专利名称：去除人同源性的肺炎链球菌表面蛋白a、纯化方法及用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种肺炎链球菌表面蛋白A的部分序列替换的去除人同源性的肺炎链球菌表面蛋白A，表达，纯化方法及用途。
背景描述
肺炎球菌(Str印tococcus pneumoniae)，又称肺炎链球菌，是有荚膜的革兰氏阳性双球菌。多糖荚膜是主要的毒力因子，根据荚膜的组成差异，已鉴定出约90个不同的肺炎球菌血清型。肺炎球菌可引起肺炎、脑膜炎、败血症、中耳炎等疾病，在2岁以下婴幼儿和老年人中发病率最高，已成为世界范围内引起死亡的重要原因之一。据WHO 2005年估计， 全球每年有160万人死于各类肺炎球菌疾病，其中包括70-100万5岁以下的儿童，多数死亡病例发生在发展中国家。在我国，肺炎也是导致婴幼儿死亡的头号杀手之一。HIV感染以及与免疫缺陷相关的其他疾病大大增加了感染肺炎球菌疾病的可能性。日益增加的肺炎球菌耐药性问题也使开发疫苗以控制肺炎球菌性疾病变得更为迫切。当前，甲型Hmi流感在全球肆虐，由其引发的呼吸道并发感染肺炎往往导致极大的死亡率，各国政府在大力投入开发该流感疫苗的同时倡导接种肺炎球菌疫苗。为了降低肺炎球菌感染与携带率，保障人民健康，预防与遏制疾病蔓延，接种肺炎球菌疫苗非常必要。WHO在2007年建议发展中国家将肺炎球菌结合疫苗纳入国家免疫计划。
目前市场上供应的肺炎球菌疫苗产品主要为多糖疫苗和结合疫苗。其中23价肺炎球菌荚膜多糖疫苗的抗原为胸腺非依赖型，对婴幼儿及老年人的免疫效果弱，主要用于有肺炎球菌性疾病高风险的大龄儿童和成年人，不能用于2岁以下的儿童。蛋白多糖结合疫苗如7价肺炎结合疫苗(PCV-7)，在各年龄组的免疫原性都很强，但目前只批准用于5岁以下儿童，且其只覆盖的7个血清型，仅占亚洲地区致病血清型的55%，使得应用过程中可能出现血清型的替换。目前PCV-7的国内市场价860元/剂，2岁以下幼儿需接种3-4次， 价格较高。国内外肺炎疫苗市场巨大，开发新型高效且低成本的疫苗势在必行，国内外正在加紧研制重组蛋白疫苗及DNA新型疫苗。重组蛋白疫苗的开发主要集中在I^pA、PsaA和溶血素等重要候选蛋白上，其中I3SpA是最具有潜力且研究最多的候选蛋白之一。
PspA，肺炎球菌表面蛋白A，广泛存在于90种肺炎球菌血清型中，不同血清型的肺炎球菌I^spA蛋白分子质量不同，介于60 lOOKa。I^spA分子可分为两大家族，五个亚群 (clade)。I^spA主要由五个域组成从N端到C端依次分为信号肽、超螺旋区、组氨酸富集区、胆碱结合区和C端尾巴。超螺旋区是一个重要的抗原决定区域。单克隆抗体识别的位点在N端，该区具有高度可变性。在不同血清型中，PspA的C端疏水区具有保守结构。I^pA 主要作用是与乳铁蛋白结合使之丧失功能并抑制补体活化，降低Ob在肺炎球菌表面的沉淀从而干扰补体介导的吞噬调理作用。该蛋白具有高效的免疫原性，在小鼠中研究证明， I3SpA蛋白可以激发对肺炎球菌感染的保护性免疫反应。
Sanofi Pasteur (赛诺菲-巴斯德)和 University of Alabama at Birmingham(UAB)合作研发I^spA疫苗，并完成了两个疫苗产品的临床一期实验，结果证明有非常好的保护作用。但在采用PspA(RX-l亚型)作为保护性抗原进行试验时，同时也在部分试验者身上观察到抗人体心肌肌球蛋白的抗体短暂升高。抗心肌蛋白抗体在人体中正常存在，目前尚且缺乏显示抗心肌肌球蛋白抗体可导致疾病的临床证据，但是仍存在安全隐患，对I3SpA疫苗的应用推广带来巨大障碍，降低I^spA和心肌蛋白交叉反应非常必要。发明内容
本发明的目的是克服野生型肺炎表面蛋白A作为抗原的不足，提供一种去除人同源性的肺炎链球菌表面蛋白A。
本发明的第二个目的是提供一种表达去除人同源性的肺炎链球菌表面蛋白A的用途。
本发明的第三个目的是提供一种表达去除人同源性的肺炎链球菌表面蛋白A的基因。
本发明的第四个目的是提供一种含有表达人同源性的肺炎链球菌表面蛋白A基因重组载体。
本发明的第五个目的是提供一种含有人同源性的肺炎链球菌表面蛋白A基因重组载体的菌株。
本发明的第六个目的是提供一种去除人同源性的肺炎链球菌表面蛋白A的纯化方法。
本发明的技术方案概述如下
去除人同源性的肺炎链球菌表面蛋白A，是序列表SEQ ID No. 1所示的氨基酸序列或是序列表SEQ ID No. 2所示的氨基酸序列。
上述去除人同源性的肺炎链球菌表面蛋白A在制备预防肺炎链球菌感染的疫苗中的应用。
表达去除人同源性的肺炎链球菌表面蛋白A的基因，是所述表达序列表SEQ ID No. 1所示的氨基酸序列的基因用序列表SEQ ID No. 3所示；所述表达序列表SEQ ID No. 2 所示的氨基酸序列的基因用序列表SEQ ID No. 4所示。
含有表达去除人同源性的肺炎链球菌表面蛋白A基因重组载体，将序列表SEQ ID No. 3所示基因插入到表达载体PET9a中得到重组载体1 ；或将序列表SEQ ID No. 4所示基因插入到表达载体PET9a中得到重组载体2。
含有去除人同源性的肺炎链球菌表面蛋白A基因重组载体的菌株，将所述重组载体1导入到大肠杆菌E. Coli BL21中或将所述重组载体2导入到大肠杆菌E. Coli BL21中得到含有去除人同源性的肺炎链球菌表面蛋白A基因重组载体的菌株。
去除人同源性的肺炎链球菌表面蛋白A的纯化方法，包括如下步骤
(1)发酵含有去除人同源性的肺炎链球菌表面蛋白A基因重组载体的菌株；
(2)将菌株发酵液7200rpm离心15分钟，收集沉淀，用pH = 8. 0的20毫摩尔/升 tris重悬沉淀，勻浆细胞破碎，8000rpm离心30分钟，取上清液；
(3)批次吸附将Q sepharose fast flow与步骤(2)获得的上清液混合搅拌吸附2小时，缓冲体系为pH = 8. 0的20毫摩尔/升tris ；以3_5倍所述步骤(2)获得的上清液体积的pH = 5. 4的20毫摩尔/升柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液将吸附产物洗脱，以3-5 倍样品体积的含350-450毫摩尔/升的氯化钠的pH = 5. 4的20毫摩尔/升的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液洗脱，得到Elute产物；
(4)将Elute产物用pH = 5. 4的20毫摩尔/升柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液超滤脱盐处理；
(5) Q柱准备以3-5倍的柱体积的pH = 5. 4的20毫摩尔/升柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液平衡Q柱；
(6)上样将步骤(4)得到的产物上样Q柱；
(7)以3-5倍柱体积的含有50-150毫摩尔氯化钠的pH = 5. 4的20毫摩尔/升柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液wash洗脱，再用3-5倍柱体积的含有160-300毫摩尔/升氯化钠的pH = 5. 4的20毫摩尔/升柠檬酸柠-檬酸钠缓冲液Elute洗脱；
(8)将步骤(7)获得的产物以PH = 4.0的20毫摩尔/升柠檬酸_柠檬酸钠缓冲液超滤脱盐处理；
(9) SP柱准备以3-5倍的柱体积的pH = 4. 0的20毫摩尔/升柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液平衡SP柱；
(10)上样将步骤⑶获得的产物上样SP柱；
(11)以3-5倍柱体积的含有250-350毫摩尔/升氯化钠的pH = 4. 0的20毫摩尔/升柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液wash洗脱，再用3-5倍柱体积的含有450-550毫摩尔/ 升氯化钠的pH = 4. 0的20毫摩尔/升柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液Elute洗脱；得到纯度 90%以上的去除人同源性的肺炎链球菌表面蛋白。
本发明的优点
一种去除人同源性的肺炎链球菌表面蛋白A具有不弱于野生型肺炎链球菌表面蛋白A(RX-1亚型)的抗原性和保护性，而降低了肺炎链球菌表面蛋白A(RX-1亚型)和人体心肌肌球蛋白的同源性。使其安全的应用于疫苗的开发。
图1为来源于肺炎不同菌株的16个氨基酸，去取代野生型肺炎表面蛋白(RX-1亚型)序列中与人心肌肌球蛋白具有高度同源性的16个氨基酸，形成的新的肺炎表面蛋白 (RX-1亚型)的突变株。而后将突变株及野生型自身序列，经I^irCOil2类似软件分析，其 16个氨基酸所形成α -螺旋结构的可能性，对于形成的结构进行比对，其分析图谱。
Α:野生型肺炎表面蛋白PspA-RX-I，B 肺炎表面蛋白PspA-RX-l_BG9739 (SEQ ID No. 1)，C 肺炎表面蛋白 PspA-RX-l-BG3^6 (SEQ ID No. 2)，D 肺炎表面蛋白 PspA-RX-1-self。
图 2为肺炎表面蛋白 A(PspA-RX-I， PspA-RX-l-BG9739(Mutantl)， PspA-RX-l-BG3296 (Mutant2))纯化的 SDS-PAGE 电泳图。
从右向左1为标准蛋白分子量；2为I3SpA-RX-I ；3为 ^ρΑ-ΚΧ-1_Β69739 ；4为 PspA-RX-l-BG3296
图 3 为小鼠免疫肺炎表面蛋白 PspA-RX-I，PspA-RX-l-BG9739，PspA-RX-l-BG3^6 而产生的抗体水平。
图 4 为免疫肺炎表面蛋白 PspA-RX-I，PspA-RX-l-BG9739，PspA-RX-l-BG3^6 的小鼠，经肺炎链球菌毒攻试验的保护率。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明。
实施例1
①，通过序列同源性软件分析确定了 PspA-RX-I亚型蛋白中16个氨基酸序列与人心肌肌球蛋白一段序列具有高度同源性，这样若使用I^pA-RX-I作为免疫性抗原的话，存在免疫安全隐患。这16个氨基酸序列为EAKAKLEEAEKKATEA
②，采用Paircoil2类似软件分析这16个氨基酸序列的结构，并从其他亚型的 I^spA分子中挑选出不同的16个氨基酸片段对野生型的PspA-RX-I的16个氨基酸序列进行替换，形成新的 PspA-RX-I 序列，即 PspA-RX-l-BG9739，PspA-RX-l-BG3296,再通过分子二级结构的模拟，将模拟的结构与野生型PspA-RX-I的结构对比预测，我们选择了相对于野生型I3SpA-RX-I结构变化最小的两个I3SpA-RX-I的突变株Ι^ρΑ-ΚΧ-1-Β69739， PspA-RX-l-BG3296
③，PspA-RX-I野生型序列中的16个氨基酸EAKAKLEEAEKKATEA，分别被 EAEKKVTEARQKLDAE (来源于肺炎链球菌BG9739)和EAI^QNKLAAKKAELAKK (来源于肺炎链球菌 BG3296)取代。
得到去除人同源性的肺炎链球菌表面蛋白A，分别用序列表SEQ ID No. 1所示的氨基酸序列或用序列表SEQ ID No. 2所示的氨基酸序列。
实施例2
表达去除人同源性的肺炎链球菌表面蛋白A的基因，是所述表达序列表SEQ ID No. 1所示的氨基酸序列的基因用序列表SEQ ID No. 3所示；所述表达序列表SEQ ID No. 2 所示的氨基酸序列的基因用序列表SEQ ID No. 4所示。
SEQ ID No. 3 所示基因是 PspA-RX_l_BG9739 基因用 DNA2. 0 优化了的 DNA 序列；
SEQ ID No. 4 所示基因是 PspA_RX-l_BG3^6 基因用 DNA2. 0 优化了的 DNA 序列。
实施例3
含有表达去除人同源性的肺炎链球菌表面蛋白A基因重组载体，将序列表SEQ ID No. 3所示基因插入到表达载体PET9a中得到重组载体1 ；或将序列表SEQ ID No. 4所示基因插入到表达载体PET9a中得到重组载体2。
实施例4
含有去除人同源性的肺炎链球菌表面蛋白A基因重组载体的菌株，将所述重组载体1导入到大肠杆菌E. Coli BL21中或将所述重组载体2导入到大肠杆菌E. Coli BL21中得到含有去除人同源性的肺炎链球菌表面蛋白A基因重组载体的菌株。
在BL21大肠杆菌中重组表达。在加入IPTG后，目的蛋白表达在细胞质中。
实施例5
去除人同源性的肺炎链球菌表面蛋白A的纯化方法(SEQ ID No. 1，SEQ ID No. 2 都是分别采用本实施例的方法纯化)，包括如下步骤
(1)发酵实施例4制备的含有人同源性的肺炎链球菌表面蛋白A基因重组载体的菌株；
(2)将所述菌株发酵液7200rpm离心15分钟，收集沉淀，用pH = 8. 0的20毫摩尔/升tris重悬沉淀，勻浆细胞破碎，8000rpm离心30分钟，取上清液；
(3)批次吸附将Q sepharose fast flow与步骤(2)获得的上清液混合搅拌吸附2小时，缓冲体系为pH = 8. 0的20毫摩尔/升tris ；以4倍所述步骤(2)获得的上清液体积的pH = 5. 4的20毫摩尔/升柠檬酸柠-檬酸钠缓冲液将吸附产物洗脱，以4倍样品体积的含400毫摩尔/升氯化钠的pH = 5. 4的20毫摩尔/升柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液洗脱，得到Elute产物；
(4)将Elute产物用pH = 5. 4的20毫摩尔/升柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液超滤脱盐处理；
(5) Q柱准备以4倍的柱体积的pH = 5. 4的20毫摩尔/升柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液平衡Q柱；
(6)上样将步骤(4)得到的产物上样Q柱；
(7)以3-5倍柱体积的含有100毫摩尔氯化钠的pH = 5. 4的20毫摩尔/升柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液wash洗脱，再用4倍柱体积的含有250毫摩尔/升氯化钠的pH = 5. 4的20毫摩尔/升柠檬酸柠-檬酸钠缓冲液Elute洗脱；
(8)将步骤(7)获得的产物以PH = 4.0的20毫摩尔/升柠檬酸_柠檬酸钠缓冲液超滤脱盐处理；
(9) SP柱准备以4倍的柱体积的pH = 4. 0的20毫摩尔/升柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液平衡SP柱；
(10)上样将步骤⑶获得的产物上样SP柱；
(11)以4倍柱体积的含有300毫摩尔/升氯化钠的pH = 4. 0的20毫摩尔/升柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液wash洗脱，再用4倍柱体积的含有500毫摩尔/升氯化钠的pH =4. 0的20毫摩尔/升柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液Elute洗脱；得到纯度90%以上的去除人同源性的肺炎链球菌表面蛋白。(图2)。
实施例6 将 PspA-RX-1，PspA-RX+BG9739 (SEQ ID No. 1)禾口 PspA-RX-l-BG3296 (SEQ ID No. 2)各50ug，对小鼠进行免疫。0，14天各免疫两次。用磷酸铝佐剂最为阴性对照。在28天采血进行抗体测量，并用500CFU的肺炎链球菌进行静脉注射。监测小鼠的存活能力。其抗体水平图3。该数据显示，用PspA-RX-l-BG9739和 PspA-RX-l-BG3296进行免疫，可以产生Anti-RX-I的抗体，其水平在统计上不低于用野生型RX-I抗原进行免疫的水平。
小鼠存活的天数为图4所示。显示出Mutantl和Mutant 2具有和RX-1野生型蛋白相同的保护力。而磷酸铝佐剂不具有保护力。
我们在I^pA-RX-I亚型蛋白中发现了一个16个氨基酸长度的多肽片段。其序列为EAKAKLEEAEKKATEA。该序列和人的心肌肌球蛋白的序列有高度相似。
本发明针对野生型PspA-RX-I抗原决定簇与人体心肌肌球蛋白的具有高度同源性的16个氨基酸在保证结构变化影响最小的情况下进行氨基酸替换。新生产的两个分子具有不弱于野生型I3SpA-RX-I的抗原性和保护性，而降低了 PspA-RX-I和人蛋白的同源性。 使其安全的应用于疫苗的开发。
我们从其他亚型的I^spA分子中挑选出不同的16个氨基酸片段进行分子二级结构的模拟(采用Paircoil2类似软件，图1)。对比预测的结果，我们选择了结构变化最小的两个PspA-RXl的突变株。其中PspA野生型序列中的16个氨基酸EAKAKLEEAEKKATEA，分别被EAEKKVTEARQKLDAE (来源于肺炎链球菌BG9739)和EAI^QNKLAAKKAELAKK (来源于肺炎链球菌BG3^6)取代。
我们通过与UAB 大学合作，以 PspA-RX-1, PspA_RX-l_BG9739 (SEQ ID No. 1)和 PspA-RX-l-BG3296 (SEQ ID No. 2)进行动物免疫性试验，发现替换16个氨基酸以后形成的两个突变 PspA-RX-l-BG9739(SEQ ID No. 1)和 PspA-RX-l_BG3296 (SEQ ID No. 2)与野生型 PspA-RX-I具有相同的毒攻保护性
实施例7
去除人同源性的肺炎链球菌表面蛋白A的纯化方法，包括如下步骤
(1)发酵实施例4制备的含有人同源性的肺炎链球菌表面蛋白A基因重组载体的菌株；
(2)将所述菌株发酵液7200rpm离心15分钟，收集沉淀，用pH = 8. 0的20毫摩尔 /升tris重悬沉淀，勻浆细胞破碎，8000rpm离心30分钟，取上清液；
(3)批次吸附将Q sepharose fast flow与步骤⑵获得的上清液混合搅拌吸附2小时，缓冲体系为pH = 8. 0的20毫摩尔/升tris ；以3倍所述步骤(2)获得的上清液体积的pH = 5. 4的20毫摩尔/升柠檬酸柠-檬酸钠缓冲液将吸附产物洗脱，以3倍样品体积的含350毫摩尔/升氯化钠的pH = 5. 4的20毫摩尔/升柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液洗脱，得到Elute产物；
(4)将Elute产物用pH = 5. 4的20毫摩尔/升柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液超滤脱盐处理；
(5) Q柱准备以3倍的柱体积的pH = 5. 4的20毫摩尔/升柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液平衡Q柱；
(6)上样将步骤(4)得到的产物上样Q柱；
(7)以3倍柱体积的含有50毫摩尔氯化钠的pH = 5. 4的20毫摩尔/升柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液wash洗脱，再用3倍柱体积的含有160毫摩尔/升氯化钠的pH = 5. 4的20 毫摩尔/升柠檬酸柠-檬酸钠缓冲液Elute洗脱；
(8)将步骤(7)获得的产物以pH = 4. 0的20毫摩尔/升柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液超滤脱盐处理；
(9) SP柱准备以3倍的柱体积的pH = 4. 0的20毫摩尔/升柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液平衡SP柱；
(10)上样将步骤⑶获得的产物上样SP柱；
(11)以3倍柱体积的含有250毫摩尔/升氯化钠的pH = 4. 0的20毫摩尔/升柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液wash洗脱，再用3倍柱体积的含有450毫摩尔/升氯化钠的pH = 4. 0的20毫摩尔/升柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液Elute洗脱；得到纯度90%以上的去除人同源性的肺炎链球菌表面蛋白。
实施例8
去除人同源性的肺炎链球菌表面蛋白A的纯化方法，包括如下步骤
(1)发酵实施例4制备的含有人同源性的肺炎链球菌表面蛋白A基因重组载体的菌株；
(2)将所述菌株发酵液7200rpm离心15分钟，收集沉淀，用pH = 8. 0的20毫摩尔 /升tris重悬沉淀，勻浆细胞破碎，8000rpm离心30分钟，取上清液；
(3)批次吸附将Q sepharose fast flow与步骤(2)获得的上清液混合搅拌吸附2小时，缓冲体系为pH = 8. 0的20毫摩尔/升tris ；以5倍所述步骤(2)获得的上清液体积的pH = 5. 4的20毫摩尔/升柠檬酸柠-檬酸钠缓冲液将吸附产物洗脱，以5倍样品体积的含450毫摩尔/升氯化钠的pH = 5. 4的20毫摩尔/升柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液洗脱，得到Elute产物；
(4)将Elute产物用pH = 5. 4的20毫摩尔/升柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液超滤脱盐处理；
(5) Q柱准备以5倍的柱体积的pH = 5. 4的20毫摩尔/升柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液平衡Q柱；
(6)上样将步骤(4)得到的产物上样Q柱；
(7)以5倍柱体积的含有150毫摩尔氯化钠的pH = 5. 4的20毫摩尔/升柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液wash洗脱，再用5倍柱体积的含有300毫摩尔/升氯化钠的pH = 5. 4 的20毫摩尔/升柠檬酸柠-檬酸钠缓冲液Elute洗脱；
(8)将步骤(7)获得的产物以pH = 4. 0的20毫摩尔/升柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液超滤脱盐处理；
(9) SP柱准备以5倍的柱体积的pH = 4. 0的20毫摩尔/升柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液平衡SP柱；
(10)上样将步骤⑶获得的产物上样SP柱；
(11)以5倍柱体积的含有350毫摩尔/升氯化钠的pH = 4. 0的20毫摩尔/升柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液wash洗脱，再用5倍柱体积的含有550毫摩尔/升氯化钠的pH = 4. 0的20毫摩尔/升柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液Elute洗脱；得到纯度90%以上的去除人同源性的肺炎链球菌表面蛋白。
权利要求
1.去除人同源性的肺炎链球菌表面蛋白A，其特征是所述去除人同源性的肺炎链球菌表面蛋白A是序列表SEQ ID No. 1所示的氨基酸序列或是序列表SEQ ID No. 2所示的氨基酸序列。
2.权利要求1的去除人同源性的肺炎链球菌表面蛋白A在制备预防肺炎链球菌感染的疫苗的应用。
3.表达权利要求1所述去除人同源性的肺炎链球菌表面蛋白A的基因，其特征是所述表达序列表SEQ ID No. 1所示的氨基酸序列的基因用序列表SEQ ID No. 3所示；所述表达序列表SEQ ID No. 2所示的氨基酸序列的基因用序列表SEQ ID No. 4所示。
4.含有表达人同源性的肺炎链球菌表面蛋白A基因重组载体，其特征是将序列表SEQ ID No. 3所示基因插入到表达载体PET9a中得到重组载体1 ；或将序列表SEQ ID No. 4所示基因插入到表达载体PET9a中得到重组载体2。
5.含有人同源性的肺炎链球菌表面蛋白A基因重组载体的菌株，其特征是将所述重组载体1导入到大肠杆菌E. Coli BL21中或将所述重组载体2导入到大肠杆菌E. Coli BL21 中得到含有人同源性的肺炎链球菌表面蛋白A基因重组载体的菌株。
6.去除人同源性的肺炎链球菌表面蛋白A的纯化方法，其特征是包括如下步骤(1)发酵权利要求4制备的含有人同源性的肺炎链球菌表面蛋白A基因重组载体的菌株；(2)将所述菌株发酵液7200rpm离心15分钟，收集沉淀，用pH= 8. O 20毫摩尔/升 tris重悬沉淀，勻浆细胞破碎，8000rpm离心30分钟，取上清液；(3)批次吸附将Qsepharose fast flow与步骤(2)获得的上清液混合搅拌吸附2 小时，缓冲体系为pH = 8. O的20毫摩尔/升tris ；以3_5倍所述步骤(2)获得的上清液体积的pH = 5. 4的浓度为20毫摩尔/升的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液将吸附产物洗脱，以 3-5倍样品体积的含350-450毫摩尔/升的氯化钠pH = 5. 4的浓度为20毫摩尔/升的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液洗脱，得到Elute产物；(4)将Elute产物用pH= 5. 4的20毫摩尔/升的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液超滤脱盐处理；(5)Q柱准备以3-5倍的柱体积的pH = 5. 4的20毫摩尔/升的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液平衡Q柱；(6)上样将步骤(4)得到的产物上样Q柱；(7)以3-5倍柱体积的含有50-150毫摩尔氯化钠的pH= 5. 4的20毫摩尔/升柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液wash洗脱，再用3-5倍柱体积的含有160-300毫摩尔/升氯化钠的 PH = 5. 4 20毫摩尔/升柠檬酸柠-檬酸钠缓冲液Elute洗脱；(8)将步骤(7)获得的产物以pH= 4.0 20毫摩尔/升柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液超滤脱盐处理；(9)SP柱准备以3-5倍的柱体积的pH = 4. 0 20毫摩尔/升柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液平衡SP柱；(10)上样将步骤⑶获得的产物上样SP柱；(11)以3-5倍柱体积的含有250-350毫摩尔/升氯化钠的pH= 4. 0 20毫摩尔/升柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液wash洗脱，再用3-5倍柱体积的含有450-550毫摩尔/升氯化钠的PH = 4.0 20毫摩尔/升柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液Elute洗脱；得到纯度90%以上的去除人同源性的肺炎链球菌表面蛋白。
全文摘要
本发明公开了去除人同源性的肺炎链球菌表面蛋白A、纯化方法及用途，所述去除人同源性的肺炎链球菌表面蛋白A是序列表SEQ ID No.1所示的氨基酸序列或是序列表SEQ ID No.2所示的氨基酸序列。本发明的一种去除人同源性的肺炎链球菌表面蛋白A具有不弱于野生型肺炎链球菌表面蛋白A(RX-1亚型)的抗原性和保护性，而降低了肺炎链球菌表面蛋白A(RX-1亚型)和人体心肌肌球蛋白的同源性。使其安全的应用于疫苗的开发。
文档编号C12R1/19GK102516373SQ20111045504
公开日2012年6月27日 申请日期2011年12月30日 优先权日2011年12月30日
发明者宇学峰, 朱涛, 程昆明, 邵忠琦 申请人:天津康希诺生物技术有限公司