水稻立枯丝核菌effector基因AG1IA010188及其应用的制作方法

专利名称：水稻立枯丝核菌effector基因AG1IA010188及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及基因工程技术领域，具体地说，涉及一种水稻立枯丝核菌effector基因AG1IA010188及其应用。
背景技术：
由立枯丝核菌引起的水稻纹枯病是一种真菌病害，和稻瘟病、白叶枯病并列水稻三大病害。立枯丝核菌侵染范围广，包括水稻、玉米、小麦、土豆、牧草、大豆等多种作物。立枯丝核菌能够引起如此多种作物发生病害是与其分泌effector (效应因子)分子密切相关的。这种分子可以调节宿主的先天免疫并增强寄生感染。现在已普遍认为这些effector 是增强寄生感染的关键的致病性决定因素(Kamoun，2007 ；Hogenhout et al.，2009)。立枯丝核菌通过分泌effector分子，紧密的与其宿主植物联系并精密的操控植物细胞。Effector靶向植物分子，改变植株进程。在植物病原菌相互作用中，effector是主要的致病性决定因素，他们调解植物的先天免疫并且加强寄生感染。现在，在国际会议上， 丝状病原菌effector的染色体组组织、进化、交换及功能研究已经成为很活跃的研究探讨领域。丝状病原菌分泌蛋白质以扰乱它们侵入的宿主的概念并不是特别新颖，但是这方面的研究正在加快，因为它使生成某个特定病原菌物种中的整套分泌蛋白目录成为可能 (Dean et al.，2005 ；Kamper et al.，2006 ；Haas et al. , 2009)。这一方面的研究被基因组测序时代的到来以及伴随的分泌信号的云计算预测和其它的effector序列基序诊断程序所推动。一些病原真菌effector家族的特征之一是含有线性基序或是含有与特定功能相关的短序列模式，比如转位到宿主细胞内或是靶向宿主细胞核。RXLR是这些effector分子中最突出的例子，它定义了卵菌RXLR家族中的一个宿主运输结构域。预测的RXLR也被用在高通量的筛选中，以尽快并有效的确定它们的新的功能活性。ATRl和ATR13是模式植物拟南芥的卵菌病原菌Hyaloperonospora arabidopsidis 的具有无毒基因活性的两个effector。ATRl和ATR13是分泌型的RXLR effector长度分别为310和150个氨基酸，并分别诱发RPPl-Nd/ffsB和PP13_Nd介导的抗性(Allen et al.， 2004 ；Rehmany et al.，2005)。这种相互作用的共调解已经形成了不同的、快速进化的无毒基因和抗性基因的同位基因(Allen et al. ,2008 ；Hall et al.，2009)。ATR13除了具有信号肽和RXLR基序的特征外，还包含一个保守的7亮氨酸/异亮氨酸重复序列，这个重复序列是被RPP13识别所必须的(Allen et al.，2008)。事实上这个重复序列的突变并没有进化意味着它是发挥毒性作用所必须的(Allen et al.，2008)。另外，无毒活性也依赖于ATR13C-端的可变氨基酸(Allen et al.，2008)。值得注意的是在RPP13家族中至少有一个基因以迄今为止都不知道的方式识别ATR13的等位基因，这强调了无毒基因和抗性基因复杂的相互作用网络(Hallet al. ,2009) ATRl和ATR13在H. arabidopsidis中的高度可变性及它们在拟南芥中的同源基因的多样性意味着这些effector可能极其有助于病原菌的适应性。ATRl和ATR13在抑制基础的抗性通路中的作用已经通过在细菌植物病原菌Pseudomonas syringae DC3000中进行异源表达并运输到宿主细胞中建立起来(Sohn et al.，2007)。当被P. syringae DC3000运输到拟南芥中时，ATRl和ATR13都增加了毒性，并且减少了拟南芥中胼胝质的积累(Sohn et al.，2007)。AVR3a 是 Phytophthora infestans 的细胞质 RXLR effector 蛋白。AVR3a 的一个有趣特征是它在致病机制中的双重活性。AVR3a在表达R3a基因的植物中诱发过敏反应 (HR) (Armstrong et al.，2005)。但是在缺少 R3a 基因的植株中，AVR3a 抑制 P. infestans INFl隐地蛋白诱导的细胞死亡(Bos et al.，2006)。这些不同的活性可以在结构水平上分离。在C-端氨基酸残基酪氨酸147处发生了删除或突变的AVR3a保留了 R3a介导的过敏反应，但是不能抑制INFl诱导的细胞死亡(Bos et al.，2006 ；2009)。另外，AVR3a的两个主要的等位基因编码的蛋白质在effector结构域处只有两个氨基酸的差别，但是却有着很明显的活性差别。是AVR3aK8°m°3而不是AVR3a E80/M103活化了 R3a并且是INFl诱导的细胞死亡的比较强的抑制子((Bos et al.，2006)。除了 RXLR effector外，对P. infestans的分泌蛋白的研究又确认了另一个细胞质effector家族，即Crinkler。Crinkler是卵菌的另外一个大的、多样化的effector 家族。高通量的功能筛选揭示了两个细胞死亡诱导蛋白CRm和CRN2(Crinkling and necrosis)，当它们在植株中系统性的表达时会引起叶片的皱缩表型(Torto et al., 2003)。随着P. infestans基因组序列的可利用性，对基因稀有区域的研究揭示了除了 RXLR effector基因外，CRN基因家族共定位于重复富集区域，并且跟其它的Wiytophthora基因家族相比，在P. infestans中CRN基因家族已经戏剧性的扩张(193个预测的基因)(Haas et al.，2009)。这个基因家族的扩充已经通过多基因复制和基因内部重组事件发生，这一事件最终导致了一个大的、多样化的嵌合effector系统(Haas et al.，2009)。CRN effector是以一个预测的N-端分泌信号肽为特征的模块化的蛋白质，后面是一个被保守的但并不是不变的LXLFLAK基序(CRN蛋白的主要的定义特征)定义的结构域(Haas et al.，2009)。大多数CRN在LXLFLAK结构域后携带一个以HVLVXXP基序结尾的DWL结构域(Haas et al.， 2009) 0 Haas et al. O009)提出CRN之间的重组，尤其是HVLVXXP基序后的重组，产生了极其多样化的C-端结构域(在P. infestans中是由36个相异的氨基酸决定的)。类似于好几个RXLR蛋白，一些CRN C-端(因此缺少预测的N-端转移结构域)的在植物细胞内的表达诱导了细胞死亡(Haas et al.，2009)。然而，在病害中CRN诱导的细胞死亡的相关性仍然是不清楚的。Yoshida et al. (2009)发现了从稻瘟病菌lnal68特有序列中挖掘到的三个候选 effector 基因 Pex22，Pex31 和 Pex33，分别与三个无毒表型 Avr-Pia，Avr-Pik/km/kp 和 Avr-Pii有着完美的联系。随后的遗传转化实验证实了是effector Pex22,Pex31和Pex33 赋予了分别表达Pia Pik/km/kp和Pii抗性基因的水稻培养系的无毒性。通过定位克隆得知被鉴定为是 Avr-Pia 的 Pex22 是独立的(Miki et al.，2009)。Pex22，Pex31 和 Pex33 都很小，在长度上分别为85，70和113个氨基酸，包含分泌信号，并且在水稻细胞中的细胞质中被识别，这意味着在感染的过程中它们被运输到植物细胞中。有趣的是Pex22形成一个包含四个同源物的小家族，这个小家族以两个序列基序的出现为特点基序1是[LI]xAR[SE] [DSE]，类似于Avr-Piz-t的LxAR基序，能够抑制BAX介导的细胞死亡(Li et al. ,2009)； 基序2是[RK]CXXCX12H，表现出与蛋白质-蛋白质相互作用有关的C2H2锌指基序的相似性(Yoshida et al. ，2009)。来自亚麻锈病菌Melampsora Iini的转移effectorAvrL567家族是通过与亚麻的抗性蛋白L5，L6和L7直被接的相互作用被认识到的(Dodds et al.，2006)。这个系统是特别的，因为AvrL567-A和AvrL567-D的晶体结构已经得到阐明(Wang et al.，2007)。这就允许在蛋白质结构背景下，在基因对基因基础上跟分子识别事件有关的多态性残基的作用进行检测(Wang et al.，2007)。两种蛋白都没有接近已知的结构同源物。四个重要的高度多态性残基在AvrL567的50、56、90和96位置处，它们对于激活R蛋白是关键的，并定位在这些effector蛋白的表面。有趣的是AvrL567的四个残基的分布横跨整个蛋白质表面，表明AvrL567和R蛋白的富亮氨酸重复结构域之间的相互作用，要求对于整体相互作用有累积效应的多重连接点。这在协同进化中保持或发展毒性功能(对于病原体来说是有利的)但同时规避宿主的检测可能是重要的。蛋白的结构也揭示了结合DNA的两个正电荷表面点，随后的体外实验表明这些蛋白结合到核酸上。这表明当从最初序列中几乎不能得到有用线索时，结构生物学是怎样促进effector的功能研究的。使用图位克隆策略克隆从L印tosphaeria maculans中得到了 AvrLml，AvrLm6 and AvrLm4-7 三个无毒基因(Gout et al. ,2006 ；Fudal et al. ,2007 ；Parlange et al., 2009)。它们编码预测的小的从122到205个氨基酸的分泌蛋白，与公共数据库中的任何蛋白都没有相似性。AvrLm6和AvrLm4-7分别包含6个和8个半胱氨酸残基。这些半胱氨酸可能在质体外能稳定AvrLm6和AvrLm4_7蛋白。然而，AvrLml只有一个半胱氨酸残基，考虑到目前为止所有被描述的质体外effector都是富半胱氨酸蛋白，所以AvrLml很可能转运到宿主细胞内(KamOUn，2007)。尽管我们很清楚它们有无毒性的活性，但是AvrLm识别的机制，相应的Rlm抗性基因和它们的作用位点仍然是不清楚的。跟目前克隆到的大多数其它真菌的effector真菌相比，这三个L. maculans基因有着较低的GC含量。它们都是单拷贝基因，位于富AT和富转座子的60kb (AvrLm4-7)，133kb (AvrLm6)，269kb (AvrLml)的类异染色质区域。这些effector定位在独特的基因组环境中，是真菌有条件的独立于染色体 (van der Does and R印，2007)，Plasmodium 的亚端粒区域(Pain et al.，2008)，或者在 P. infestans中基因稀有区域(Haas et al. ,2009)的遗迹。这被认为能够加快基因进化并加速病原体对宿主的适应性(van der Does and Rep, 2007 ；Pain et al.，2008 ；Haas et al.，2009)。丝状植物病原菌已经进化出了具有抑制蛋白酶活性以保护几种宿主水解酶活性的 effector 蛋白(Kamoun，2006)。近来 Misas-Villamil 禾口 van der Hoorn 已经对这些 effector和它们的宿主靶标做了评价O008)。寄主专化性毒素(HST)是具有化学多样性的effector分子，它是由植物致病真菌产生的作为毒性因子发挥功能。这些致病性决定因子只有在对产生这种毒素的病原菌敏感的宿主植物中才有活性(Wolpert et al.，2002)。有趣的是，好几种蛋白质HST，比如腐质营养真菌物禾中 Pyrenophora tritici-repentis 禾口 Stagonospora nodorum 白勺 PtrToxA, SnToxl, SnTox2和SnToX4都表现出光依赖模式的坏死诱导并促进了毒素敏感性的宿主小麦植株的感病性(Liu et al.，2004 ；Friesen et al.，2007 ；Abeysekara et al.，2009 ； Manning et al.，2009)。这些effector发挥功能所必须的，相应的显性的宿主基因Tsnl， Srml，Srm2，Snn4被绘制在毒素敏感宿主的染色体图谱上，并且这些基因的产物被认为是跟HST直接或间接相互作用的受体(Liu et al. ,2004 ；Friesen et al. ,2007 ；Abeysekara et al. ,2009 ；Manning et al.，2009)。值得注意的是，在HST中表现出与基因对基因不同的相互作用，在HST中受体分子是必须的而不是在经典的无毒-抗性基因相互作用中的抗性 (ffolpert et al.，2002)。PtrToxA 是在 P. triticirepentis 禾口 S. nodorum 的 HST 中研究的最透彻的。它有一个含N-端分泌信号的模块结构，分泌信号被切除以形成成熟蛋白，分泌信号后是宿主转运所必须的R⑶结构域和一个C-端effector结构域(Sarma et al. ,2005 ； Manning et al. ,2007) 据报道PtrToxA定位在叶绿体并且跟叶绿体蛋白ToxABPl相互作用(Manning et al.，2007)。一旦它转运到叶绿体中，PtrToxA就以光依赖的方式，通过干扰光系统I和光系统II促进毒力并最终诱导活性氧物质积累(Manning et al.，2009)。类^pl蛋白(NLP)是诱导双子叶植物坏死的细菌、真菌和卵菌毒素(Pemberton and Salmond, 2004 ；Ottmann et al. ,2009) 尽管它们在不同的分类群中的分布多种多样，NLP具有一个共同的折叠特征，S卩，有一个七肽(GHRHDWE)基序和两个保守的半胱氨酸，表现出与海洋生物产生的海葵溶细胞素和溶细胞毒素的结构相似性(Gijzen and Nurnberger，2006 ；Ottmann et al. ,2009) 在半活体营养的卵菌病原体 P. so jae 和 P. infestans中NLP基因(NPP1和PiNPPl. 1)的表达在宿主感染的后期腐质营养阶段是上调的(Qutob et al. ,2002 ；Kanneganti et al. ,2006) 这些NLP在它们的溶细胞活性作用下可能有助于宿主组织的死亡，并因此在腐质营养病原体生长过程中促进其侵入(Qutob et al. ,2002 ；Kanneganti et al.，2006)。尽管现在已经清楚一些NLP作为毒素促进毒力， 并不见得这一家族的所有成员在它们的宿主中都有溶细胞毒素的活性。目前我们仍然不清楚很多effector的生物化学活性以及它们是如何增强病原体的成功生殖的。我们也几乎不知道丝状病原体effector的靶标，特别是转移到宿主细胞内部的 effector。

发明内容
本发明的目的是分离克隆立枯丝核菌菌株AGlIA中携带的effector基因和包含调控这个基因的启动子的DNA片段。本发明的另一目的是提供该基因在设计农药分子靶点中的应用。本发明的进一步目的是提供该基因在建立分子检测体系，检测植物纹枯病发病情况中的应用。本发明的更进一步目的是提供该基因在提高水稻抗病育种中的应用。本发明分离克隆的立枯丝核菌菌株AGlIA中的effector基因AG1IA010188，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。该核苷酸序列在立枯丝核菌菌丝中呈组成型表达。上述基因的蛋白氨基酸序列如SEQ ID N0. 2所示。应当理解，在不影响蛋白活性的前提下(即不在蛋白的活性中心)，本领域技术人员对SEQ ID N0. 2所示的氨基酸序列进行各种取代、添加和/或缺失一个或几个氨基酸获得具有同等功能的氨基酸序列。此外，考虑到密码子的简并性，例如可在其编码区，在不改变氨基酸序列的条件下，或在其非编码区在不影响蛋白表达的条件下，对编码上述蛋白的基因序列进行修饰。因此，本发明还包括对编码上述蛋白的基因序列进行的替换、添加和/或缺失一个或多个氨基酸残基而形成的具有相同功能的氨基酸序列。本发明还包括基于所述基因的正义序列或反义序列，包括含有所述核苷酸序列或其片段的克隆载体或表达载体、含有所述载体的宿主细胞、含有所述核苷酸序列或其片段的转化的植物细胞核转基因载体。本发明同样包括将该基因的编码区和一个诱导型启动子连接，该启动子可以在 IPTG诱导下，在大肠杆菌细胞中表达这个基因。诱导型启动子包括组织特异性表达的启动子和精确环境诱导的启动子。本发明还包括将该基因的编码区和一个组成型表达的启动子连接，该启动子可以在任何条件下及在侵入组织的不同时期表达。这种组成型的启动子优选花椰菜花叶病毒35S的启动子，该启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO. 3所示。AG1IA010188与诱导型启动子连接后加入诱导剂后表达，不加诱导剂不表达；与组成型启动子连接后不需加入任何诱导剂便可持续表达。这样，环境的改变，侵入植株的不同时期都可以改变基因的表达。其中环境条件包括植株的生长状况、温度、湿度等，侵入植株的不同时期包括孢子萌发、附着胞形成、侵入钉分化和侵染菌丝扩展等。本发明提供的立枯丝核菌effector基因具有重要的应用价值。应用之一是根据该基因的结构及其功能来设计新型农药的分子靶点。应用之二是将所述基因序列连接到任何一种含有荧光蛋白基因的转化载体，用任何一种转化方法effector基因和荧光蛋白基因共价导入水稻或其它植物细胞。利用荧光共聚焦透射电镜可以观察到在水稻或其它植物细胞中与荧光蛋白融合表达的effector蛋白在植物细胞中的迁移及定位。利用此effector为诱饵蛋白钓出水稻或其它植株中与该 effector蛋白结合的受体蛋白。应用之三是利用基因工程方法敲除水稻或其它植物细胞中该受体基因或删除、 添加、突变该受体基因的一个或多个碱基以缺失或改变受体基因的功能，得到抗某一 effector的抗性植株。本发明提供的effector基因的另一个应用是根据所述基因序列信息产生特异性的分子标记，包括但不限于SNP (单核苷酸多态性)、SSR(简单序列重复多态性)、RFLP (限制性内切酶长度多态性)、CAP(切割扩增片段多肽)。用这些标记可检测田间立枯丝核菌群体的生理小种及其遗传结构的动态变化，以及该effector基因在田间自然群体中的分布情况；有助于水稻品种的抗病性鉴定和立枯丝核菌小种的鉴定；也有助于抗病品种的合理布局和轮换，以便有效地控制纹枯病的发生。本发明能够进一步提供或应用利用上述DNA片段获得的无相应effector基因功能的转基因菌株，以及用本发明的基因转化的菌株。也可以用有性杂交的方式将本发明的基因转入其它的菌株。本发明的有益效果本发明通过对立枯丝核菌effector基因的克隆及其功能分析，有助于揭示立枯丝核菌小种与水稻品种间特异性互作及其进化的分子机理。在实践上可以根据该基因的结构及其功能设计新型农药的分子靶点；可以将水稻等宿主细胞中该 effector蛋白的受体蛋白基因敲除或突变，以得到持久抗病品种；有助于建立立枯丝核菌自然群体致病性变异的分子检测体系，研究立枯丝核菌effector基因在田间自然群体中的分布情况，揭示立枯丝核菌群体中小种的组成和变异特点；也有助于水稻品种的抗病性鉴定及其合理布局和轮换，以便有效地控制纹枯病的发生。


图1为立枯丝核菌effector基因AG1IA010188的图位克隆示意图；图2为立枯丝核菌effector基因AG1IA010188的PCR检测结果图；图3为立枯丝核菌effector基因AG1IA010188表达蛋白的SDS-PAGE检测结果图；其中，图2中泳道M为分子量标记，依次为5000bp，3000bp, 2000bp, IOOObp， 750bp (加亮带)，500bp, 250bp, IOObp ；泳道1、2为PCR产物；泳道3-6为转化子菌株的PCR
产物，其中6为假阳性。图3中泳道7为分子量标记，大小如图；泳道1、3、5为诱导后的蛋白条带；泳道1、 3为effector蛋白产物；泳道5为空载；2、4、6为未诱导的菌液蛋白条带。
具体实施例方式下面结合实施例，对本发明的具体实施方式
作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。这些实施例除另有说明外，本申请中的所有科技术语都具有与本发明所属领域普通技术人员通常理解相同的含义。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常采用常规条件例如Sambrook等人，分子克隆实验室手册(New York :Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的方法。实施例1 预测的effector基因的克隆AGlIA菌株是由四川农业大学水稻所自行从田间水稻纹枯病发病植株上分离纯化的，为水稻植株上普遍存在的真菌菌株，广泛分布在水稻栽培的地区。(AG1IA菌株已公开发表于四川农业大学，硕士论文，立枯丝核菌AGlIA诱导玉米差异蛋白的分析，作者李芸)在超净工作台下，用镊子挑取少量AGlIA的菌丝，接入50ml PDA培养基中，把菌丝捣碎，280C，200r/m培养两天后，用四层纱布过滤收集菌丝，用液氮研磨提取总RNA。用 oligodT做引物，反转录得到cDNA。根据预测的序列设计引物如下前弓I 物 BamHI 5，GCC GGA TCC CCG GGC CCAGAAGCATTCAAGTAC3，后弓 | 物 Not 15，ATTTGC GGC CGC TTACTTTTGTGTAGCGTCCACAAC3，，以 cDNA为模板克隆得到目的基因， 克隆到的基因如图2。实施例2 :effector基因原核表达载体的构建、转化和表达PCR得到的目的基因电泳检测没有杂带，即可根据TransGen Biotech Peasy-Elkit说明，把目的基因连接到表达载体pEASY_El上，经过测序基因AG1IA010188与预测序列只有个别碱基的差别，碱基序列如SEQ ID NO. 1所示。转化条件与常规大肠杆菌转化条件相同，挑取阳性转化子，37 °C培养至OD值为0. 6后，转入^°C，IPTGlmM诱导7到 11个小时，表达effector蛋白。表达蛋白的SDS-PAGE检测图如图3。实施例3 表达蛋白的致病性检测收集AG1IA010188表达后的菌体超声波破碎得到粗蛋白，破碎过程中注意勿使蛋白变性。选取生长一致的田间水稻叶片，放在内置两层滤纸的灭菌培养皿中保持滤纸湿润以使叶片保湿。用灭菌的牙签在水稻叶片中央打一个小孔，用三层灭菌的0. 5cmX0. 5cm的滤纸片覆盖在小孔上，接种粗蛋白的量为50微升。侵染后的叶片放在洲摄氏度光照培养箱，光照12h，黑暗12h，RH(病情指数)80%。连续数天观察叶片发病情况并拍照，记录病程。侵染后6天对照蛋白侵染的叶片没有肉眼可见的变化，AG1IA010188蛋白产物侵染的叶片小孔周围发黄且孔变大；侵染后7天AG1IA010188蛋白产物侵染的叶片明显比对照蛋白侵染的叶片黄，且局部区域出现黑色；侵染后8天对照蛋白侵染的叶片只是略微发黄，而 AG1IA010188蛋白产物侵染的叶片则大面积发黄、发黑，坏死(P⑶)。实施例4 effector基因的表达特性分析利用RT-PCR技术对收集AG1IA010188表达后的菌体超声波破碎得到粗蛋白，破碎过程中注意勿使蛋白变性(破碎时间5S为宜，功率不超过200W，破碎过程中始终保持样品在冰浴条件下)。选取生长一致的田间水稻叶片，放在内置两层滤纸的灭菌培养皿中保持滤纸湿润以使叶片保湿。用灭菌的牙签在水稻叶片中央打一个小孔，用三层灭菌的 0. 5cmX0. 5cm的滤纸片覆盖在小孔上，接种粗蛋白的量为50微升。侵染后的叶片放在观摄氏度光照培养箱，光照12h，黑暗12h，RH80%。连续数天观察叶片发病情况并拍照，记录病程。基因的表达模式进行了分析。从接种水稻叶片和接种水稻叶片的菌丝提取的总RNA， 反转录得到cDNA后，利用预测序列设计引物(引物序列同实施例1中的引物序列)，均能克隆到目的基因，如图2所示，目的基因的大小与预期完全一致。PCR程序为94°C预变性 4min ；94°C变性 50sec，55°C退火 50sec，72°C延伸 lmin，;35 个循环；72°C后延伸 lOmin。说明该基因为组成型表达的基因。实施例5 :effector基因AG1IA010188基因的应用利用本发明提供的AG1IA010188基因的序列信息，根据该基因的结构及功能设计新型农药的分子靶点；该新型农药的主要成分可以是AG1IA010188基因蛋白产物的结构类似物，可以与AG1IA010188基因蛋白产物竞争性结合到水稻中的靶位点，但却不会使水稻发病的信号通路进一步向下游传递，从而使AG1IA010188基因蛋白产物不能结合到水稻中的靶位点，使发病信号通路阻断在受体蛋白部位。还可以将该基因蛋白产物在水稻中的受体蛋白基因或信号通路中的其它基因沉默或敲除掉，培育抗纹枯病的水稻新品种，使纹枯病菌只能在植株表面形成附着胞或侵染垫，却不能进一步侵入到植株组织内部；或者即使侵入植株组织内部，因为受体蛋白基因或信号通路中的其它基因被沉默或敲除掉而使过敏反应等发病信号通路阻断，使病症减轻并且只能局限在某一小部分区域内而不是发展到整株植株。虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
权利要求
1.一种水稻立枯丝核菌effector基因AG1IA010188，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所不。
2.权利要求1所述基因编码的蛋白。
3.如权利要求2所述的蛋白，其氨基酸序列是1)SEQID No. 2所示的氨基酸序列；或2)SEQ ID No. 2所示的氨基酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个氨基酸且具有同等活性的氨基酸序列。
4.含有权利要求1所述基因的载体和宿主细胞。
5.如权利要求1所述的基因，其特征在于，其功能是通过启动子与转录因子结合来调控的。
6.如权利要求5所述的基因，其特征在于，所述启动子为诱导型启动子或组成型启动子。
7.权利要求1所述基因在设计农药分子靶点中的应用。
8.权利要求1所述基因在建立分子检测体系，检测植物纹枯病发病情况中的应用。
9.权利要求1所述基因在水稻抗病育种中的应用。
10.如权利要求9所述的应用，其特征在于，所述抗病育种是将权利要求1所述基因的蛋白产物在水稻中的受体蛋白基因或信号通路中的其它基因沉默或敲除掉。
全文摘要
本发明提供了一种水稻立枯丝核菌effector基因AG1IA010188，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。对本发明基因的研究，在实践上可以根据该基因的结构及其功能设计新型农药的分子靶点；可以将水稻等宿主细胞中该effector蛋白的受体蛋白基因敲除或突变，以得到持久抗病品种；有助于建立立枯丝核菌自然群体致病性变异的分子检测体系，研究立枯丝核菌effector基因在田间自然群体中的分布情况，揭示立枯丝核菌群体中小种的组成和变异特点；也有助于水稻品种的抗病性鉴定及其合理布局和轮换，以便有效地控制纹枯病的发生。
文档编号C12Q1/68GK102517298SQ20111043482
公开日2012年6月27日 申请日期2011年12月22日 优先权日2011年12月22日
发明者刘尧, 张丹华, 朱军, 李双成, 李平, 王世全, 邓其明, 郑爱萍 申请人:四川农业大学