专利名称：一种删除选择标记基因的百合转基因方法
技术领域：
本发明属于植物基因工程领域，涉及百合的转基因方法，特别涉及一种删除选择标记基因的百合转基因方法。
背景技术：
百合是世界著名切花之一，具有很高的观赏价值，一直深受人们喜爱。虽然每年有大量的百合新品种推向市场，但长期以来其品质的改良都是依赖于传统的遗传育种方法。 而传统育种技术上的局限性，有时会制约品种性状的改良以及新品种的选育，在一定程度上严重制约百合商品化生产，因此寻求新的育种途径与之相结合才是解决问题的关键。随着生物技术的发展，转基因技术通过建立可转化的受体系统，导入外源基因来改良百合品质无疑具有重要意义。目前，已报道的百合遗传转化的目的基因主要有四类报告基因、抗病基因、抗虫基因、抗逆基因。其中关于抗逆基因的研究报道较少，目前仅见一篇国内报道。陈莉O007) 将耐热基因Mn-SOD导入麝香百合中，经过高温胁迫处理，得到耐热性提高的转基因百合， 关于百合抗旱、耐盐基因工程的研究还未见成功报道。关于百合遗传转化方法主要有三种农杆菌介导转化法、基因枪法和花粉管通道法。其中采用基因枪法进行百合遗传转化取得了一定的进展，但是关于基因枪法共转化的研究在百合上还未见成功报道。Cre/loxp系统属于位点特异性重组系统，目前已有很多研究利用此系统进行植物转基因，并进一步将标记基因删除。目前，在百合上尚未见应用此系统的研究报道。rd29A是诱导型启动子中应用最广泛的启动子，已被许多学者克隆并应用于转基因植物的研究，目前，还未见应用rd29A启动子调控Cre/loxp系统进行标记基因删除试验的成功报道。冯彪Q008)认为愈伤诱导过程中会发生原有种性的改变，同时愈伤继代2 3次后，很难长时间维持其原有的特性，玻璃化和变异现象非常严重。Watad等(1998)以愈伤为外植体进行基因枪法遗传转化过程中获得0. 17%的单基因的转化效率。师守国等O010)在以鳞片为外植体进行百合基因枪转化时，获得了高达 1.5%的转化效率。Watad等(1998)以愈伤为外植体进行基因枪法遗传转化过程中，以瞬时表达率作为衡量转化效率的标准，得出最佳轰击距离为6em。师守国等Q010)以兰州百合鳞片作为基因枪轰击材料，以瞬时表达率作为衡量转化效率的标准，得出最佳轰击距离为6cm时，获得最高的转化效率。Arumugam等^)07)应用Cre/loxP系统在芥菜转基因过程中，通过含有Cre和 loxP-npt II的植株杂交后产生F1代无选择标记的植株。Kopertekh等(Kopertekh L， Schulze K, Frolov A, etal. Cre—mediated seed-specific transgene excision in tobacco [J], Plant Mol Biol, 2010, 72 :597-605.)运用种子特异性启动子诱导Cre基因表达，Cre基因识别两个Ioxp位点，从而删除介于两个Ioxp位点间的标记基因，获得无选择标记的转基因烟草。Moravcikova等Q008)用拟南芥种子特异储藏蛋白cruciferin C作为Cre/loxP系统自我切除的诱导启动子，得到了安全转基因烟草植株。他们在研究中还发现，在烟草Ttl和T1代植株中检测Cre/loxP自我切除情况时删除效率有所增加，Ttl代植株的删除效率仅为10. 2%，经过一年的培养后，T1代植株检测后发现删除效率竟然达到了 40%， 这种通过连续多代杂交或者自交可能实现高效率的删除。白斌等Q004)的研究得出4°C和10°C低温条件下均可诱导rd29A表达。石君 (2009)认为rd29A在4°C条件下经过不同时间诱导，其表达效率不同，其中以诱导1 表达
效率最高。Wang等人Q005)认为利用诱导Cre/lLoxP系统删除体系缺乏严格的控制，导致转化效率降低。这可能是因为他们没有找到诱导启动子表达的最佳条件，进而导致删除效率低下。^iang等Q009)应用CLV系统，采用β-雌二醇诱导，获得了安全抗逆转基因番茄， 但是没有对删除效率进行报道。
发明内容
为了解决上述问题，本发明提供一种删除选择标记基因的百合转基因方法。本发明提供的删除选择标记基因的百合转基因方法，其为将分别携带目标基因和 Cre/loxP的植物表达载体，通过基因枪共转化百合，诱导共转化株系的Cre基因表达，删除位于两个同向IoxP位点间的选择标记基因，分化出再生植物，获得无选择标记基因的转基因株系。在本发明的一个实施方案中，所述的方法包括如下步骤1)将百合鳞片表面灭菌后接种到分化培养基中诱导百合鳞片直接分化出小鳞茎；2)将步骤1)分化的小鳞片基部接种至分化培养基上进行预培养，预培养后进行基因枪轰击，轰击后进行恢复培养；3)将恢复培养后的小鳞片基部接种至筛选培养基中进行筛选培养；4)将获得的转化苗的小鳞片基部在筛选培养基中进行低温处理后转入常温培养， 分化出无选择标记基因的转基因再生株系。其中，步骤3)中所述的筛选培养基优选为含有50 120mg · Γ1卡那霉素和5 IOmg · L—1草丁膦的分化培养基。其中，所述的分化培养基优选为含有0. 1 0. 3mg化―1的ΝΑΑ，0. 005 0. Olmg化一1 的TDZ和3wt%的蔗糖的MS固体培养基，最优选为为含有0. 2mg · L—1的NAA，0. 005mg · L—1 的TDZ和3wt%的蔗糖的MS固体培养基。其中，步骤2)所述的预培养为黑暗培养优选为2 4d，最优选为2d，所述的恢复培养优选为黑暗培养3 5天，最优选为3d，基因枪的轰击距离优选为6 9cm，最优选为 9cm0在本发明的一个实施方案中，所述的筛选培养为将轰击后的小鳞片在筛选培养基上进行连续7次筛选，每隔15 20d更换一次培养基，前3次筛选培养基的卡那霉素浓度为80mg · L—1，后4次筛选培养基的卡那霉素浓度为120mg · L—1。
本发明中，Cre基因由诱导型启动子启动表达，优选为rc^9A。本发明优选通过4°C 低温处理12小时，从而诱导Cre基因表达，达到删除选择标记基因的目的，可获得无选择标记基因的转基因株系。本发明的有益效果1)本发明以百合鳞片作为基因枪法遗传转化受体材料，通过诱导，使鳞片直接诱导分化成苗，避免了愈伤诱导过程中发生原有种性的改变，同时也避免了多次继代培养后， 玻璃化和变异非常严重的现象。幻本发明获得‘索邦’高效再生培养基配方，在MS基本培养基中添加NAA 0. 2mg-r1, TDZ 0.00511^*171，蔗糖3衬％，琼脂0.6%，pH = 5. 8，使百合小鳞片基部具有高达97. 80士 1. 91%的分化率。3)本发明获得百合小鳞片基部遗传转化的最适参数设置为预培养2d，轰击距离 9cm，恢复培养3d，为百合基因枪法遗传转化提供参考和依据。4)本发明获得基因枪法共转化百合植株，通过4°C低温诱导1 将标记基因删除， 最终获得安全转基因植株，消除人们对转基因植物生物安全性问题的疑虑，这对转基因技术的发展具有重要的科学价值和现实意义。
图1为本发明百合鳞片在培养基上直接再生小植株的情况。图2为本发明百合小植株增重情况。图3为本发明百合小鳞片基部预培养情况。图4 为载体质粒 Hisb-rc^gA-Cre/lox 图谱。图5为载体质粒pBPC-P5CS-FU9A图谱。图6为本发明百合鳞片基因枪轰击后在筛选培养基上筛选3次后的情况。图7为本发明百合鳞片基因枪轰击后在筛选培养基上筛选7次后的情况。图8为本发明筛选的抗性植株扩繁情况。图9所示为共转化株系的PCR检测。A :bar基因PCR检测；B =Cre基因PCR检测； M :DL2000 Marker ；1 阳性对照；2 阴性对照；3 :ddH20对照；4_5 抗性植株。图10所示为共转化植株的bar基因(A)和Cre基因(B)的Southern检测。A :bar 基因检测；B :Cre基因检测；1 阳性对照；2 阴性对照；3 单拷贝转基因植株；4 双拷贝转基因植株。图IlA所示为4°C处理12h和24h后标记基因删除情况PCR检测。M :DL2000 ； 1 阳性对照；2 转基因未处理对照；3 阴性对照；4 :ddH20对照；5-9 :4°C处理12h ；10-14 :4°C 处理24h。图IlB所示为4°C处理36h和48h后标记基因删除情况PCR检测。M :DL2000 ； 1 阳性对照；2 转基因未处理对照；3 阴性对照；4 :ddH20对照；5-9 :4°C处理36h ；10-14 :4°C 处理4 ι。图IlC所示为4°C处理60h和72h后标记基因删除情况PCR检测。M :DL2000 ； 1 阳性对照；2 转基因未处理对照；3 阴性对照；4 :ddH20对照；5-9 :4°C处理60h ；10-14 :4°C 处理7池。
图IlD所示为不同处理时间的标记基因删除效率。图12所示为4°C处理12h后Cre基因Southern检测。其中1、4和5泳道Cre基因已经被删除，2和3泳道Cre基因仍然存在，Cre基因删除效率为60%。图13所示为本发明安全转基因植株在不含抗生素的培养基上生长情况。图14所示为本发明安全转基因植株在含有抗生素的培养基上生长情况。
具体实施例方式以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。实施例1最适分化培养基的确定(1)配制培养基在MS基本培养基中+蔗糖3% +琼脂0.6%，并添加NAA(0. 1、 0. 2 和 0. 3mg · L-1) +TDZ (0. 002,0. 005 和 0. Olmg · Γ1)不同组合共 9 种培养基，pH = 5. 8， 用IOOml锥形瓶盛装，每个锥形瓶中培养基的体积大约为30ml ；(2)剥取健壮、无病斑、光亮的完整百合‘索邦’鳞片，用流水冲洗30min以上，然后在无菌的条件下用75%酒精浸泡30s，无菌水冲洗3次，再用0. 的升汞溶液浸泡10 15min,无菌水冲洗3次，每次5min ；(3)无菌条件下在铺有滤纸的盘子上用手术刀切取约1. OcmX 1. 5cm大小的鳞片， 用镊子将切割的鳞片近轴面向上接种到MS基本培养基中+蔗糖3% +琼脂0. 6%，添加NAA 0. 2mg · L-1和6-BAO. 5mg · L-1的培养基上，pH = 5. 8，每个锥形瓶中接种3 4个鳞片，培养期间每隔2个月更换一次培养基，待植株分化成苗并长出小鳞茎后待用。(4)剥取(3)所得百合幼苗的小鳞片并切取基部约3_5mm大小的小鳞片，用镊子将切割的鳞片基部近轴面向上接种到表1所列的培养基上，每个锥形瓶中接种3 4个，培养期间每隔2个月更换一次培养基统计植株诱导率，结果如表1所示。表1不同处理对‘索邦’小鳞片基部植株诱导率的影响
权利要求
1.一种删除选择标记基因的百合转基因方法，其特征在于，将分别携带目标基因和 Cre/loxP的植物表达载体，通过基因枪共转化百合，诱导共转化株系的Cre基因表达，删除位于两个同向IoxP位点间的选择标记基因，分化出再生植物，获得无选择标记基因的转基因株系。
2.根据权利要求1所述的百合转基因方法，其特征在于，包括如下步骤1)将百合鳞片表面灭菌后接种到分化培养基中诱导百合鳞片直接分化出小鳞茎；2)将步骤1)分化的小鳞片基部接种至分化培养基上进行预培养，预培养后进行基因枪轰击，轰击后进行恢复培养；3)将恢复培养后的小鳞片基部接种至筛选培养基中进行筛选培养；4)将获得的转化苗的小鳞片基部在筛选培养基中进行低温诱导后转入常温培养，分化出无选择标记基因的转基因再生株系。
3.根据权利要求2所述的百合转基因方法，其特征在于，步骤幻中所述的筛选培养基为含有50 120mg · L—1卡那霉素和5 IOmg · L—1草丁膦的分化培养基。
4.根据权利要求2或3所述的百合转基因方法，其特征在于，所述的分化培养基为含有 0. 1 0. 3mg · Γ1的NAA，0. 005 0. Olmg · Γ1的TDZ和3wt%的蔗糖的MS固体培养基。
5.根据权利要求4所述的百合转基因方法，其特征在于，所述的分化培养基为含有 0. 2mg ·厂1的NAA, 0. 005mg · Γ1的TDZ和蔗糖的MS固体培养基。
6.根据权利要求2所述的百合转基因方法，其特征在于，步骤2)所述的预培养为黑暗培养2 4d，所述的恢复培养为黑暗培养3 5d，基因枪的轰击距离为6 9cm。
7.根据权利要求6所述的百合转基因方法，其特征在于，步骤幻所述的预培养时间为 2d，所述的恢复培养时间为3d，基因枪的轰击距离为9cm。
8.根据权利要求2所述的百合转基因方法，其特征在于，所述的筛选培养为将轰击后的小鳞片在筛选培养基上进行连续7次筛选，每隔15 20d更换一次培养基，前3次筛选培养基的卡那霉素浓度为80mg · L—1，后4次筛选培养基的卡那霉素浓度为120mg · L—1。
9.根据权利要求2所述的百合转基因方法，其特征在于，步骤4)中所述的低温诱导为 4°C处理12小时。
10.根据权利要求1或2所述的百合转基因方法，其特征在于，诱导Cre基因表达的启动子为rc^9A，所述的目标基因为P5CS-F129A。
全文摘要
本发明公开了一种删除选择标记基因的百合转基因方法，其为将分别携带目标基因和Cre/loxP的植物表达载体，通过基因枪共转化百合，诱导共转化株系的Cre基因表达，删除位于两个同向loxP位点间的选择标记基因，分化出再生植物，获得无选择标记基因的转基因株系。本发明获得基因枪法共转化百合植株，通过4℃低温诱导12h将标记基因删除，最终获得安全转基因植株，消除人们对转基因植物生物安全性问题的疑虑。
文档编号C12N15/82GK102559741SQ20111043588
公开日2012年7月11日 申请日期2011年12月22日 优先权日2011年12月22日
发明者何恒斌, 刘燕, 张秀海, 张铭芳, 李双, 杜运鹏, 袁霖, 贾桂霞 申请人:北京林业大学