或单子叶植物；所述双子叶植物具体为烟草、盐芥或拟南芥。
10.序列表中序列2所示蛋白。
全文摘要
本发明公开了盐芥ThPER42基因的应用。本发明所提供的培育转基因植物的方法，是将序列表中序列2所示蛋白的编码基因转入出发植物中，得到耐逆性高于所述出发植物的转基因植物。本发明采用农杆菌介导方法将ThPER42转入烟草中，获得的转基因烟草耐盐性提高。获得的转基因烟草在150mmol·L-1NaCl胁迫下能够正常生长，根系发育正常，而野生型烟草生长受到抑制，说明转ThPER42烟草提高了植株的耐盐性。
文档编号C12N1/21GK102517325SQ20111043072
公开日2012年6月27日 申请日期2011年12月20日 优先权日2011年12月20日
发明者冯金朝, 周宜君, 张根发, 徐小静, 程文静, 耿玉珂, 韦善君, 马亭亭, 高飞 申请人:中央民族大学