专利名称：人miR-183/96/182簇的应用及其检测试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及人miR-183/96/182簇的应用方法，以及一种脑胶质瘤诊断试剂盒。
背景技术：
脑胶质瘤是起源于脑部神经胶质细胞，是最常见的颅内肿瘤，约占所有颅内肿瘤的45%左右。脑胶质瘤系浸润性生长，和正常脑组织没有明显界限，难以完全切除，对放疗化疗不甚敏感，非常容易复发。化学药物和一般抗肿瘤的中药，因血脑屏障等因素的影响， 疗效也不理想，迄今为止脑胶质瘤仍是全身肿瘤中预后最差的肿瘤之一，因此脑胶质瘤的基础研究和临床治疗仍然是世界难题。miRNA是在真核生物中发现的一类内源性的具有调控功能的非编码RNA，其大小长约19 25个核苷酸。其主要通过碱基互补配对的方式识别靶mRNA，并根据互补程度的不同指导沉默复合体降解靶mRNA或者阻遏靶mRNA的翻译。 miRNA与蛋白编码基因一样，具有主要的生物学功能，大多数miRNA在肿瘤中发挥主要功能作用，有望成为肿瘤新的判定预后标志物和靶向治疗的工具，为人类战胜脑胶质瘤提供新的策略。全基因组水平非编码DNA序列的研究发现，有相当一部分miRNA基因在染色体上的分布是非随机的，它们紧密相邻，排列成簇。miRNA簇一般有几个miRNA组成，miRNA簇的表达异常参与机体的生理、病理过程。miR-106b-25簇中的3个miRNA成员在头颈部鳞癌、 结肠癌、髓母细胞瘤、食管癌、多发性骨髓瘤、肝癌等多种肿瘤组织及肿瘤细胞株中都高表达。研究表明，miR-17-92簇的异常高表达能通过降低肿瘤抑制蛋白PTEN的水平而促进淋巴瘤和白血病生长和存活，同时还能够抑制Rb蛋白促进成视网膜细胞瘤的生长增殖。由此可见，miRNA簇在探寻肿瘤分子标志物方面具有巨大潜力，相信在不久的将来，miRNA簇将会大大促进在肿瘤病人预后预测中的应用。研究表明，miRNA簇中的个体之间可能以协同方式参与肿瘤的发生发展，miR-17-92簇中miR-17、miR_18a、miR_19a、 miR-20a、miR-19b、miR-9^i在多种肿瘤的发生发展中呈现协同作用，且与肿瘤的预后相关， 同时miR-17与miR-9h有望成为判定结肠癌预后的分子标志物。临床上常采用多种肿瘤标志物联合检测，应用多变量分析的方法来提高诊断的阳性率和特异性。不少证据表明，同一肿瘤可含有多种肿瘤标志物，而不同肿瘤或同种肿瘤的不同组织类型，除有共同的标志物外，也可有不同的标志物。对某一特定的肿瘤测定，可同时选择几种特异性较高的标志物， 互相补充，提高诊断的阳性率。在大肠癌的肿瘤标志物检测中，癌胚抗原是最常用于大肠癌的肿瘤标志物。尤其常用于对大肠癌的治疗效果及预后、复发的监测。但由于癌胚抗原的特异性、灵敏性有限，常需联合检测CA19-9、CA50等肿瘤标志物，以提高诊断准确性。最近研究表明，miR-182在胶质瘤组织表达显著升高，其表达越高，胶质瘤患者预后越差。miR-182 与miR-183、miR-96呈簇排列，联合检测胶质瘤组织中的miR-183/96/182有望为胶质瘤临床提供更准确的诊断与预后判定
发明内容
本发明的目的在于提供一种人miR-183/96/182簇在制备脑胶质瘤诊断、预测、检测或筛查制剂上的应用方法，并提供一种性价比高、易于推广应用的脑胶质瘤诊断试剂盒。人miR-183/96/182簇用于制备脑胶质瘤诊断、预测、检测或筛查制剂；所述的 miR-183/96/182簇包括miR-183、miR-96和miR-182 ；特别是用于制备脑胶质瘤诊断、预测、 检测或筛查的试剂盒。人脑胶质瘤诊断试剂盒，包括l)Trizol、三氯甲烷、异丙醇；2) DEPC水或无酶水；3)逆转录缓冲液、氯化镁、三磷酸碱基脱氧核苷酸、RNA酶抑制剂；
4) MMLV逆转录酶或AMV酶；5) miR-183、miR-96、miR-182以及内参U6SNRNA的特异性逆转录引物；6)实时定量PCR缓冲液、miR-183、miR_96、miR-182以及内参U6SNRNA的实时定量特异性PCR引物；7) SYBR-Green染料、Taq聚合酶、双蒸水。miR-183的实时定量特异性PCR引物，其正向引物为5 ‘ -CGAACGATATGGCACTGGTAGA 3 ‘，其反向引物为5' -TATGGTTGTTCTCGTCTCCTTCTC-3‘。miR-96的实时定量特异性PCR引物，其正向引物为5 ‘ -CGAACTTTGGCACTAGCACATT-3 ‘，其反向引物为5 ‘ -TATGGTTGTTCTCGTCTCCTTCTC-3 ‘。miR-182的实时定量特异性PCR引物，其正向引物为5 ‘ -ACTTTTGGCAATGGTAGAACTCAC-3 ‘，其反向引物为5 ‘ -AATCCATGAGAGATCCCTAGCG-3 ‘。TOsnRNA的实时定量特异性PCR引物，其正向引物为5 ‘ -ATTGGAACGATACAGAGAAGATT-3 ‘其反向引物为5 ‘ -GGAACGCTTCACGAATT TG-3 ‘。miR-183/96/182 簇包括 miR-183 (miRBase 登录号MI0000273)、miR-96 (miRBase 登录号MI0000098) ,miR-182 (miRBase 登录号MI0000272)，位于染色体 7q32. 2，属于基因间miRNA。申请人首先通过原位杂交检测M例正常大脑组织和66例脑胶质瘤中的表达情况，结果发现，miR-183/96/182簇中三个miRNA在脑胶质瘤组织中均呈现高表达(图1)，经统计分析，miR-183、miR-96、miR-182在66例脑胶质瘤组织中表达阳性率分别为84. 85%, 87. 88%,96. 97% ；而miR-183、miR-96、miR-182在24例正常大脑组织中表达阳性率分别为16. 67%、16. 67%,8. 3%0 miR-183/96/182簇中三个miRNA在脑胶质瘤组织中表达阳性率与正常大脑组织比差异均有统计学意义(P<0.01)。实时荧光定量PCR技术是目前检测组织miRNA表达中权威的检测方法之一。为了更好地判定miR-183/96/182簇在脑胶质瘤组织中的表达情况，申请人运用实时荧光定量PCR发现，miR-183/96/182簇中三个miRNA 在脑胶质瘤组织中表达均上调，与正常大脑组织比，miR-183、miR-96、miR-182分别上调 3. 34士0. 64,3. 67士0. 71,3. 83士0. 68 倍(图 2)。随访资料显示，miR-183/96/182簇中miR-183高表达的33例脑胶质瘤病人中
4有20例死亡，而miR-183低表达的33例脑胶质瘤病人中仅有6例死亡；miR-96高表达的35例脑胶质瘤病人中死亡21例，而miR-96低表达的35例脑胶质瘤病人中仅有5例死亡；miR-182高表达的34例脑胶质瘤病人中有22例死亡，而miR-182低表达32例脑胶质瘤病人中仅有4例死亡；经Kaplan-Meier统计学分析miR-183/96/182簇中单个miRNA高表达的脑胶质瘤病人总生存率均低于单个miRNA低表达的病人，差异均有统计学意义(P < 0. 01)(图3)，同时在，miR-183/96/182簇中三个miRNA共同高表达的23例脑胶质瘤病人中有18例死亡，其中两个miRNA高表达9例脑胶质瘤病人中有4例死亡，一个miRNA高表达的16例脑胶质瘤病人中有2例死亡，三个miRNA全部低表达的18例miRNA中有2例死亡。经Kaplan-Meier统计学分析miR-183/96/182簇三个miRNA共同高表达的脑胶质瘤病人总生存率显著低于任意两个高表达或一个高表达的脑胶质瘤病人，差异具有统计学意义(P < 0. 01)。提示miR-183/96/182簇中单个miRNA在脑胶质瘤中高表达，是预测脑胶质瘤预后的分子标志，且联合miR-183/96/182簇中三个miRNA判定预后更有意义。本发明为脑胶质瘤预后预测提供了强有力的技术支持和分子生物学基础，具有深远的临床意义和推广性。
图1原位杂交检测miR-183/96/182簇在脑胶质瘤组织中的表达改变；图2实时荧光定量PCR测miR-183/96/182簇在脑胶质瘤组织中的表达改变；图3miR-183/96/182簇中单个miRNA与脑胶质瘤病人预后的关系；图4联合miR-183/96/182簇中三个miRNA与脑胶质瘤病人预后的关系。
具体实施例方式在前期研究工作中，发明人利用miRNA芯片和SAM软件分析筛查10例正常脑组织和10例脑胶质瘤组织中差异表达的miRNA时，发现miR-182在正常脑组织和脑胶质瘤组织中存在明显差异，并通过miRBase数据库(http://www. mirbase. org/)发现miR-183、 miR-96与miR-182呈簇排列。通过进一步组织研究，发明人发现miR-183/96/182簇中三个miRNA在脑胶质瘤组织中均呈现高表达(参见图1, 。miR-183/96/182簇中单个高表达的miRNA脑胶质瘤病人总生存率均低于单个miRNA低表达的病人，同时miR-183/96/182簇三个miRNA共同高表达的脑胶质瘤病人总生存率显著低于任意两个高表达或一个高表达的脑胶质瘤病人(参见图3，4)。这提示miR-183/96/182簇是预测脑胶质瘤预后的分子标志。实施例1脑胶质瘤组织诊断试剂盒组成(50次反应)1.异丙醇 100ml，2.三氯甲烷 100ml，3. Trizol 50ml,4. DEPC水或无酶水IOml，双蒸水IOml，5. 5 X逆转录缓冲液Iml，6. 25mM 氯化镁 lml，7. IOmM三磷酸碱基脱氧核苷酸Iml，
8. 5U/ μ 1 RAN 酶抑制剂 500 μ 1,9. 200U/ μ 1 MMLV 逆转录酶 50 μ 1 或 25U/ μ IAMV 酶 50 μ 1，10. 2 X实时定量PCR缓冲液^il，11. 5U/μ 1 Taq 聚合酶 50 μ 1，12. 5 μ M miR-183 特异性 PCR 引物 50 μ 1，其正向引物为5 ‘ -CGAACGATATGGCACTGGTAGA 3 ‘，其反向引物为5 ‘ -TATGGTTGTTCTCGTCTCCTTCTC-3 ‘。5 μ M miR-96 特异性 PCR 引物 50 μ 1，其正向引物为 5 ‘ -CGAACTTTGGCACTAGCACATT-3 ‘，其反向引物为5 ‘ -TATGGTTGTTCTCGTCTCCTTCTC-3 ‘。5 μ M miR-182 特异性 PCR 引物 50 μ 1，其正向引物为5 ‘ -ACTTTTGGCAATGGTAGAACTCAC-3 ‘，其反向引物为5 ‘ -AATCCATGAGAGATCCCTAGCG-3 ‘。13. 5 μ M U6snRNA 特异性 PCR 引物 30 μ 1其正向引物为5 ‘ -ATTGGAACGATACAGAGAAGATT-3 ‘其反向引物为5 ‘ -GGAACGCTTCACGAATT TG-3 ‘14. 10 μ M miR-182、miR-183、miR-96特异性逆转录引物各20 μ 1 (购于上海吉玛生物技术有限公司，QPM010)。15. 10 μ M TOsnRNA特异性逆转录引物20μ 1(购于上海吉玛生物技术有限公司， QPMO10)。实施例2组织样本中miR-183/96/182簇中三个miRNA的检测1、组织RNA的抽提取组织标本与研钵中加入液氮研磨标本；于研钵中加入0. 6ml Trizol研钵标本，研磨成勻浆后用药勺加入tube管中；于tube管加入0.細1 Trizol ；加氯仿200 μ 1/ mlTrizol于Tube中，用手震荡15_30s，冰上放置5min，4°C 12000g离心15min ；小心取上层水相入新tube中，加入预冷的异丙醇0. 5ml/mlTrizol混勻，_20°C冰箱静置20min， 4°C 12000g离心IOmin ；弃上清，加入75% DEPC水稀释的乙醇l_2ml混勻，4°C 7500g离心 5min,尽量弃上清，室温干燥5-10min，加入DEPC水10-20 μ 1溶解RNA。分光光度计测RNA 的浓度及质量，0拟60/280比值在1. 6-1. 8之间并进行EB胶电泳检测RNA质量，-70°C保存。2、miR-183、miR-96和miR-182特异性逆转录使用普洛麦格!Iomega公司的逆转录试剂盒(A3500)和上海吉玛生物技术有限公司生产的Hairpin-itTM miR-183, Hairpin-itTM miR-96, Hairpin-itTM miR-182 逆转录特异性引物 ^jPMOlO)分别对 miR-183、miR-96和miR-182进行逆转录。20 μ L逆转录反应的体系如下成分剂量/管5χ逆转录缓冲液4μ1镁离子(25mM)3μ1三磷酸碱基脱氧核苷酸(IOmM)0.75μ1MiRNA逆转录引物(ΙμΜ)1.20μ1RAN酶抑制剂UOU/μΙ)0.25μ1MMLV 逆转录酶(200υ/μ1)0.2μ1RNA 样本(Ipg总 RNA)Χμ 无酶水To 20μ1在进行逆转录反应之前须将除了逆转录酶外的各种试剂混合成逆转录混合液，用手指轻弹装试剂的管子，将逆转录混合液用移液器吸打几次，不能用振荡器。miRNA逆转录程序16°C 30分钟，42°C 30分钟，85°C 10分钟。3、miR-183、miR-96 和 miR-182 特异性实时定量 PCR 先将 miR-183、miR-96 和 miR-182逆转录产物分别稀释至2倍，然后混勻。20 μ L反应体系如下
成分剂量/管2χ实时定量PCR缓冲液10μ1miRNA特异性引物(5μΜ)0.4μ1cDNA产物2μ1Taq 聚合酶(5υ/μ1)0.2μ1双蒸水To 20μ1miR-183、miR-96和miR-182实时定量PCR反应程序95°C 3分钟，40个循环， 950C 12 #, 620C 35 秒。使用STOR-Green染料进行实时定量PCR扩增。miR-183的PCR特异性引物为正向引物5‘ -CGAACGATATGGCACTGGTAGA 3 ‘，反向引物5‘ -TATGGTTGTTCTCGTCTCCTTCTC-3 ‘。miR-96的PCR特异性引物为正向引物5‘ -CGAACTTTGGCACTAGCACATT-3 ‘，反向引物5‘ -TATGGTTGTTCTCGTCTCCTTCTC-3 ‘。miR-182的PCR特异性引物为正向引物5‘ -ACTTTTGGCAATGGTAGAACTCAC-3 ‘反向引物5‘ -AATCCATGAGAGATCCCTAGCG-3 ‘TOSnRNA作为内参基因，其PCR引物序列为正向引物5‘ -ATTGGAACGATACAGAGAAGATT-3 ‘
反向引物5‘ -GGAACGCTTCACGAATT TG-3 ‘(4) Δ Ct指标的测定Δ Ct指同一样品中，待检miRNA与内参TOSnRNA平均Ct值的差值。即 miRNA Δ Ct = miRNA MeanCT-control MeanCT，本发明中，厶(^为111土1 -182与 UBsnRNA的平均Ct值的差值，获得相对定量Δ CT值，并进行判断，结果显示，在检测的66例胶质瘤组织中，当Δ Ct ^ 8. 52时，miR-183表达阳性有48例，阳性率为72. 73%, miR-96 表达阳性有51例，阳性率为77. 27%, miR-182表达阳性有53例，阳性率为80. 30%, M miR-183/96/182簇(三个miRNA有一个呈阳性)表达阳性有64例，阳性率为96. 97%。经统计学分析，miR-183/96/182簇与单个miRNA的阳性率比，差异有统计学意义(P < 0. 01)。实施例3 miR-183/96/182簇中三个miRNA与脑胶质瘤病人的预后关系运用实时荧光定量PCR技术，检测了 M例正常大脑组织和66例胶质瘤组织中的 miR-183/96/182簇中单个miRNA表达情况，然后对每一例检测的胶质瘤病人进行预后随访，结果显示miR-183/96/182簇中单个miRNA高表达的脑胶质瘤病人总生存率均低于单个miRNA低表达的病人，同时miR-183/96/182簇三个miRNA共同高表达的脑胶质瘤病人总生存率显著低于任意两个高表达或一个高表达的脑胶质瘤病人(参见图3，4)。这提示 miR-183/96/182簇是预测脑胶质瘤预后的分子标志。以上研究表明，检测脑胶质瘤组织中miR-183/96/182簇的表达，具有很好的稳定性，当ACt彡8. 52时，提示是脑胶质瘤的可能性为96. 97%，miR-183/96/182簇可以作为脑胶质瘤患者预后预测的特异性分子标志物，miR-183/96/182簇与胶质瘤预后显著相关， 可以用于脑胶质瘤病人预后预测。
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权利要求
1.人miR-183/96/182簇的应用方法，其特征在于，所述的人miR-183/96/182簇用于制备脑胶质瘤诊断、预测、检测或筛查制剂；所述的miR-183/96/182簇包括miR-183、miR-96 和 miR-182。
2.根据权利要求1所述的应用方法，其特征在于，所述的人miR-183/96/182簇用于制备脑胶质瘤诊断、预测、检测或筛查的试剂盒。
3.一种人脑胶质瘤诊断试剂盒，其特征在于，包括1)Trizol、三氯甲烷、异丙醇；2)DEPC水或无酶水；3)逆转录缓冲液、氯化镁、三磷酸碱基脱氧核苷酸、RNA酶抑制剂；4)MMLV逆转录酶或AMV酶；5)miR-183、miR-96、miR-182以及内参U6SNRNA的特异性逆转录引物；6)实时定量PCR缓冲液、miR-183、miR-96、miR-182以及内参U6SNRNA的实时定量特异性PCR引物；7)SYBR-Green染料、Taq聚合酶、双蒸水。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于， miR-183的实时定量特异性PCR引物，其正向引物为 5 ‘ -CGAACGATATGGCACTGGTAGA 3 ‘，其反向引物为 5 ‘ -TATGGTTGTTCTCGTCTCCTTCTC-3 ‘。miR-96的实时定量特异性PCR引物，其正向引物为 5 ‘ -CGAACTTTGGCACTAGCACATT-3 ‘，其反向引物为 5 ‘ -TATGGTTGTTCTCGTCTCCTTCTC-3 ‘。miR-182的实时定量特异性PCR引物，其正向引物为 5 ‘ -ACTTTTGGCAATGGTAGAACTCAC-3 ‘，其反向引物为 5 ‘ -AATCCATGAGAGATCCCTAGCG-3 ‘。TOsnRNA的实时定量特异性PCR引物，其正向引物为 5 ‘ -ATTGGAACGATACAGAGAAGATT-3 ‘其反向引物为 5 ‘ -GGAACGCTTCACGAATT TG-3'。
全文摘要
本发明公开了一种人miR-183/96/182簇的应用方法及其检测试剂盒，其用于制备脑胶质瘤诊断、预测、检测或筛查制剂；特别是提供了一种用于制备脑胶质瘤诊断、预测、检测或筛查的试剂盒。该试剂盒通过相对定量的检测疑似脑胶质瘤组织标本中miR-183/96/182簇中三个miRNA的表达状况，用于脑胶质瘤病人预后预测。
文档编号C12Q1/68GK102424843SQ20111043460
公开日2012年4月25日 申请日期2011年12月22日 优先权日2011年12月22日
发明者刘晓萍, 唐海林, 徐刚, 李桂源, 武明花, 王泽友, 邓敏 申请人:中南大学